自分泌VEGFR1和VEGFR2信号延长体外 和体内人体恶性胶质瘤模型存活期

恶性胶质瘤——最常见的内部脑瘤，被认为源于神经胶质祖细胞。恶性胶质瘤细胞是血管生成因子的丰富来源，以及显著的VEGF和PIGF的丰富来源。人们已经在考虑将内皮细胞作为促进肿瘤血管生成的恶性胶质瘤衍生粗血管生成信使的主要标靶。相反自分泌或旁分泌效果定义为肿瘤群落间的相互作用，在恶性胶质瘤领域尚未得到人们的重视。

哺乳动物的VEGF信号是一种涉及多种受体分子的复杂过程。VEGFR1（FLT1）酪氨酸激酶受体（TKR）介导多种VEGFA、B和PIGF的生物学影响。与VEGFR1结合的VEGF或PIGF诱导ERK1/2以及p38 MAPK的活化和磷酸酶化作用。不仅如此，PIGF可能会刺激特殊酪氨酸残基的转磷酸作用。特别是胶质瘤细胞的VEGF和PIGF表达可能会诱导肿瘤组织内VEGFR1骨髓衍生髓系细胞的积聚。

尽管VEEGFR2（KDR，FLK1）被认为是生理学和病理学血管生成中VEGFA、C和D生物活性的主要传递者，但是VEGF2上的不同酪氨酸残基的VEGF诱导磷酸化作用机制以及特殊生物反应的建立仍然不完全为人所知。此外，VEGFR异源二聚化和具有共同受体如神经素（NRP）、硫酸类肝素多糖蛋白或avb3整合物的VEGFR的相互作用使VEGF和PIGF类二聚体或异二聚体信号通路更加复杂。最终，结合到VEGF3（FLT4）TKR的VEGFC/D需要淋巴管生成并可能通过调节VEGFR2介导信号在肿瘤血管生成中发挥促进作用。

尽管VEGF受体、NRP、整合素及其配体在一些肿瘤细胞类型中表达，但是源于这些收益特别是恶性胶质瘤中受体的明显生物学反应原理尚不清楚。被VEGFR2信号调节的自分泌VEGF效果被认为促进了恶性胶质瘤细胞的侵袭、生存和肿瘤增殖。反之，结合到VEGFR2的VEGF也被报告有通过向VEGFR2/MET杂合物补充磷酸酶蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制独立肝细胞生长因子c-MET活性来抑制肿瘤侵袭的作用。

这些自分泌VEGFR信号互相冲突的数据使我们建议对胶质瘤内VEGFR通路刺激或抑制的反应是多样化的，其他环境中可能依靠VEGF家族配体和受体的差异表达。实际上，我们报告体内人体胶质瘤模型的VEGFR1或VEGFR2信号可能显示出明显的存活期延长，对肿瘤内VEGFR信号的彻底描述有可能使患者受益并在未来探索VEGF（R）抑制的临床试验中取得更大成功。

体外研究

非沉默对照（#RHS4348）和包括一个单一VEGFA（TCTGTATCGATCGTTCTGT）或大肠杆菌细菌库内提供的VEGFR1发夹导肽（TGAACCTGAACTAGATCCT）的沉默微小RNA接合shRNA（shRNAmir）PGIPZ慢病毒载体（#RHS4531-V3LHS_403557; #RHS4531-V3LHS_302174）均向Thermo Scientific Open Biosystems采购。使用pGIPZshRNAmir慢病毒载体、pCMV-dr8.91二代包装和pMD2.G包膜质粒在HEK293T细胞内生产慢病毒传染性微粒。为了获得稳定 的基因沉默VEGFR2细胞，使用VEGFR2沉默、包含3个特殊靶构造：ACTGTGGTGATTCCATGTCTT CAAGAGAGACATGGAATCACCACAGTTTTTT；ACTTGTAAACCGAGA CCTATTCAAGAGATAGGTCTCGGTTTACAAGTTTTTT和CACCTGTTT GCAAGAACTTTTCAAGAGAAAGTTCTTGCAAACAGGTGTTTTT的shRNA慢病毒微粒（# sc-29318-V, Santa Cruz Biotechnology）转换胶质瘤细胞。同源性分析显示VEGFR1导肽（TGAA CCTGAACTAGATCCT）可能会导向HRNR（角蛋白）基因（期望值（E）11）；因此，我们执行定量PCR分析排除VEGFR1沉默的细胞内的这一可能性（数据未显示）。

非沉默shRNA病毒被用作阴性质控品（#sc-108080）。在所有情况下，使用4mg/mL嘌呤梅毒选择稳定转换的无性繁殖系个体，在1到2个传代选择后用用于分析和试验。3个特殊导向PIGF siRNA和对照siRNA均购自Santa Cruz，并使用TransIT-X2动态运输系统转染（Mirus Bio LLC）。

使用球状体侵袭试验测量胶质瘤细胞的侵袭性潜能。通过在涂有1% nobel琼脂/PBS培养底物的96孔微孔板上的100mL培养基内种植 1-5x103细胞取得胶质瘤球状体。培养2-3天后，将平均直径200um的球状体转移到涂有胶原I的矩阵的微孔内，使用达尔伯克氏改伊格尔细胞培养基完全覆盖。3天内每隔24小时，在减去最初的球状物像素区域后，测定被球状物萌发的细胞覆盖的像素区域。使用Image J软件（NIH）测定侵入区域。

使用Crl：CD1-Foxn1nu免疫缺陷裸鼠（Charles River）检验抗血管生成疗法或VEGFR损耗疗法对肿瘤增殖产生的效果以及患有胶质瘤小鼠的存活期。小鼠接受75000LNT-229工艺100000 LN-308或U87MG细胞异种移植。细胞被定向植入6-12周龄小鼠的右纹状体。每天根据苏黎世兽医办公室指南评估神经学症状，等级0：无可见损伤；等级1：活性减退；轻微平衡和协调性损伤；等级2：活动减退，体重与峰值相比减少15%，左腿轻微麻痹，中度疼痛迹象。使用7只动物评估存活期，定义为症状出现节点（等级2）。数据以随着时间推移存活小鼠的数量呈现。动物出现症状时，每组对3只随机动物实施安乐死进行组织学研究。

必须持有在苏黎世兽医办公室以及联邦食品安全兽医办公室有效许可证的前提下执行动物实验。在小鼠腹腔内注射芬太尼（Sitetica SA）/咪达唑仑（Roche Pharma）美托咪啶（Orion Pharma混合物）并联合使用卡洛芬止痛（Pfizer AG）麻醉小鼠。

胶质瘤细胞系显示出VEGFR1和VEGFR2基本和诱导磷酸化的不同水平。

为了选择合适的模型，我们首先筛查了胶质瘤细胞系的VEGF和PIGF及其mRNA受体及蛋白质水平的表达。与长期细胞系（LTC）相比，胶质瘤起源细胞系（GIC）PIGF mRNA的表达水平较低，但是关于VEGF释放的缺氧反应更明显。大部分细胞系显示出VEGFR1蛋白位于细胞表面，但是用流式细胞术并未在细胞表面检测出VEGFR2。但是，免疫印迹法（图1A和B）以及细胞内流式细胞术显示出2种受体在细胞内的表达均非常显著。免疫印迹法显示U87MG、LN-308和T-325（图1B）的VEGFR2蛋白水平最高。总蛋白水平与主要酪氨酸位点的磷酸化没有相关性，使用捕获ELISA方法测量了VEGFR1Tyr1213或VEGFR2Tyr1059（图1A和B）或p-VEGFR1或p-VEGFR2总水平（图1C和D），显示多种配体引起的交互机制的多效性。

接着我们研究了VEGFR1和VEGFR2（总p-VEGFR）的基准磷酸化状态，在被VEGF重组体刺激后，p-VEGFR1仅在LN-308内被VEGF诱导，p-VEGFR2仅在人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）内被诱导（图1C和D）。该ELISA的特殊性受到具有VEGF的HUVEC刺激支持并在LN-308内因西地尼布而下降。图1A-1D不完全的相关性很可能是单一磷酸化VEGFR残基和全部磷酸化VERFR残基比较的结果。

基于VEGFR1和VEGFR2磷酸化在具有~0.3uM IC50值的ZH-161细胞（图1E）内对pan-VEGFR抑制剂西地尼布敏感，这表明自分泌活化。对西地尼布敏感确认了免疫印迹法检测的2个主带的特异性。p-VEGFR2对西地尼布的敏感性比p-VEGFR1弱。

图1. 胶质瘤细胞内自分泌和诱导VEGFR活化。（A，B）通过免疫印迹法使用肌动蛋白作为负载控制评估了总VEGFR1和VEGFR2以及VEGFR1Tyr1213或VEGFR2Tyr1059的水平。（C，D）使用ELISA测定了基本和VEGF诱导的总磷酸化水平（p<.05）。（E）使用免疫印迹法检测了ZH-161内VEGFR1和VEGFR2磷酸化对西地尼布浓度升高的反应（2小时）。（F）使用免疫印迹法在LNT-229细胞内评估了VEGF或PIGF刺激、中和抗-VEGF（B20）、抗PIGF抗体（TB403）对VEGFR1Tyr1213的效果；单独使用VEGF（500ng/ml）或PIGF（1+2）（200ng/ml）或联合中和VEGF或PIGF抗体（100mg/mL）培养细胞15分钟。（G）分别使用免疫印迹法评估了慢性病毒介导VEGFA shRNAmir（左）或PIGF siRNA（右）对U87MG或LNT-229细胞内基本p-VEGFRTyr1213的影响。

为了区分Tyr1213 VEGFR1的基本和诱导磷酸化，没有刺激LNT-229细胞，或在血清饥饿12小时并清洗后将其暴露于配体15分钟。在无血清的条件下使用VEGF（B20）或PIGF（TB403）中和抗体在被VEGF或PIGF刺激之前预先培养该细胞2小时。在LNT-229内，外生VEGF和PIGF刺激VEGFRTyr1213磷酸化。B20或TB403仅使用外生VEGF或PIGF诱导p-VEGFR1Tyr1213干预（图1F）。相反，基本p-VEGFR1Tyr1213分别在U87MG或LNT-229细胞内对PIGF或VEGFR基因沉默响应后下降（图1G），确认了其自分泌活动。

意料之内，我们证明VEGFR1或VEGFR2 mRNA表达水平与较高的肿瘤分级和交叉的预后有关。

使用免疫印迹法分析了未处理的或配体刺激对照物或VEGFR耗尽的细胞来深入了解VEGFR基因沉默引起的分子变化。为了测试VEGF信号，我们使用VEGF112重组体（Ala207-Arg318）。p44/42和LNT-229内p38 MAPK的VEGF和PIGF诱导了磷酸化（图2A）。相反，p-AKT水平很大程度上未受影响。与2个模型内的对照细胞相比VEGFR1基因成膜独自导致了p44/42（ERK1/0）磷酸化的增强，这种刺激不会被外生VEGF或PIGF引起。磷酸-p38 MAPK水平在VEGFR1耗尽的LN-308内上升。VEGFR1基因沉默减弱了p38 MAPK对不同范围的VEGF或PIGF诱导刺激，增强了VEGF和PIGF对p38 MAPK产生VEGFR1独立信号的可能性。VEEGFR2基因沉默提高了ZH-161内p-VEGFR2Tyr1175的水平、LN-308内p-AKTThr308的水平、LN-428内p-p44/42（ERK1/2）Thr202/Tyr204的水平、以及LN308和ZH-161内磷酸-p38 MAPK的水平。而且，当LN-308内VEGFR2表达被沉默时，p-p44/42（ERK1/2）以及p-p38 MAPK不再被VEGF诱导（图2B）。

药物学有效性研究和遗传学研究都对VEGFR信号在恶性胶质瘤细胞内的作用进行了研究。使用结晶紫染色评估了LTC的克隆存活或通过spherogenicity评估了GIC的集落存活。单独100mg/ml的B20和TB403或二者仪器都对LNT-229或ZH161内的试验无影响。同样，外生VEGF或PIGF也无影响。相反，西地尼布通过~3uM EC50减缓了LNT-229的集落生成和ZH-161的spherogenicity。这种浓度对生存能力没有显著影响。为了研究VEGFR1基因沉默，我们选择了4种细胞系（3LTC（LNT-229、LN-308和U87MG)）以及GIC（ZH-161），全部经过高VEGFR1表达处理。2种LTC（LN-308、U87MG）和一种具有高VEGFR2标的GIC（T-325），选择较低VEGFR2表达的细胞系（LN-428、LNT229和ZH-161）进行VEGFR2基因沉默研究。qRT-PCR免疫印迹法（图2A）、流式细胞术和总p-VEGFR ELSIA成功确认了VEGFR1的基因沉默。通过qRT-PCR、免疫印迹法（图2B）、流式细胞术和总p-VEGFR2 ELISA验证了VEGFR2基因沉默。流式细胞术揭示LN-308内细胞凋亡对VEGFR1损耗有微弱作用，但是LNT-229内则未发现该作用。VEGFR2损耗在LN-308内没有类似作用但是提高了G2/M的水平。因此，VEGFR1/2不会影响LNT-229的倍增时间（25-30小时），LN-308内受体的损耗将倍增时间从40小时延长到50小时。而且，VEGFR1基因沉默将LNT-229内的集落生成下降到67%，将LN308内的集落形成下降到14%，ZH-161内的spherogenicity下降到7%。

图2. VEGFR1和VEGFR2耗尽的胶质瘤细胞内变化的下游信号。免疫印迹法试验（A）稳定VEGFR1基因沉默的LNT-229或LN-308细胞或（B）VEGFR2基因沉默的LN-308、LN-428、ZH-161或T-325细胞或相关对照细胞对下游信号产生的变化。12小时血清饥饿后，次融汇细胞为未处理或被VEGF （500ng/mL）或PIGF（1+2）（100+100ng/mL）刺激15分钟。

同样VEGFR2基因沉默减缓了U87MG、LN-308和LN-428的集落形成，尽管不能在LNT-229内减缓集落形成，但是能在ZH-161和T325内使spherogenicity下降（图3D和E）。RESCUE试验确认了基因沉默影响的特异性：CMV启动子促使的外生再表达VEGFR1（p=0.01）或VEGFR2（p=0.01）使集落形成恢复。在LNT-229中72小时节点处，VEGFR1基因沉默抑制29%（p=0.03）入侵（图3B和C）侵入程度较低的LN-308的侵入性没有被VEGFR1损耗抑制。相反，VEGFR2损耗降低了LN-308的侵入性，这和西地尼布有类似的范围（图3F和G），但是对LNT229没有影响。

图3. 胶质瘤细胞内VEGFR信号抑制作用的生物学效应。VEGFR基因沉默的效应（A）研究了集落形成和spherogenicity以及（B，C）LNT-229的侵入。（D，E）评估了VEGFR2基因沉默对集落形成和spherogenicity的效果、（F，G）使用球状体侵入试验评估了VEGFR2耗尽的LN-308的侵入性。该数据表示3球状体加减标准差（SD）区域的平均倍数变化（p<0.05）。

最后，我们研究了基因或药理学VEGFR抑制是否会影响体内肿瘤增殖。接种VEGFR1沉默的LNT-229（p=0.026）、LN-308（p=0.042）或U87MG（p=0.003）细胞的小鼠存活期显著延长（图4A和B）。LN-308模型中，全部对照小鼠不得不因肿瘤增殖被执行安乐死，但是shVEGFRmir组3只的小鼠存活下来并到190天时都没有出现主要迹象。3只存活小鼠的大脑切片显示仅有1只小鼠患有0.12mm2小瘤。适当的对照试验确认：在全部模型中第22天（LNT-229）时VEGFR1沉默的肿瘤内的p-VEGFR水平被强烈抑制，U87MG为第27天，LN-308为第44天（图4C）不仅如此，LNT-229内矩阵MMP 9的免疫反应性显著下降（图4D），对携带LNT-229对照肿瘤的小鼠使用TB403治疗产生了与VEGFR1沉默类似的存活延长效果但使用B20治疗则未出现该效果（图4A）。在某种程度上后者则是因为使用B20治疗早发评分2不利事件（体重下降≥15%）所致。第22天时，全部干预减少了涉及肿瘤的区域（图4E）。

图4. VEGFR1基因损耗或VEGFR1配体、VEGF和PIGF药物中和延缓了体内肿瘤增殖。（A）75000个非导向对照shRNAmir表达人体LNT-229胶质瘤细胞被植入裸鼠的大脑内。每周使用20mg/kg/天奥马珠单抗IgG对照物治疗2次或5mg/kg/天B20或20mg/kg/天TB403腹腔注射治疗。在肿瘤植入的当天开始治疗并维持治疗直到临床评分2症状出现。一个平行对照组的小鼠被植入75000个VEGFR1导向shRNA表达LNT-229胶质瘤细胞。（B）在裸鼠的大脑内植入100000VEGFR1沉默的或相关对照LN-308细胞。每组使用7只动物进行存活监视（Mantel-Cox检验）。（C）当第一只动物出现症状时，每组在同一天按照随机原则从牺牲的动物身上取得LNT-229治疗标本，这些标本进行p-VEGFR1Tyr1213着色（棕色）。使用苏木精（蓝色）进行对比染色。（D）使用MMP 9免疫反应性染色剂（棕色）对LNT-229治疗标本或正常脑组织进行染色。切片使用苏木精（蓝色）对比染色。（E ）在H&E切片（n=3，p<0.05，t检验）上评估LNT-229肿瘤的大小。

为了测定抑制生长因子可能的协同效应，我们允许肿瘤生长15天随后开始单独或同时使用VEGF或PIGF抗体或进行治疗直到出现进展。在这个范例中，与对照组相比，联合治疗能延长存活期（p=0.009）（图5A）。对照组肿瘤的CD31染色揭示了一个突出的信号，尤其是在肿瘤边缘，这与肿瘤细胞沿着血管侵入有关。入侵的细胞在肿瘤的外围，同时也出现在对照组肿瘤随体内的胶质瘤细胞内，显示出与治疗核心相关的明显p-VEGFR1染色，这表明VEGFR1在体内肿瘤细胞侵入方面发挥着作用。所有的干预导致p-VEGFFR1水平下降，降低了MMP9免疫反应性，通过CD31染色还发现降低血管密度的趋势（图5B和C）。

图5. 同时在体内导向VEGFR1配体、VEGF和PIGF产生的协同增殖抑制作用。（A）执行和图4类似的实验，但是有所调整。抗体治疗被推迟到肿瘤抑制的15天后，另一个动物组使用VEGF和PIGF治疗。（B）当每个主第一只动物出现症状时，按照随机原则牺牲动物取得肿瘤标本，并将标本进行p-VEGFR1Tyr1213着色（上列，棕色），CD31染色（中列）或MMP9染色（下列）。切片食用苏木精（蓝色）对比染色。（C）免疫反应性定量（n=3，p<0.05，t检验）。

VEGFR2损耗极大地延迟了LN-308（p=0.003）和U87MG（p=0.009）的肿瘤增殖，尽管全部模型确认坚持基因沉默（图6C和D、），但是LNT-229无效（图6A、B和E）。与对照组相比，Ln-308内的VEGFR2基因沉默明显缩小了肿瘤大小并降低了肿瘤核心以及侵入区域内MMP9 蛋白水平（图6E和F）。

图6. VEGFR2基因损耗延迟了LN-308内的肿瘤增殖但是在LN-229模型内无效。（A，B）75000个LNT-229或100000个LN-308损耗的VEGFR2或其shRNA对照细胞被移植到颅内并进行存活监视（n=7）。（C，D）VEGFR2基因沉默作为内部控制。（E）接口馈H&E染色切片（n=3）测定LN-308肿瘤大小。（F）VEGFR2沉默的MMP9的IHC水平。相对于对照值，MMP9阳性片段的平均区域（a.u.）下降了~86%（n=3，p<0.05）。

新确诊恶性胶质瘤患者的护理标准包括切除术或活组织切片，然后进行放疗及替莫唑胺维持。为了改变这种标准，同时代的人们做出了许多努力并提出了抑制血管生成延长存活期的假设。在2个随机的阶段3试验中，最先进的抗血管生成药物（如VEGF抗体贝伐单抗）已经通过增强放射反应率和延长无进展存活期发挥作用，但是该药物不能提升总存活率。相反，其他VEGF导向药物如西地尼布或VEGF抑制剂或非VEGF导向抗血管生成药物如enzastaurin和西仑吉肽都失败了，有助于选择抗血管生成治疗患者的生物标志物的临床验证研究仍在继续。

VEGF可能承担独立血管生成肿瘤促进的功能。尽管对肿瘤细胞VEGF自分泌效应和特殊胶质瘤细胞感兴趣，但是胶质瘤细胞内不同VEGF受体介导的信号通路尚不能被系统分析。为了研究VEGF家族配体和受体，我们已将描绘了人体胶质瘤细胞综合表达图谱，包括GIC。大部分胶质瘤细胞共表达多种VEGF和PIGF及其同源受体，但是处于不同的水平,。

在几乎所有胶质瘤细胞系的表面通过流式细胞术鉴别出了VEGFR1表达。渗透化LNT-229和LN-308细胞内的流式细胞术信号的主要变化说明存在细胞内VEGFR1仅有LNT-229和LN-308细胞表达了可溶VEGFR1。已经描述了VEGFR2内化和细胞内信号。预渗透化细胞的流式细胞术和免疫印迹法揭示了VEGFR2蛋白，但不是在非渗透化细胞的表面，确认了细胞内的位置。

大部分胶质瘤细胞显示出可被VEGF重组体轻微诱导的自分泌VEGFR1磷酸化（图1A、C和F）。免疫印迹法中，酪氨酸Y1213对VEGF和PIGF产生反应时VEGFR1被磷酸化。与西地尼布相反，VEGF（B20）或PIGF（TB403）中和抗体不能一直基本Tyr121磷酸化。二缺，LNT-229内VEGF或PIGE重组体对VEGFR1Y1213的刺激被B20或TB403分别中和，但后者作用较小（图1E和F）。

VEGFR2Tyr1059；Tyr1175的磷酸化暗示的自分泌信号也在一些细胞系酶被检出。总VEGFR2磷酸化不能在体外通过外生添加VEGF诱导，支持了VEGFR2不在细胞表面这一事实（图1B和D；图2B）。

我们确认了外生VEGF或PIGF以及抗VEGF或PIGF中和抗体对体外恶性胶质瘤细胞增殖效果甚微甚至无效。VEGFR1和VEGFR2的配体交互作用广义上可以免于抗体干扰但是仍可以被细胞内代理药物如西地尼布靶定（图1E和F）。因此，有缺陷的VEGFA或PIGF胶质瘤细胞具有降低的基本p-VEGFR1Tyr1213水平，确认了外生配体以来受体磷酸化（图1G）。

为了更好地描绘自分泌信号和推导VEGF家族受体的生物学作用，具有不同VEGFR1和VEGFR2靶定水平和活化水平的细胞系经受慢病毒衍生shRNA导致的受体特异性基因沉默。VEGFR2基因沉默主要对细胞内VEGFR2水平升高，细胞表面不能检测VEGFR2的细胞系发挥作用，这表明自分泌VEGFR2信号被细胞质胞内受体循环水平控制。受体沉默导致下游信号的明显变化，这可以解释为应激反应，表明可以在治疗上应用潜在的逃脱策略：MAPK对VEGFR1损耗反应的磷酸化，和AKT和MAPK对VEGFR2损耗反应的磷酸化（图2）。

VEGFR损耗胶质瘤细胞在集落生成和spherogenicity的水平、细胞系侵入性和依赖类型方式方面显示出强大的表型（图3）。例如，LNT-229细胞的克隆增殖和侵入不受VEGFR2损耗的影响，始终具有低水平VEGFR2表达水平和磷酸化，但是VEGFR1损耗却导致克隆和有丝分裂水平的显著下降，证明VEGFR2信号在一些胶质瘤细胞系中不是十分必要。反之，VEGFR1集落存活和VEGFR2高表达LN-308明显受到这两种受体沉默的影响。和LNT-229不同，VEGFR2显著下降抑制了侵入，但VEGFR1基因沉默很难影响LN-308的侵入。Rescue实验进一步确认了这两种受体的特殊生物学功能。

这些观测到的结果在裸鼠体内研究中得到了深化和确认。VEGFR1磷酸化在LNT-229肿瘤内不均匀分布，主要着色点位于浸润性肿瘤边缘。VEGFR1shRNAmir介导抑制或小鼠过早暴露于VEGF或PIGF中和抗体一致了VEGFR1磷酸化并抑制了肿瘤的增殖（图4A）。使用预先确定的诊疗范例，联合使用两种抗体由于单独使用一种抗体的效果并能在LNT-229模型中显著延长存活期（图5A）。VEGFR1表达或活性的抑制一致与肿瘤内MMP9丢失有关。在多种MMP中，仅有MMP9的转录和酶促水平与胶质瘤肿瘤分级有关。使用TCGA数据库基因表达数据（http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main. cgi#）的相关性分析确认了MMP9表达与VEGFR1表达（r=0.26，8e-10）和VEGFR2（r=0.22，p=1.4e-7）表达有关。

VEGFR1信号在肿瘤细胞中促进肿瘤增殖的作用已经在多个肿瘤模型中报告，但是还没有在恶性胶质瘤模型中报告。尽管在贝伐单抗中添加TB403不能在阶段1人体恶性胶质瘤患者研究中生成活跃度增强的信号，患者数量很少，也没有基于VEGFR1磷酸化对患者进行预选。因此促使临床试验侧重于恶性胶质瘤内p-VEGFR1水平和PIGF表达的生物标志物可能仍然代表定义恶性胶质瘤或其它癌症中PIGF导向作用的有效策略。同样，可以推测依赖于VEGFR信号的恶性胶质瘤的改善有助于定义西地尼布在恶性胶质瘤患者子集中的作用。LN-308模型中VEGFR2基因沉默导致的明显增殖抑制与MMP9免疫反应性下降有关，进一步描述了在选定的胶质瘤中，VEGFR1/2重要的肿瘤促进功能（图6）。VEGFR1/2在肿瘤增殖中的潜在功能在U87MG模型中得到确认。

总之，此次使用了不同的胶质瘤模型的系统性VEGFR研究表明VEGFR1和VEGFR2的不同功能存在相关性。这样深入的研究可能解决一些研究成果中的矛盾（如PIGF促进肿瘤增殖和皮下黑素瘤、正位胰腺同系肿瘤、GL-261啮齿类胶质瘤模型本地侵入性，或抑制肺部、结肠和U87MG胶质瘤模型的肿瘤增殖）同样，VEGFR2已经被报告能提升胶质瘤细胞活性和侵入性，但是阻断VEGFR2也可能通过活化c-MET通路诱发一些胶质瘤细胞的侵入。

尽管在体内啮齿动物模型中VEGF拮抗作用已经显示出限制胶质瘤增殖的能力，但是效果通常归功于抗血管生成。我们提供确定的证据表明至少某些模型中，胶质瘤细胞内固有的VEGFR信号是胶质瘤增殖的支撑：LNT229、LN-308和U87MG模型内，VEGFR1抑制是诱导肿瘤增殖延迟的主要原因（图4和5），但是VEGFR2减缓了LN-308和U87MG模型内的肿瘤增殖（图6）。 

将VEGFR表达转化为预后或预测生物标志物仍是一项挑战，需要仔细地考虑肿瘤内VEGFR磷酸化作用的类型和水平、内皮表达、肿瘤内多相性、重叠VEGFR变体的选择、以及删节的VEGFR1和VEGFR2变体的可溶性、蛋白水解性和裂解性。

（摘自Neuro-Oncology，版权归其所有，仅供内部学习）

编译：张凯

审校：王小茜