临床化学自建检测系统分析性能确认： 分析测量范围和临床可报告范围

分析测量范围（AMR）和临床可报告范围（CRR）是检验程序重要的分析性能。国外的临床化学检验多采用配套检测系统，即分析仪器、校准品和试剂形成固定组合，由同一厂商生产并经FDA批准后用于临床检测。而国内大多数实验室出于方便、经济和实用等原因均采用自建检测系统，即分析仪器、校准品和试剂分别由不同厂商生产，FDA批准后用于临床检测，实验室可根据需要自由形成组合。关于配套检测系统的性能验证本文作者已有详述[1]。对于自建检测系统，我国临床实验室管理办法和ISO15189：2012[2]均要求实验室应对其性能进行确认，证实其满足预期用途后方可用于临床检测。但对临床化学自建检测系统性能确认的具体实验方法国内尚未达成共识，本文对自建检测系统测定血清肌酸激酶（CK）的AMR和CRR进行确认，并评价不同方法的有效性，旨在为临床化学自建检测系统的分析性能确认提供参考。

材料和方法

1.仪器和试剂  仪器为西门子ADVIA 2400自动生化分析仪，试剂为四川迈克公司生产的CK测定试剂盒（批号为0915051），方法为IFCC推荐的血清酶学方法，校准品为Roche CFAS校准品（批号为181885-03），标示值为371U/L，实际校准值382U/L。

2.样品制备  （1）AMR初步评价样品：选择预测活性约为7U/L的低浓度样本（L）和2901U/L的高浓度样本（H）各1份，按8L、7L+1H、6L+2H、5L+3H、4L+4H、3L+5H、2L+6H、1L+7H、8H的比例制备成等间距的9份样品，理论浓度分别为7、368.8、730.5、1092.3、1454.0、1815.8、2177.5、2539.3、2901.0U/L，用于AMR的初步评价。（2）AMR确认实验样品：根据AMR的初步评价结果，去掉明显偏离直线的数据点后分别选择浓度为5U/L的低浓度样本（L）和1699.0U/L的高浓度样本（H）各1份，按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H制备成6个等间距的实验样品；或浓度为7.5U/L的低浓度样品（L）和1458.0U/L的高浓度样品（H），按4L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、0.4H制备成5个等间距的实验样品。（3）CRR确认实验样品：选择在AMR内的高值样本3份，用生理盐水分别稀释5倍、10倍和20倍。

3.AMR初步评价  9个等间距的实验样品按浓度由低到高分别编号为①～⑨，每个样品测量1次，记录测量结果，按以下方法初步评价AMR：（1）以样品号为横坐标（X），测量结果为纵坐标（Y），绘制散点图，根据数据分布情况初步判断AMR上限。（2）按以下公式计算稀释回收率初步评价所选浓度范围是否为AMR，稀释回收率=（实测值/理论值）×100%，以1/2行标规定的允许总误差（TEa=15%）[3]为判断标准（7.5%），各样品稀释回收率在92.5%～107.5%为可接受，此时实验所涉及浓度即为AMR。（3）以样品号为x，实测值为y，按CLSI EP6-A方案[4]进行多项式线性评价，以非线性偏差（ADL）≤7.5%（1/2TEa）为标准，判断非线性的可接受性。

4.平均斜率法确定AMR[5]  6个AMR确认实验样品各重复测量2次，记录实验结果。计算每个测量点的斜率以及平均斜率和预期值，以预期值为x，实际测量的均值为y绘制散点图，计算直线回归方程Y=a+bX和相关系数（r），若 （r2≥0.975），斜率（b）在0.97～1.03之间，截距（a）和0无显著性差异，以医学决定水平（MDLs）[6]浓度为X，若预期值与MDLs的相对偏差小于7.5%（1/2TEa），实验所选择的浓度范围即为AMR；若上述任何一项不满足条件，则去掉最高数据点重新实验。

5.EP6-A法确定AMR[4]  实验方法同平均斜率法。以样品号为x，实际测量的均值为y，绘制散点图，并将测量数据拟合为一次多项式Y=a+bX（直线）、二次多项式Y=a+bX+cX2和三次多项式Y=a+bX+cX2+dX3，判断二次多项式中系数c和三次多项式中系数c和d与0之间的差异是否具有统计学意义，求得临床可接受的最佳拟合多项式；当数据拟合的最适多项式为非线性时，则估计ADL，若ADL≤允许误差（7.5%），实验所选择浓度即为AMR；当ADL＞非线性允许误差时，则去掉最高数据点重新计算。

6.线性稀释回收法  按AMR初步评价方案（2）以理论值为x，实测值为y，进行直线相关与回归分析，若r≥0.95，b接近于1（0.97～1.03），a和0无显著性差异，各样品稀释回收率在92.5%～107.5%为合格；实验所涉及浓度范围即为AMR；若上述任何一项不满足条件，则去掉最高数据点重新实验。

7.CRR实验方法[1] 已知值的实验样品在检测系统上进行检测，获得的结果为实测值。已知值除以稀释倍数为预期值，实测值/预期值乘以100%为稀释回收率，设定允许误差为1/2TEa=7.5%（卫生行业标准规定允许总误差TEa=15%，稀释回收率在92.5%～107.5%为合格。AMR乘以最大稀释倍数即为临床可报告范围上限，结合AMR确定CRR。

结  果

1.AMR初步评价  以样品号为横坐标，实际测量值为纵坐标，绘制X-Y坐标图，连接各数据点，并划一条尽可能通过更多低浓度点的直线，目测从第5个样品（浓度为1651U/L）开始，测量结果明显偏低，初步判断AMR上限低于1651U/L（图1）。计算每个样品的稀释回收率，结果见表1。以理论值为x、实测值为y绘制散点图（图2）并做直线回归分析，回归方程为y=106.781+1.006x，r=0.997，a与“0”无统计学差异（t=2.077，p=0.076），b接近1（t=33.806，p＜0.01），根据回归方程计算回归预期值，结果见表1。将实验数据按EP6-A方案处理，统计结果见表2和图3，二次多项式为最适多项式，二次多项式的预期值和直线回归预期值的线性偏差见表3，第1个样品的ADL远超过允许偏差7.5%。

图1 分析测量范围初步评价散点图

图2 实测值与理论值的回归与相关分析

表1 AMR初步评价实验结果(U/L)与统计分析

表2 EP6-A方案9个数据点统计结果

表3 二次多项式预期值与直线预期值之间的线性偏差

2.平均斜率法确定AMR  根据AMR初步评价结果，选择浓度为5U/L的低值样本和浓度为1699U/L的高值样本各1份制备成6个等间距的实验样品，按实验方法重新测量，绘制散点图（图4-A），计算回归方程和r，r2=0.9991＞0.975，斜率b=0.9736在0.97~1.03之间（t=65.747，p＜0.01），a=17.677与“0”无统计学差异（t=1.127，p=0.323），在医学决定水平60U/L、200U/L和1500U/L处预期值和X的相对偏差分别为26.8%、6.1%和-1.5%，未满足允许偏差要求，提示实验所涉及浓度过宽。选择7.5U/L的低浓度样本和1458.0U/L的高浓度样本按实验方法制备成5个等间距的实验样品重新测量，结果见表4，绘制散点图（图4-B），r2=0.9997＞0.975，b=0.991（t=107.874，p＜0.001），a=4.86与“0”无统计学差异（t=0.5858，p=0.599），根据回归方程计算得出在医学决定水平60U/L、200U/L和1500U/L处与预期值的相对偏差分别为7.2%、1.6%和-0.6%。判定实验所涉及浓度7.5~1458.0U/L即为AMR。

图3 AMR初步评价的多项式线性分析

表4 平均斜率法统计结果

3.EP-6A法确定AMR  5～1699U/L之间6个等间距样品的测量结果同平均斜率法。将实验数据拟合成一次多项式、二次多项式和三次多项式，结果见表5，三次多项式的非线性系数c和d均有统计学意义，且有最小的回归标准误，判断最适拟合曲线为三次多项式，三次多项式预期值和直线回归预期值的线性偏差见表6，回归曲线见图5-A，最低点超出了允许偏差范围（7.5%），取掉最高点后重新选择7.5～1458.0U/L的5个等间距样品进行回归分析，结果见表7和图5-B，二次多项式的c以及三次多项式c和d均无统计学意义，直接判断此浓度范围即为AMR。但此时若分别计算二次多项式、三次多项式与直线回归的线性偏差，第一个样品的线性偏差分别为-63.4%和-31.2%（表8），仍明显高允许线性偏差。

注：A- 6个实验样品；B-5个实验样品

图4 平均斜率法实测值与预期值散点图

表5 EP6-A方案统计结果（6个数据点）

表6 三次多项式和直线回归的线性偏差（6个数据点）

表7 EP6-A方案统计结果（5个数据点）

表8 二次和三次多项式预期值与直线回归预期值的线性偏差

注：    回归直线；     二次多项式；    三次多项式

图5 多项式线性评价回归曲线

4.线性稀释法确定AMR  5～1699U/L之间6个等间距样品的测量结果同平均斜率法。计算每个样品的稀释回收率，结果见表9，回收率在100%～104.8%，误差均在±7.5%以内；理论值和实测值的回归方程为y=15.157+1.007x，r=1.000，b接近于“1”，截距a与“0”无统计学差异（t=1.008，p=0.371），表明实测值与预期值一致，但第1个样品的相对偏差明显高于允许误差7.5%。若去掉最高值重新实验，结果见表10，回归方程y=-3.042+0.995x，r=1.000，b接近于“1”，截距a与“0”无统计学差异（t=-1.187，p=0.321），但第1个样品的实测值和回归预期值的相对偏差仍大于7.5%。

表9 简易法确定AMR实验结果(U/L)与统计分析（6点）

表10 简易法确定AMR实验结果（U/L）与统计分析（5点）

5.临床可报告范围实验结果  在AMR内选择3份高浓度样本，分别做5倍、10倍和20倍稀释，实验结果见表11，稀释回收率在102.5%~107.4%之间，偏差在2.5%~7.4%之间，均低于7.5%（1/2行标规定的TEa），确定最大稀释倍数为20。此外，由表1还可以看出，随着稀释倍数据的增加，测量偏差有逐渐增大的趋势；若直接用行标规定的允许偏差（5.5%），则高值样本只能做10倍稀释。

表11 稀释回收试验测定结果

讨    论

检验程序的分析性能主要包括精密度、正确度、准确度、测量不确定度、可报告范围、分析特异性、分析灵敏度、检出限等[2]。其中可报告范围包括分析测量范围（AMR）和临床可报告范围（CRR）。AMR是指样本不需做稀释、浓缩等任何预处理直接使用检验程序或检测系统进行检验所获得可靠结果的范围。有时又称测量区间或工作范围，对于两点校准通常又称为线性范围。CRR是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围，此范围如果超出了AMR，可将标本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于AMR内进行测量。在ISO15189：2012中要求实验室应对检验程序的性能进行验证或确认，证实其达到厂商声明并满足预期用途要求后方可用于临床检测[2]。关于性能验证或确认的要求和时机作者已有详述[1]，但对临床化学自建检测系统性能确认的具体实验方法国内尚未达成共识，本文以肌酸激酶（CK）为例，探讨AMR和CRR性能确认的方法，旨在为临床实验室的质量管理和实验室认可提供一个简便实用的可报告范围评价方法。

近年来，临床化学自动化分析仪器已经普及，仪器可对反应响应呈不同表现的结果作适当的处理，直接以最终计量单位方式报告检验结果。在此情况下评价AMR时不必再去评价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度稀释或配制后，将预期值和实测值作比较，绘制在坐标图上应呈一条通过原点、斜率为1的直线，直线所达的限值即为AMR[4]。本研究将7U/L和2890U/L的2个样本按适当比例制备成9个等间距样品，目测从第5个样品（浓度为1651U/L）开始测量结果明显偏离了直线，初步判断AMR上限不会高于1651U/L，但这个测量点与直线之间的偏差有无统计学意义需做进一步的分析。理论值和实测值的直线回归和相关分析结果表明，r=0.997， b接近于1，a与“0”无统计学差异（t=2.077，p=0.076），但第1和第2个样品实测值和回归预期值的相对偏差均大于可接受的允许误差7.5%；将实验数据按EP6-A方案处理，二次多项式为最适多项式，二次多项式预期值和直线回归预期值在第1点的线性偏差为-102.5%，远超过允许误差7.5%；这两种方法从另一个角度说明实验选择的7U/L~2890U/L浓度范围不是检测系统的AMR。

评价偏离点与直线之间的偏差有无统计学意义常用的方法有平均斜率法[5]和EP6-A法[4]。根据AMR初步评价结果，选择浓度为5U/L的低值样本和浓度为1699U/L的高值样本各1份制备成6个等间距的实验样品，采用平均斜率法确定AMR，实验表明：实测值和预期值高度相关r2=0.9991＞0.975，b=0.9736在0.97~1.03之间，a与“0”无统计学差异（t=1.127，p=0.323），在医学决定水平60U/L、200U/L和1500U/L[3]处预期值和X的相对偏差分别为26.8%、6.1%和-1.5%，未满足允许偏差7.5%要求，提示实验所涉及浓度过宽。选择7.5U/L的低浓度样本和1458.0U/L的高浓度样本按实验方法制备成5个等间距的实验样品重新测量，r2＞0.975，b接近于1，a与“0”无统计学差异（t=0.585，p=0.599），在医学决定水平60U/L、200U/L和1500U/L处与预期值的相对偏差分别为7.2%、1.6%和-0.6%，均在可接受的误差范围内，判定实验所选浓度7.5~1458.0U/L即为AMR。实验结果提示，若使用传统的平均斜率法[5]，仅用预期值和实测值进行相关和回归分析判断可能会得出错误结论。正如本研究结果所示，若不把医学决定水平处的误差标准纳入AMR的判断依据，则会导致AMR过宽。

采用EP6-A方案[4]确定AMR的实验结果表明：三次多项式的非线性系数c和d均有统计学意义，且有最小的回归标准误，判断最适拟合曲线为三次多项式，三次多项式预期值和直线回归预期值的线性偏差最低点超出了允许误差范围7.5%。取掉最高点后重新选择样品配制成5个等间距的样品进行实验，结果表明：二次多项式的c以及三次多项式c和d均无统计学意义，直接判断此浓度范围即为AMR。但此时若分别计算二次多项式、三次多项式与直线回归的线性偏差，第一个样品的线性偏差分别为-63.4%和-31.2%，仍明显高于允许线性偏差。显然EP6-A方案用于确定AMR存在明显不足，主要是高浓度点测量结果明显偏低时会拉大回归直线与Y轴的截距，降低直线的斜率，导致曲线预期值与直线回归预期值在低值处的线性偏差明显加大[5]。因此，当出现低浓度线性偏差超出允许误差时不是取消低浓度样品重新实验，而是取消高浓度样品进行实验。

本研究还评价了线性稀释回收法确定AMR的可行性。这是基Wesghard的建议[7]、线性稀释试验[8]和平均斜率法[5]的原理而设计的。5个和6个等间距样品的测量结果均表明，理论值和实测值之间均具有很好的相关性，r=1.000，b均接近于“1”，截距a均与“0”无统计学差异，但第1个样品的实测值和回归预期值的相对偏差仍大于7.5%，回收率均在92.5%～107.5%范围内。可见6个样品和5个样品的实验统计结果相同，结合9个样品AMR的初步评价结果，表明线性稀释法的统计效能较低。但若结合稀释回收率确定AMR基本可以满足临床实验室要求。因此，结合理论值和实测值的线性相关分析以及稀释回收率确定AMR，不需要特殊的统计计算，得出的AMR基本能满足临床需要，适合临床实验室采用。

确定CRR上限通常采用稀释回收实验[1,9]。在AMR内选择3份高浓度样本，分别做5倍、10倍和20倍稀释，稀释回收率在102.5%~107.4%之间，偏差在2.5%~7.4%之间，均低于7.5%（1/2行标规定的TEa），确定最大稀释倍数为20，结合AMR为7.5~1458.0U/L，因此CRR为7.5~1458.0×20即7.5~29160U/L。实际上CRR下限应为定量检出限或功能灵敏度。此外，由表1还可以看出，随着稀释倍数据的增加，测量偏差有逐渐增大的趋势；若直接用行标规定的允许偏差（5.5%），则高值样本只能做10倍稀释。

值得注意的是，临床实验室在进行检验程序分析性能确认前必须明确分析方法的性能目标。分析性能指标的设定有多种方法［10］，国内多采用CLIA规定的允许总误差（TEa=30%），这是对分析方法的最低性能要求。本研究采用了行标规定的CK质量指标（优等）［3］，TEa为15%，设定允许线性偏差、稀释回收允许误差、在医学决定水平处的允许偏差均为1/2TEa即7.5%，分析性能达到此要求即可认为能很好的满足临床要求。实验证明，采用平均斜率法获得CK在该检测系统上的AMR为7.5~1458.0U/L，此时在MDLs处的相对偏差分别为-0.6%~7.2%，达到了性能目标的要求；采用EP6-A法获得的AMR同样为7.5~1458.0U/L，但在最低浓度点（7.5U/L）二次多项式和三次多项式与直线的线性偏差分别为-63.4%和-31.2%，未得到性能目标的要求，这是评价方案的缺陷，临床上也无实际意义；采用简易法获得的AMR为5~1694U/L，此时的回收误差为2.6%~4.8%，达到了性能目标的要求，但在5U/L浓度处实测值与回收预期值的相对偏差为-75.2%，未得到性能目标要求，这也是统计方法的缺陷，缺乏临床意义。在允许误差小于7.5%即稀释回收率在92.5%~107.5%的条件下获得的CRR为7.5~29160U/L，这一范围基本可满足临床要求。当然，分析性能目标也可使用根据生物学变异导出的质量指标、CLIA规定的允许总误差、各行业指南规定的质量要求、PT/EQA组织者规定的TEa等，实验室应根据分析项目的临床应用自行设置，以满足临床需要为目的。

研究结果显示：目测法初步评价AMR可以很容易地发现非线性数据点，对后续的AMR确认研究至关重要[4]。用EP6-A法确定AMR统计过程复杂，且在低浓度点的线性偏差往往很大，不能达到质量目标的要求，存在明显缺陷，这也是自2003年发布以来长期没有更新的原因之一。平均斜率法具有较高的统计效能，但统计过程相对复杂，若不把医学决定水平处的误差标准纳入AMR的判断依据，则会导致AMR过宽。稀释回收法只需要对实测值和理论值作线性相关和回归分析，在r≥0.95（r2≥0.975）、斜率接近于1（通常在0.97~1.03）、a与0无统计学差异，且稀释回收率达到质量目标要求的条件下，实验所选择的浓度范围即为AMR；该法实验方法简单，不需要复杂的统计处理，结果也中以满足临床需要，适合临床实验室常规使用。诊断试剂厂商在确定AMR时可选择平均斜率法或EP6-A法。

参 考 文 献

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