血红蛋白变异体对HbA1c干扰的思考

一．HbA1c临床应用基石

自从DCCT（糖尿病控制与并发症试验）和UKPDS（英国前瞻性糖尿病研究）这两大临床研究确立了糖化血红蛋白（HbA1c）在糖尿病监控中的重要地位后，HbA1c在糖尿病领域的应用越来越广泛，尤其是2010年ADA（美国糖尿病学会）和2011年WHO（世界卫生组织）将其作为糖尿病诊断指标之一后。虽然，在中国目前还没有将其作为糖尿病诊断指标之一，但随着大家对HbA1c的认识以及实验室检测质量的提高，其作为诊断指标是迟早的事。

二．变异体对HbA1c的干扰

作为医疗工作者，尤其是检验人员和临床医生，对HbA1c的应用应该有很清楚的认识。但对于HbA1c的一些干扰因素，比如血红蛋白变异体，却缺乏必要的了解。而在中国，尤其是南方，血红蛋白变异体种类和携带比例不低。

众所周知，HbA1c的生成是一个相当缓慢的过程，且在人体内是没有酶的参与的。其生成量与下列因素相关，1）HbA浓度；2）葡萄糖浓度 3）HbA和葡萄糖作用时间 4）红细胞寿命。这些影响因素，或者影响这些因素的因素，都会导致HbA1c的结果不能如实评估体内血糖平均水平。其中的第2个因素，大家比较容易理解；第3个因素，也有相关文献报导，但大家理解深浅不一。至于第1和4个因素，现在也有文献1在关注，但又确实在临床造成困扰。所以，中华医学会糖尿病学分会在《中华糖尿病杂志》中发表的文章《中国2型糖尿病防治指南（2013版）》中指出：对于患有贫血和血红蛋白异常疾病的患者，HbA1c的检测结果是不可靠的，可以考虑其他指标，比如血糖、糖化血清蛋白或糖化血清白蛋白来评价血糖2。类似的表述也在《中华人民共和国卫生行业标准 WS/T461—2015，糖化血红蛋白检测》中出现。为什么会有这样的表述？如何理解？

首先，我们先来理解贫血。贫血，在临床上常见的有两类，一类是缺铁性贫血，另外一类是溶血性贫血，比如地中海贫血。而这两类贫血对HbA1c的影响是不同的，前者可导致HbA1c的结果偏高3，而后者是偏低。

而血红蛋白变异体，对糖化结果的影响，就比较复杂了。

什么是变异体？其实就是构成血红蛋白的珠蛋白的肽链即α，β或δ组成和正常的有差异。比如血红蛋白E（HbE），就是β链的第26位Glu突变为Lys，其他氨基酸序列不变。到目前为止，全球共发现有超过1239种变异体，仅仅β链变异体就有608种以上，且每天都在更新（参见网站http://globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar/query_vars3）。其中大多数的理化性质等均不明。血红蛋白变异体，在中国也有80多种4，5。探讨变异体对HbA1c干扰，可以从两个层次或角度，即检测HbA1c准确性和其临床使用，来考虑。

- 从HbA1c检测的准确性角度来考虑，这也是当今很多文献最关注的地方。大家比较关注当某一标本有变异体时，采用的方法系统报告的HbA1c结果准不准。我们知道，市面上检测HbA1c的方法，大致可分为两类，一类是分离法，另外一类是化学反应法。前者包括电泳、离子交换HPLC、毛细管电泳，代表厂家有Sebia和Bio-Rad等；而后者有免疫法，酶法和亲和层析法，代表厂家有Roche和Trinity等。分离的方法，能否抗变异体的干扰，关键要看其能否将HbA1c和变异体糖化部分分开，同时将HbA和变异体分开？如果均能，HbA1c的结果本身是准确的。记住，我这里说的是HbA1c的结果，而不是说其能否应用于临床！如果HbA1c和变异体糖化部分分不开或HbA和变异体分不开，那么HbA1c结果就会假性增高或减低。但如果采用了化学反应为基础的方法，比如亲和层析法，本身就不能区分样板中的变异体和正常的HbA，也不能区分其各自对应的糖化产物。很多此类方法学的厂家宣称有变异体时，说其对糖化结果没有影响。这种说法，其实是有很大问题，虽然有一定市场。但如果即使要这样认定，也一定要告知前提条件，那就是，变异体的糖化速率和HbA的一样、稳定性也一样、红细胞寿命也和正常人的一样，且变异体的结构变化不会导致化学反应的差异。但变异体种类有那么多，我们并没有足够证据来证明这些前提条件。例如，变异体Hb Raleigh是β链N端的第一个氨基酸Val突变为Ac-Ala，而后者是不能进行糖基化反应的6。如果用亲和法、酶法或免疫法，由于该变异体结构发生变异、糖化速率不一致，得出的HbA1c结果肯定有问题。同时，Rhea J.M等也发现血红蛋白S，C，D等能导致红细胞寿命不一1。这些均会导致HbA1c的结果不可靠或不能用来评估血糖。由于市场竞争等原因，现在很多厂家都宣称自己的方法学或系统不受变异体干扰，真实情况果真如此？在权威的http://www.ngsp.org/interf.asp的网站上，列出了市场上主流的一些品牌对抗血红蛋白S，C，D，E和F干扰能力的总结。这些结果，相对来说，比较客观。同时，关于其他种类变异体，比如更少见的变异体情况，文献报导不是很多。国际上Little RR在这方面做了很多研究，发表的文献也很多。2015年Little RR等人用8种方法学，研究了49种变异体的干扰情况，结果显示各种方法学的表现是有差异的7。该研究是Roche公司资助的，使用Trinity Ultra 2的亲和层析以及Roche的免疫法分别作为一级和二级参比系统；同时Tosoh G7/G8，Bio-Rad D10/Turbo，Diazyme酶法，Sebia Capillarys 2 FP作为研究系统。下表1是该文就44种变异体各种方法的结果汇总7，因为有5种变异体的结果Roche的和Trinity的不吻合，且没法从氨基酸替代位置来解释不一致原因，其数据被剔除。其中Sebia数据比较少的一个原因是本次研究的样本是冻存过的，有降解，而Sebia系统上会出现一些非典型图谱结果，无法满足Sebia厂家结果报告要求。判断某一系统结果和一级参比系统是否吻合的评判标准是，如该系统结果落在该系统与Trinity用正常样本建立的回归曲线99%的置信区间内，则吻合，报告可靠；否则，不吻合，报告不可靠。

表1. 不同系统对有不同种类变异体（杂合子）时可能误报糖化血红蛋白结果统计

a. Roche的和Trinity不吻合，且认为Trinity结果可靠

由此表可以看出，1）有变异体时，各种系统可能报告准确或不准确的结果。如有Hb J-Baltimore时，G8的报告，19例有17例报告出错，G7的无错报。Bio-Rad的无错报；2）综合来说，Bio-Rad的系统表现最好（基于文献7中变异体样本糖化结果不准确数量，伯乐系统最少，得出的结论），尤其是D10，44种变异体中，无结果有问题。正是由于变异体种类多，各种方法，各种型号表现不一，可能导致糖化结果准确或不准确，这样临床医生就很有必要知晓其使用的检测系统是否能检测出变异体（最好知晓是何种变异体），能否抗其干扰。

- 从HbA1c的临床使用角度来说，是因为DCCT和UKPDS这两大临床研究的结果证明了HbA1c和平均血糖关系以及与糖尿病并发症发生进展风险关系，我们才可以采用HbA1c来监控血糖水平，进行疗效评估等。然而，由于当初的研究中并没有变异体的相关临床数据，我们没法用正常人的数据来指导有变异体的患者临床诊治，尤其是当变异体可能改变红细胞寿命或结合有地中海贫血时等情况。比如有变异体或地贫时，我们就不能用6.5%作为糖尿病诊断切点。所以，出现变异体或地中海贫血时，我们就有必要限制HbA1c在糖尿病诊治中的使用，可以换用其他指标来评估血糖，诊治糖尿病。这些观点，在2015年的《Diabetes Care》杂志上发表的《2015年ADA糖尿病医学诊疗标准》8和《中华糖尿病杂志》上发表的《中国2型糖尿病防治指南（2013版）》均有体现。

 三．小结

变异体对HbA1c的干扰，其实是一个比较复杂的问题。从检测HbA1c技术本身来说，我们不能笼统地说某一方法学抗变异体干扰，而应该具体到某一种变异体以及到多高浓度不干扰HbA1c结果。不幸的是，目前全球还没有哪一种方法或系统可以做到这一点，哪怕是IFCC推荐的参考方法对此也无能为力。当然，从应用价值来考虑，也没有很大的必要去开发这样的系统。另一方面，当发现有变异体时，我们要考虑HbA1c是否能准确评估血糖。如果不清楚，可以用其他指标，如糖化血清蛋白等指标来更经济地解决这个问题。因此就没有必要过多讨论出现变异体时，糖化结果的准确性。所以，对于当地的变异体种类的了解以及各种方法学的抗干扰能力的知晓是至关重要的。要达此目的，检验和临床就应首选以分离为基础的方法系统，尤其是国际上比较认可的品牌系统，来检测糖化血红蛋白。

参考文献

1. Rhea. J. M, etal., Impact of Hemoglobin Variants on HbA1c; Interpretation: Do we assume too much? Medical Laboratory Observer.2012, 44 (6):8-14.

2.翁建平，纪立农 等（中华医学会糖尿病学分会），中国2型糖尿病防治指南（2013版）.中华糖尿病杂志，2014,6（7）：447-498.

3．Coban E. etal., Effect of Iron Deficiency Anemia on the Levels of Hemoglobin A1c in Nondiabetic Patients. Acta Haematologica. 2004,112(3):126-128.

4. 张俊武，龙桂芳主编，《血红蛋白与血红蛋白病》，南宁：广西科学技术出版社，2003，第一版：198-201.

5. 曾溢涛 主编，《人类血红蛋白》，北京：科学出版社，2002，第一版：118-120.

6. Chen D. etal., Hemoglobin Raleigh as the cause of a falsely increased hemoglobin A1C in an automated ion-exchange HPLC method. Clinical Chemistry. 1998 ,44 ( 6): 1296-1301.

7.Little RR. Etal. Effects of 49 Different Rare Hb Variants on HbA1c Measurement in Eight Methods. Journal of Diabetes Science and Technology. 2015：1-8.

8. ADA. Standards of Medical Care in Diabetes—2015.Diabetes Care. 2015;38(Suppl. 1):1-94

伯乐生命医学产品（上海）有限公司 朱小兵 供稿