载洛沙坦透明质酸（HA）胶束对减少 C3H/HeN小鼠模型晚期肝纤维化的效果

摘   要

使用药物递送纳米粒子的晚期肝纤维化疗法是一个相对来说未经探索的领域。洛沙坦这样的1型血管紧张素（AT1）受体阻断剂可以被递送到肝星形细胞（HSC），阻断其活化作用从而减少肝纤维化的进展。在我们的研究中，我们分析了利用透明质酸胶束这样的载药工具运载洛沙坦降低HSC活化的可能性。洛沙坦具有亲脂性，可以被载入到HA胶束的疏水性核心，载药率为19.5%。研究使用经受了长达20周的TAA/乙醇重量适应疗法（TAA/ethanol weight-adapted treatment）的C3H/HeN小鼠开发了晚期肝纤维化模型。研究了洛沙坦-HA胶束在小鼠纤维原细胞（NIH3T3）、人肝星形细胞（hHSC）和FL83B细胞（肝细胞系）内的细胞相容性和细胞吸收图谱。根据阿尔法平滑肌肌动蛋白（α-sma）的表达在活化的HSC细胞中研究了这些纳米粒子降低HSC活化作用的能力。研究对接受口服洛沙坦或洛沙坦-HA胶束的小鼠进行了血清酶水平（ALT/AST、CK和LDH）及肝脏内胶原沉积物的分析。在纤维化的肝脏部位观测到了HA胶束累积的现象，这表明与正常肝脏和HSC特定吸收相比洛沙坦递送水平上升。hHSC和小鼠接受洛沙坦-HA胶束治疗的肝脏部分α-sma活性下降。与口服洛沙坦的组相比接受洛沙坦-HA胶束治疗小鼠的血清酶水平和胶原沉积水平明显下降。我们的体外和体内研究证明洛沙坦-HA胶束能通过HSC靶向机制有效减少肝纤维化。可以考虑将这些纳米粒子作为肝纤维化的替代疗法。

一、介  绍

肝纤维化是一种对大量人口造成影响的疾病。肝纤维化会在毫无症状的情况下导致肝硬化。肝纤维化的主要原因是慢性肝炎病毒感染、酗酒和非酗酒脂肪肝。在美国，仅肝纤维化一项每年就能导致30000人死亡。肝纤维化进一步导致肝脏损伤进而发展为肝硬化，破坏肝脏功能单位架构，引起门静脉血压过高或肝细胞癌（HCC）等并发症。目前世界范围内一致认为与肝硬化相关的HCC是导致死亡的前十大原因之一。

众所周知，肾素血管紧张素系统（RAS）在肝纤维化的形成中发挥着重要的作用。RAS成分在肝纤维化中过表达，其中之一是在活化的肝星形细胞内和体内通过AT1受体过表达导致纤维化水平升高和炎症影响的血管紧张素II。正常的人体肝脏中，HSC不表达AT1受体，也不会分泌血管紧张素II。可以模拟涉及RAS靶向策略的疗法进行肝纤维化治疗。因此，阻断AT1受体可以减少活化的HSC累积并弱化小鼠的肝纤维化。

虽然多种多样的治疗策略已经应用于逆转肝纤维化，但是目前仍没有药物能完全满足这个目的。洛沙坦是一种作用于AT1受体的血管紧张素II受体阻断剂能与HSC特异载体耦合。目前已经发现洛沙坦可以抑制肝纤维化的进展。该复合物是临床研究中肝纤维化药物的主要候选药物。

目前洛沙坦为亲脂性形式的药物因此不能直接通过静脉注射改善其生物利用度。洛沙坦通过铂连接子（platinum linker）与甘露糖-6-磷酸盐修饰的人血清白蛋白（M6PHSA）结合，形成接受CCl4治疗的小鼠肝纤维化模型。洛沙坦-M6PHSA在短期研究内降低了肝纤维化水平。与胶束系统相比，结合连接子的洛沙坦疗法只能递送一小部分针对靶向点的药物。

HA是一种大量存在于动物细胞外基质和相关组织器官内的粘多糖，是一种具有生物相容性、可生物降解、非致免疫性、非致炎症性、无毒的线性多糖。CD44水平在肝纤维化病例中也会上升。CD44在肝损伤期间活化的HSC迁移中发挥着重要作用。CD44是HA受体-修饰的药物递送系统的适宜靶。出于这个特殊目的，我们选择了HA聚合物主链来开发胶束并通过基于CD44受体的靶向机制进行递送。

先前的研究报告了HA派生物作为多种慢性肝脏疾病的新型药物递送载体，这些疾病包括肝炎和肝硬化。在这里，研究的主要目的是评估HA胶束载入洛沙坦作为小鼠肝纤维化模型靶向疗法的效果。我们在C3H/HeN小鼠肝纤维化模型内评估了短期胶束治疗的效果。

二、材料和方法

（一）材料

韩国Bioland生产的透明质酸钠（0.48MDa）；美国Sigma Aldrich生产的5β-胆烷酸（CA）、甲酰胺和芘；韩国BioActs生产的Fluorescent probe Flamma™FCI-774（F774）和Flamma™FCR-552 （F552）。美国Sigma Aldrich生产的1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳化二亚胺（EDC）、羟基琥珀酰亚胺（NHS）和二环己基碳二亚胺（DCC）；德国Merck生产的N，N-二甲基甲酰胺；美国Promega生产的3-（4, 5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium）（MTS）。洛沙坦钾（美国Sigma Aldrich）、人血管紧张素II，美国Sigma Aldrich）；抗α-sma抗体（英国剑桥郡abcam公司）、Donkey Anti-Rabbit IgGH&L（Alexa Fluor1 488）（英国剑桥郡abcam公司）；Goat anti-rabbit IgG（HRP）（英国剑桥郡abcam公司）；DAB色原（试剂盒，丹麦安捷伦科技）；美国马纳萨斯州ATCC公司生产的FL83B细胞系以及ScienCell研究实验室（CA，美国）的hHSC；脯氨酸试剂盒（美国，华盛顿州，Chondrex公司）；美国Thermo Scientific的RPMI-1640和Dulbecco’s modified Eagle’s medium （DMEM）。所有其他的试剂是分析级试剂或色谱分析级试剂。

（二）载洛沙坦透明质酸（洛沙坦-HA）胶束的合成

我们将HA与5β-胆烷酸（CA）结合（该步骤另作叙述）。简而言之，使用5ml甲醇溶解500mg 5β-CA。接着添加1ml 37%浓度的HCl并在60℃循环加热6小时。之后将该混合物冷却到0℃获得白色沉淀，并使用膜过滤器（滤孔大小：0.45um，Millipore）滤出。将滤出物真空干燥，并使用5ml乙烯二胺（EDA）溶解，之后在130℃循环加热6小时。将该混合物冷却至室温获取胺乙基5β-cholanomide（EtCA）白色沉淀物。接着，通过彻夜搅拌将120mg HA（0.48MDa）溶解于70ml甲酰胺内，接下来添加48.5mg EDC（N-（3-Dimethylaminopropyl）-N’-ethylcarbo-diimide hydrochloride）并搅拌1小时，之后添加29.1mg NHS。随后，将0.26mg EtCA溶解于28ml二甲基甲酰胺内，并将之逐滴地添加到HA溶液内搅拌一天的时间。使用MWCO=3500的纤维素酯透析膜包（Spectrum lab，CA，USA）透析2天将生成物从水/甲醇混合物中透析出来，去除未反应的化学品，并在随后的2天内再将生成物单独从水中透析出来。为了获得粉末形式的胶束，样品必须使用液氮冷却并在0.01mBar的压力下冷却至-81℃5天（LabconcoFreeZone，Kansas，USA）。

为了制备洛沙坦-HA胶束，开始时我们利用水包油乳胶技术将10mg HA胶束溶于蒸馏水内。将1mg或3mg洛沙坦溶于100ul 100%乙醇内，随后将之逐滴地添加到水里的HA胶束内并搅拌24小时。接着，以5000rpm的速度离心洛沙坦-HA胶束溶液10分钟。去掉上清液，将得到的小球溶解于乙腈（200ul）并使用声处理探针以2:3的脉冲率处理10分钟破坏胶束结构。使用乙腈流动相（20:80，v/v）通过HPLC分析游离溶解在乙腈内的洛沙坦。包封率计算为包含在胶束内洛沙坦数量与添加到溶液内总洛沙坦数量的比率，并根据特定胶束量内总洛沙坦量测定药物加载能力。

（三）洛沙坦胶束的特征

将冻干的HA胶束进行H-NMR分析，研究HA与ETCA的结合水平。为了描述胶束的形态，以10:3（HA胶束：SPION）的比率载入疏水性油酸包被的超顺磁氧化铁纳米粒子（SPION）到HA胶束内，接着通过透射电子显微镜（TEM）进行目测。使用日本生产的Hitachi S3000H获取扫描电子显微镜成像。使用DKS方法分析HA胶束和洛沙坦-HA胶束的大小。在Zetasizer仪器（Nano-Z590，Malvern Instruments，英国伍斯特郡）上分析这些微粒的载荷。

（四）HA胶束与荧光染料的结合

使用DC/NHS化学方法将HA胶束与Flamma™-552和Flamma-774™染料（BioActs公司，韩国仁川）相结合，评估其标定人肝星形细胞（hHSC）的效果和HA胶束的生物分布。游离的HA羧酸团在DCC和NHS的作用下与胺活化荧光探针反应。简而言之，HA胶束在DMSO中被溶解，以固定的摩尔比率1:100（HA胶束：探针）添加Flamma™-552 （Λabs-551nm，Λem-570nm）和 Flamma™-774（Λabs-778nm，Λem-808nm）。之后，在溶液中添加现有探针5-10倍摩尔比率的DCC/NHS。避光搅拌该反应混合物1天并使用MWCO=3500的的膜透析去除DMSO和未反应的材料。使用多态微孔板阅读器（TECAN，Infinite M200 PRO，Männedorf，瑞士）通过吸光度方法分析冻干样品的结合效率。

（五）使用Flamma™-552标记的HA胶束细胞吸收研究

在8孔隔室玻片（美国纽约，Lab-Tek2）上以5×104的密度培植正常肝细胞（FL83B）和hHSC，并用CO2培养箱在37℃的潮湿环境中培养1天。分别对hHSC和FL83B细胞使用包含10vol% 和FBS 1vol%青霉素-链霉亲合素-两性霉素B（美国Gibco Anti-Anti（100X）的星形细胞培养基和F-12K培养基。在彻夜培养后，添加75ug/ml浓度的Flamma™-552染料标记HA胶束到每个微孔中。经过这些处理后，继续培养细胞2小时。在培养过程之后，使用PBS清洗并使用4%的甲醛溶液凝固这些细胞。使用配备氦氖（543nm）和二极管激光的共聚焦显微镜（德国上科亨，蔡司LSM510）放大40倍观察这些细胞的荧光。

（六）细胞活性研究

执行MTS试验评估洛沙坦-HA胶束治疗的hHSC和FL83B细胞的细胞活性。该细胞以104个细胞/孔的密度在96孔微孔板内培植。这些细胞在CO2培养箱内37℃的潮湿环境中培养1天。一式三份添加洛沙坦HA胶束到这些细胞内，分析超过0.001ug/ml-1000ug/ml浓度范围的细胞毒性。添加5ug/ml的Triton作为阳性质控品。处理后培养这些细胞24小时。接着添加20ul MTS试剂到每个经过处理的微孔中并继续培养4小时。最后使用微孔板阅读器测量490nm波长的吸光度。

（七）免疫细胞化学分析

我们将实验样品分为4组：对照组、血管紧张素组、血管紧张素+洛沙坦组合、血管紧张素+洛沙坦-HA胶束组。血管紧张素II能活化hHSC并诱导hHSC内的α-sma过表达。在8孔隔室玻片（美国纽约，Lab-Tek2）上以5×104的密度培植和hHSC，并在CO2培养箱内37℃的潮湿环境中培养1天。添加包含10vol%FBS和1vol%%青霉素-链霉亲合素-两性霉素B（美国Gibco Anti-Anti（100X）的星形细胞培养基进行细胞培养。在对照组中，仅添加hHSC；在血管紧张素组中，添加血管紧张素II刺激hHSC细胞。在血管紧张素+洛沙坦组合血管紧张素+洛沙坦-HA胶束组中，分别在加入血管紧张素II的24小时以前，添加浓度为1000nM的游离洛沙坦和洛沙坦-HA胶束（在PBS内，pH7.4），并额外培养2小时。使用抗-α-sma（第一）和驴抗兔IgG（第二）评估α-sma表达。

（八）动物实验程序

使用韩国Jungang Lab Animal，Inc.生产的C3H/HeN小鼠（5-6周大，20-25g重）。全罗南道国立大学医学院动物保健和应用研究委员会批准了该实验方案（CNUHH2014-148）。通过在腹膜内（IP）每周三次注射溶解于PBS内的硫代乙酰胺（TAA）和10%甲醇水溶液的方式诱导C3H/HeN小鼠（n=40）产生晚期肝纤维化。同时，以腹膜内注射PBS（pH7.4）的C3H/HeN小鼠（n=3）作为对照。根据估计的小鼠体重的不同，TAA浓度从开始的100mg/kg以10mg为单位逐渐递增。混合TAA和甲醇的组继续维持原有注射量额外20周的时间。

20周以后，小鼠被分为每组12只的3组，分组情况如下：HA胶束组、洛沙坦组和洛沙坦-HA胶束组。这里，HA胶束组可以作为该实验的对照组。洛沙坦-HA胶束组接受5次注射，每次静脉内注射（300ug/kg洛沙坦，6.3mg/kg洛沙坦-HA胶束）之间间隔3天，无洛沙坦载入的HA胶束对照组采用类似方案。在洛沙坦组内，以相同的时间和频率（300ug/kg）自由填喂洛沙坦。

（九）Flamma™-774标记的HA胶束的生物分布

将Flamma™-774标记的HA胶束以5mg/kg的浓度注射到纤维化（n=3）和正常小鼠（n=3）。为了进行体外器官生物分布研究，以2天为间隔宰杀小鼠，取得其器官。使用配备吲哚菁绿激励和发射过滤器的IVIS Lumina（美国多伦多Xenogen公司）成像系统，在1秒曝光时间的条件下分析组织生物学分布。

（十）生化分析和羟脯氨酸试验

使用自由填喂洛沙坦、接受HA胶束或洛沙坦-HA胶束治疗被诱发患有纤维化的C3H/HeN小鼠并在治疗结束后将其宰杀。接着通过心脏穿刺法取得800ul-1ml血液（n=12）。立即将血液储存在4℃环境中辅助凝结过程。凝结过程之后，以2500rpm的速度离心该血液10分钟，将血浆从凝结的血液中隔离出来。使用Hitachi7600自动分析仪（HITACHI，HitachiKoki Co., Ltd，日本东京）对血液血浆进行ALT、AST、CK和LDH水平分析。

使用洛沙坦-HA胶束和PBS治疗的肝脏，通过羟脯氨酸估计的酸水解过程对羟脯氨酸水平进行分析。简而言之，对从小鼠体内取得的肝脏进行称重，在玻璃螺纹小瓶内（该小瓶具有聚四氟乙烯盖）使用100ul蒸馏水和100ul 10N HCL将10mg肝脏水解24小时。冷却后，以10000rpm的速度离心水解的样品3分钟将黑色残渣与清澈上清液分离开来。添加10ul上清液、100ul 1XDMAB，培养30分钟。最后在530nm使用微孔板阅读器计算光密度。

（十一）组织病理学研究

从接受自由填喂洛沙坦、接受HA胶束和洛沙坦-HA胶束治疗的小鼠体内获得肝脏，使用0.9%NaCl溶液和10%的福尔马林溶液（n=4）清洗用于组织病理学研究检查肝脏组织样品。经过标准组织处理程序后，将该组织嵌入石蜡内。制备成6um厚的切片并使用苏木精-伊红（HE）和三色胶原染色。一名病理学家根据METAVIR评分系统对纤维化水平进行评估。使用嵌入石蜡的肝脏切片进行免疫组织荧光研究评估α-sma表达。简而言之，宰杀使用自由填喂洛沙坦、接受HA胶束和洛沙坦HA胶束治疗的小鼠，取得肝脏并置于4%的PFA内。在对嵌入石蜡内的肝脏进行切片后，使用抗-α-sma和驴抗兔IgG进行免疫组织荧光研究。出于免疫组织化学sma研究的目的，山羊抗兔IgG（HRP）作为DAB染色的第二抗体使用。按照生产方案执行所有的实验。

（十二）统计分析

结果以平均值或平均值±标准差的平均值±标准误差来表示。使用Graph-Pad QuickCalcs软件，通过学生未配对t检验和费舍尔精确几率检定建立统计分析。如果P<0.05,则表示差异显著。

三、结   果

（一）洛沙坦-HA胶束的合成

使用油乳剂方法按照HA胶束比洛沙坦10:1和10:3的比率合成洛沙坦-HA胶束。但是，HPLC分析揭示尽管包封率为83%，与10:1的比率比较，10:3的比率具有更好的载药率（表1）。因此，我们使用10:3的比率进行进一步的研究。DLS测量揭示了洛沙坦-HA胶束的大小为300nm，这经过了SEM的确认。洛沙坦HA胶束的Zeta潜能为-40nm，这表明其胶束结构具有良好的稳定性和和水溶性（图1）。

（二）细胞吸收研究

我们比较了FL83B细胞系和hHSC细胞系内Flamma™552标记HA胶束的细胞吸收效率。FL83B细胞系代表正常肝细胞，hHSC细胞系具有血管紧张素1受体-洛沙坦受体主要的靶。共聚焦造影揭示与FL83B相比，hHSC的HA-胶束吸收率较高（图2），Flamma™552染料修饰的荧光强度较强。

表1. 载洛沙坦-HA胶束的理化性质。数据用平均值（mean）±标准差（SD）显示。

图1. HA胶束和洛沙坦-HA胶束的理化性质。A.pH7.4的PBS内洛沙坦-HA胶束和HA胶束的Zeta潜能表面负载测量和DLS大小测量。取100ug/ml浓度的HA胶束和洛沙坦-HA胶束，在室温下水浴处理（Power Sonic410，Hwashin，韩国）5分钟并测量；B.SPION载HA胶束的TEM图像和洛沙坦-HA胶束SEM图像。根据SEM和DLS结果，洛沙坦-HA胶束的大小估计为300nm，但是，粒子的形态学通过TEM和SEM图像确认。

图2. 共聚焦显微镜下Flamma™552染料标记HA胶束的细胞吸收研究。A.70ug/ml Flamma™552标记的HA胶束培养的FL83B细胞的代表性图片。Flamma™552标记的HA胶束培养的FL83B细胞累积是最少的；B.70ug/ml Flamma™552标记的HA胶束培养的hHSC细胞的代表性图片。在HSC内可明显看到Flamma™552标记的HA胶束，因为其荧光强度大于FL83B细胞。所有实验培养时间为2小时。蓝色代表细胞核内DAPI染色的吸收。

（三）细胞活性研究

在洛沙坦-HA胶束内评估胶束的毒性。在hHSC和FL83B内进行治疗时，这二者内分别达到1000ug/ml和100ug/ml的浓度时仍显示为无毒（图3）。即使浓度更高，洛沙坦-HA胶束也不引起HSC和FL83B细胞系内的细胞死亡。

图3. HA胶束和洛沙坦-HA胶束的体外细胞相容性（pH7.4的PBS内）。A.hHSC；B.FL83B细胞系。HA胶束和洛沙坦-HA胶束的MTS试验，即使在浓度较高时（100和1000ug/ml），毒性也很小。MTS试验数据显示一式四份样品的平均细胞活性±SD。相对于FL83B细胞系对照组，100ug/ml的洛沙坦-HA胶束显示出显著较高的细胞活性（p<0.01）。与hHSC和FL83B细胞系（P>0.05）对照组，全部其他治疗不能显示显著的细胞活性变化。

（四）免疫细胞化学评估

第二抗体的绿色荧光表示α-sma在对照组内显示出最低的表达。但是血管紧张素I的组显示出强烈的、表明hHSC的活化的绿色荧光。洛沙坦和洛沙坦-HA胶束组在添加血管紧张素24小时以前显示荧光强度显著下降。尤其是洛沙坦-HA胶束组由于在细胞培养基内具有较好的溶解度和较好的洛沙坦-HA胶束细胞吸收效率，没有发出荧光（图4）。

图4. hHSC细胞内α-sma表达的共聚焦显微镜成像。HA胶束组内，在使用1000nM血管紧张素2进行2小时培养之前，使用HA胶束培养hHSC细胞24小时。当细胞通过血管紧张素1受体机制吸收血管紧张素2时，α-sma表达表示HSC活化。洛沙坦组内，在使用1000nM血管紧张素2进行2小时培养之前，使用，使用1000nM洛沙坦培养hHSC24小时。洛沙坦阻断血管紧张素1受体，紫霄花α-sma表达。洛沙坦-HA胶束组内，在使用1000nM血管紧张素2进行2小时培养之前，使用1000nM洛沙坦-HA胶束培养hHSC细胞24小时。洛沙坦-HA胶束有助于更有效地抑制α-sma的表达。蓝色表示DAPI染色（HA micelle：HA胶束；losartan：洛沙坦；losartan-HA micelle：洛沙坦-HA胶束）。

（五）Flamma™-774标记HA的生物分布

我们分析了Flamma™-774标记HA胶束在纤维化和正常小鼠肝脏（n=3）内的生物分布。在两组中注射5mg/kg HA胶束后，在统计上体外成像显示纤维化肝脏的荧光强度显著高于正常肝脏（P<0.05）。与正常肝脏相比，纤维化肝脏由于肝脏的纤维化状态可能使清除Flamma™-774标记的HA胶束的速度更慢（图5）。

图5. 肝脏内Flamma™774标记的HA胶束体外图示。A.PBS处理的正常小鼠显示Flamma™774标记的HA胶束累积（顶部）。TAA/甲醇处理的患有纤维化的小鼠显示HSC内CD44受体介导吸收的Flamma™774标记HA胶束累积增加（底部）。B.采用兴趣区（ROI）方法量化的荧光强度。数据显示为mean±SEM，相对于肝脏ROI，P<0.05。

（六）生化评估和肝脏胶原蛋白含量

利用被诱导发生肝纤维化的C3J/HeN小鼠心脏内取得的血液血清执行的洛沙坦-HA胶束生化分析揭示与其他组相比，ALT、AST、SC和LDH的水平显著下降（P≤.05）。HA胶束组显示出高ALT、AST、CK和LDH值，这是连续20周注射TAA/甲醇和治疗不充分的缘故。自由填喂洛沙坦治疗的组与HA胶束组相比血清值较低，自由填喂形式的洛沙坦的组显示出轻度反应。洛沙坦-HA胶束组显示出更好的血清值反应（表2），表明药物有效载荷成功递送至靶点，与自由填喂洛沙坦组或HA胶束组相比（图6）血管紧张素受体阻断效果更好。所有组的AST/ALT比率大于2:1，表明试验对肝损伤的特异性和灵敏度高。尽管洛沙坦-HA胶束组的AST/ALT比率低于HA胶束组和洛沙坦组，但仍显示对洛沙坦-HA胶束具有良好的治疗响应（表3）。

表2. AST、SLT、CK和LDH的血液生化评估。数据显示为mean±SEM，相对于HA胶束组合洛沙坦组，数据分别具有统计显著性，P值小于0.05。

表3. HA胶束组、洛沙坦组和洛沙坦-HA胶束组的AST/AlT比率

图6. 20周TAA/甲醇处理纤维化诱导后，HA胶束组、洛沙坦组和洛沙坦-HA胶束组的AST、ALT、CK和LDH的血液生化评估。洛沙坦-HA胶束组与HA胶束组合洛沙坦组相比，AST/ALT、CK和LDH值在统计上显著较低，这表明由于成功地即将洛沙坦递送到肝脏内的肝星形细胞处，取得了较好的治疗效果。数据显示为mean±SEM。相对于HA胶束组合洛沙坦组，P值分别为P<0.05和P<0.5（HA micelle：HA胶束；losartan：洛沙坦；losartan-HA micelle：洛沙坦-HA胶束）。

肝脏内羟脯氨酸的水平可以对构成细胞外基质的胶原蛋白进行直接评估。肝脏内纤维化进展细胞外基质（ECM）含量升高可以被羟脯氨酸试验量化。与HA胶束组相比，洛沙坦-HA胶束组显示羟脯氨酸水平显著下降。该结果表明洛沙坦-HA胶束可以阻断HSC血管紧张素1受体并阻止其从释放的ECM成分中活化。

（七）组织病理学研究

为了研究纤维化肝脏中洛沙坦-HA胶束的效果，我们对α-sma活化进行了定性分析。HA胶束组和洛沙坦组免疫荧光的强烈绿色荧光表示HSC活化。但是洛沙坦-HA组没有α-sma表达（图7）。在肝脏切片内使用免疫组织化学染色完成了对α-sma活化的定量评估。洛沙坦组的α-sma表达低于HA胶束组。因此，洛沙坦-HA胶束组的α-sma表达估计低于HA胶束组和洛沙坦组（P<.001），这证明与其他组相比（图8）洛沙坦-HA胶束将洛沙坦递送到HSC细胞的能力较强。

图7.肝脏切片内α-sma表达的共聚焦显微镜成像。HA胶束组内，接受HA胶束注射的小鼠随着肝脏活化的HSC增殖，纤维化进展表达α-sma增多，显示出高α-sma表达（以绿色荧光表示）。洛沙坦组内，接受洛沙坦注射的小鼠与HA胶束组的小鼠相比，揭示出相似的表达图示，口服洛沙坦没有到达靶区（活化的HSC）。洛沙坦-HA胶束组内，接受洛沙坦-HA胶束治疗的小鼠几乎没有α-sma表达，这表明成功地将洛沙坦包封的洛沙坦-HA胶束递送到了靶区。蓝色表示DAPI染色（HA micelle：HA胶束；losartan：洛沙坦；losartan-HA micelle：洛沙坦-HA胶束）。

图8. 肝脏切片内α-sma表达的免疫组织化学分析。A.肝脏内平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色的代表性图片。B.洛沙坦-HA胶束组的α-sma表达显著低于HA胶束组合洛沙坦组。使用Image J（NIH image program, version 1.49）软件的IHC分析器插件，按照阳性区域平均百分比，测量平滑肌肌动蛋白免疫阳性区域占比。数据表示为mean±SD。相对于HA胶束组合洛沙坦组，P值分别为P<0.001和P<0.001。

HA胶束和接受氯沙坦治疗的组揭示了表明晚期肝纤维化桥连。洛沙坦-HA胶束组显示出中间有间隔的纤维化，但没有桥连的纤维化。这个结果证明洛沙坦-HA胶束治疗显著弱化了C3H/HeN小鼠的肝纤维化。

四、讨   论

在我们的研究中，我们开发了HSC靶向载洛沙坦HA胶束系统来防止纤维化发生进展。HA两亲性结合物可以在有水的条件下形成疏水性药物载体。HA胶束可以搭载洛沙坦这样的疏水性药物并将其递送到肝脏，且不会影响有效负载。最近，已经对基于纳米粒子，用于肝纤维化治疗的系统进行了评估。一种与姜黄素类似的植物多酚被改良到聚合的纳米粒子内改善药物的溶解度，增强药物生物利用度。该构想已经被证明对肝脏抗氧化剂水平上升、CCl4诱导的肝纤维化有效。另一种处于实验阶段的抗纤维化药物水飞蓟素被包被在纳米金粒子外，正在被检验用于对抗小鼠CCl4诱导的肝纤维化，该方法的副作用最低。与先前的研究相比，我们的工作是唯一使用基于HA、以活化HSC为靶的洛沙坦递送纳米胶束系统的研究。

我们的细胞吸收研究证明与FL83B细胞相比，hHSC细胞会优先吸收Flamma™552标记的HA胶束。在另一个独立研究中也报告了类似的结果，该研究观测到与FL83B细胞系相比，HSC细胞的透明质酸（HA）-QDot结合物累积水平较高。我们的结果证明与FL83B细胞系相比，hHSC的吸收率较高，这表明在肝脏间隙空间内有大量有助于载洛沙坦HA胶束有效累积的HA受体（CD44或RHAMM），而这正是HSC所处的位置。

即使在浓度较高的情况下，洛沙坦-HA胶束也不会明显地引起HSC和FL83B细胞的死亡。尽管洛沙坦HA胶束靶向法能确保避开体内的一般肝实质，但是正常细胞仍然存在洛沙坦暴露的可能性。在抗纤维化治疗期间，胶束具有的无毒性特征在避免HSC细胞和肝细胞凋亡方面发挥着重要作用。HA是一种大量而广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织内的粘多糖。作为可注射材料，该聚合物被临床应用与治疗骨关节炎以及制作伤口愈合的生物支架。在临床试验中可以利用基于HA的胶束系统治疗肝纤维化。

我们使用通过诱导方法产生纤维化C3H/HeN小鼠开发了晚期肝纤维化模型，该方法具体通过同时注射TAA和填喂甲醇来操作。与单独TAA注射相比，该方法成功地提高了肝纤维化诱导率，但死亡率也从18%飙升至40%。由于死亡率飙升，我们对纤维化诱导方法进行了调整，根据动物的体重变化调整TAA的注射剂量。之前已经在大鼠身上进行过纤维化体重调整模型的研究，死亡率为0%。研究中的TAA诱导纤维化模型是研究酒精诱导肝纤维化的最佳模型。研究得到的实验结果轻而易举地就与人体试剂纤维化回归研究的结果产生了相关性。

我们的研究证明通过对纤维化肝脏和hHSC细胞进行抗-α-sma抗体免疫染色，接受洛沙坦-HA胶束治疗组的平滑肌肌动蛋白水平显著下降，这表明HSC的活化作用明显衰退。通过免疫组织化学对α-sma的百分比进行了量化，洛沙坦-HA胶束组也显示出α-sma阳性细胞累积水平显著降低。先前已经广泛研究了血管紧张素II对HSC AT受体的影响，并发现其在研究抗纤维化响应方面可以作为一个良好的体外实验指标。洛沙坦组也显示出轻微的α-sma抑制，这可能是由于将洛沙坦钾直接添加到培养基中的缘故，而在体内，药物必须通过胃肠载体才能抵达肝脏。通过洛沙坦-HA胶束系统可以更加有效地实现HSC失活。

Flamma™774标记的HA胶束证明与正常肝脏相比，其能在纤维化肝脏中实现更有效的累积，在生物分布研究中，与正常的肝脏相比，纤维化肝脏中Flamma™-774标记HA胶束的清除速度更慢。这个结果表明与FL83B细胞系相比，活化的hHSC内的CD44受体过表达更容易介导HA胶束的内吞作用。洛沙坦-HA胶束的吸收可以被靶向到hHSC，因此能增加靶点的药物递送量。基于CD44的介导受体吸收和HA胶束的累积容易在纤维化率较高的肝脏中发生，因为那里存在10-20倍以上的HSC增殖。

血液血清分析能直接或间接地对肝脏胶原蛋白水平进行酶生化评估。血液血清分析还能揭示洛沙坦-HA胶束组与其他组相比，ALT、AST、CK和LDH的下降水平更显著。这个结果与由于HSC血管紧张素1受体阻断改善了导致纤维化进展活化的肝脏条件有关。该肝脏组织学结果表明洛沙坦-HA胶束组纤维化桥连减少、大细胞核被清除。

注射洛沙坦-HA胶束可以通过改变灌注和活性氧生成，影响肝脏纤维化进展。此外，应该在整个有机体内考虑所有可能被灌注的药剂的影响。但是我们在洛沙坦-HA胶束注射后并没有执行灌注和血流动力学研究。这一点是我们的研究的局限性。我们认为需要执行进一步的研究评估载洛沙坦纳米粒子注射后的灌注和血流动力学变化。

五、结   论

在体内和体外研究中，证明洛沙坦-HA胶束能通过HSC靶向机制显著减少肝纤维化。洛沙坦-HA胶束是避免或控制肝纤维化向肝损伤和肝硬化或HCC发展的抗纤维化疗法富有吸引力的候选药物。这些纳米粒子还可作为治疗诊断试剂，与光学对比试剂相结合，监视HA胶束在肝脏内的累积。

（摘自PLOS ONE，版权归其所有，仅供参考学习使用）

编译：《临床实验室》张凯

审校：《临床实验室》王小茜