临检热点问与答

北京积水潭医院检验科吴俊主任：血小板功能检测可以判断血小板相关的出血及检测抗血小板药物效果。当然血小板功能包括很多方面，如粘附功能、聚集功能、释放功能等等，临床最常见的检查是“血小板聚集功能”检查。临床常用领域为：

1、对于考虑血小板因素导致的出血，除检测血小板数量形态外，血小板原发和继发功能缺陷，会导致临床出血症状，如“血小板无力症”、“巨大血小板”。

2、服用阿司匹林、氯吡格雷、替卡格雷等抗血小板药物，主要是看是否有效抑制了血小板功能，如不能达到有效抑制，患者存在较大血栓风险，临床上患者都使用相同剂量药物，但是药物代谢类型，血小板反应性不同，很大部分患者没有得到有效保护，需要实验区分出这部分患者，增加药物剂量或是改换药物。

北京协和医院检验科寿伟玲、范连恺、张时民主任：血小板聚集试验在一些出凝血疾病、心脑血管病的诊断，特别是用药治疗监测等方面非常有重要，因此在综合性医院，相关专科医院都有应用价值。值得向临床宣传，推广应用。本文就其检测原理、方法、临床应用和注意事项等问题，进行简要解答。

血小板聚集试验（platelet aggregation test，PAgT）是最常用的血小板功能检测方法，反映血小板在不同诱导剂（ADP、花生四烯酸、胶原、瑞斯托霉素、肾上腺素等）作用下发生聚集变化的动态过程。临床实验室常用的检测方法为光学比浊法（LTA）和阻抗法。

Born于1962年首次应用光学比浊法检测血小板聚集功能，是最经典的血小板功能检测方法，目前常做为诊断研究的金标准。其原理为磁力搅拌条件下，于富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）中加入一定数量的诱导剂，血小板发生聚集，PRP浊度发生变化，光电池将光浊度变化信号转换为电信号，通过计算可获得不同诱导剂下的血小板聚集率。

阻抗法检测原理为在全血样品杯中插入一对铂电极，当全血中的血小板在诱导剂作用下发生聚集时，可覆盖在铂电极表面，导致电阻抗的改变，后者变化与聚集程度有关，电阻抗的改变可转换为聚集曲线从而计算出血小板的聚集率。

血小板聚集率的测定对出血性疾病疾病的诊断和鉴别诊断，血栓性疾病的监测具有重要的临床意义。同时，可对抗血小板药物（阿司匹林、波立维等）的临床效果进行初步评估。

血小板聚集率增高见于高凝状态、血栓前状态和血栓疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、糖尿病、脑血管病变、深部静脉血栓形成、晚期妊娠等。

血小板聚集率降低见于可见于血小板无力症、巨血小板综合征、贮存池病、May-Hegglin异常、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症等。不同诱导剂可产生不同类型的血小板聚集曲线，不同血小板功能缺陷病对各种诱导剂的反应不同，血小板聚集试验可对血小板功能缺陷病进行诊断和鉴别诊断。

（1）血小板无力症（Glanzmann病）：ADP、胶原和花生四烯酸、肾上腺素等诱导剂无聚集反应，对瑞斯托霉素有聚集反应。

（2）巨大血小板综合征：ADP、花生四烯酸诱导的血小板聚集正常，胶原诱导的血小板聚集减低，瑞斯托霉素诱导的血小板不凝集。

（3）贮存池病：致密颗粒缺陷时，ADP诱导的聚集常减低，无二相聚集；胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集正常；α颗粒缺陷时，血小板凝集和聚集均正常。

血小板聚集试验影响因素多，结果变异大。操作过程应注意：

（1）标本采集避免组织液和气泡混入。

（2）枸橼酸钠和全血比例为1：9，HCT应<55%，否则 Ca2+浓度变化影响血小板聚集能力，必要时应修正抗凝剂含量。

（3）标本采集后室温保存送检。

（4）标本采集后30min以内不应进行检测，但应在4h内完成检测。

（5）PRP中血小板计数最佳范围为200~300×109/L时，血小板计数小于100×109/L或大于1000×109/L时，聚集反应性降低。

广州南方医院检验科郑磊主任：血小板功能检查主要有：1. 血小板粘附试验；2. 血小板聚集试验；3. 血小板粘附集聚试验；4. 血栓弹力图。其中血小板聚集试验方法有：(1) 血小板集聚仪法；(2) VerifyNow 仪法；(3) 流式细胞术聚集法；(4) 血小板粘附聚集试验用到的仪器为PFA系列血小板粘附集聚仪。

血小板功能检测的的临床应用：1. 血小板病的实验诊断；2. 血栓前状态的实验诊断；3. 抗血小板药物治疗监测。

1. 血小板病的实验诊断如血小板无力症、巨大血小板综合征、贮存池疾病（SPD）等。

2. 血栓前状态的实验诊断：很多疾病的血栓前状态与血小板的粘附、聚集功能有关。

（1）高血压病：血液动力学改变、血管内皮损伤以及血浆5-HT升高均可使血小板聚集率增高。

（2）经皮冠状动脉支架术（PTCA）：研究显示, 血小板的黏附聚集增强, 继而形成富含血小板的血栓是经皮冠状动脉支架术后急性冠状动脉闭塞的主要原因之一。血小板聚集率是监测支架植入术后急性冠状动脉再闭塞的一项重要指标，同时也为临床加强抗血小板聚集剂的应用提供依据。

（3）肺心病：肺心病急性期由于严重缺氧，酸中毒、肺血管壁受损，使血小板在体内通过各种途径发生粘附、聚集，随后由于过度刺激、血小板功能处于衰竭状态，表现为血小板聚集下降、血小板数减少。

（4）II型糖尿病：糖尿病患者高凝状态引起的毛细血管闭塞及微血栓的形成，造成视网膜缺氧、缺血，从而引起视网膜病变。因此，对于糖尿病患者在降糖、降压和降脂治疗的同时重视血小板聚集的监测和抗血小板的治疗，在防治糖尿病并发症的发生和发展方面有重要的临床意义。

（5）脑梗死：血小板聚集率越高，脑卒中的风险越高。在治疗脑梗死的同时，密切监测血小板聚集率，有利于评估用药疗效和有效预防脑卒中的发生。

（6）肾病综合征（NS）：血小板在NS病人中处于高度活化状态，加上凝血系统、纤溶系统和抗凝系统等的改变，导致了肾病综合征的高凝状态。

（7）妊娠高血压综合征：妊高征患者处于高凝状态，重度血栓前状态易发展成DIC。因此，妊高征患者凝血指标及血小板参数的动态监测，对于血栓前状态的及时干预及有效预防DIC的发生，具有极积的指导作用。

（8）复发性流产：检测血小板聚集率主要是为了调整抗血小板药物的剂量，使抗凝用药个体化，可以对复发性流产的预防起到最大的效果。

（9）高脂血症：临床研究证明，高脂血症患者血小板聚集及释放均增强。本病血小板聚集性增高的机制可能与高脂血症患者低密度脂蛋白（LDL）增加及高血脂时血清过氧化脂质（LPO）升高有关。

（10）肿瘤：临床研究证明肿瘤患者存在高凝状态，其血小板聚集率亦升高。

3. 抗血小板药物治疗的监测：抗血小板药物是预防以及治疗血栓性疾病的重要手段，尤其是对冠心病患者及介入治疗的患者，其作用短时内即可体现。但相应地，如若出现抗血小板药物治疗过度或治疗不足，其出血事件以及血栓事件的发生也极其迅速。血小板对药物的反应存在多样性，个体之间的差异很大，因此对抗血小板治疗的患者进行血小板功能监测非常重要，不仅是单纯的评估抗血小板药物效果，更是评估药效并据此调整药物的重要依据。传统抗血小板药物有阿司匹林、氯吡格雷（波立维），新型抗血小板药物有普拉格雷、替卡格雷、西洛他唑、双嘧达莫等。正常血小板聚集试验的最大聚集率约为60-75%，用药物治疗过程中维持其降至正常的20-30%为宜。

血小板功能检测在很多大医院已常规开展，对临床上血小板疾病、血栓前状态的诊断有重要意义，尤其广泛应用于抗血小板药物的监测与调整。

南通市第一人民医院检验科临检室曹兴建主任：

（1）血小板的功能可以概括为：① 黏附功能：内皮下成分、vWF（血管性血友病因子）和血小板膜糖蛋白（GP）是血小板黏附机制的个主要成分。血小板通过GPⅠb与vWF的桥联作用与内皮下组织接触黏附，进而导致血小板活化、变形并暴露GPⅡb/Ⅲa受体。② 释放功能：血小板的主要功能是通过活化后释放的颗粒内容物实现的，多数血小板聚集诱导剂可引起释放反应。③ 聚集功能：血小板之间互相黏附聚集成团。聚集反应分两相，Ⅰ相：损伤组织或红细胞释放的ADP导致血小板与血管壁损伤部位黏附。Ⅰ相发生迅速且可逆（可解聚）；Ⅱ相：由血小板本身释放的二磷酸腺苷（ADP）诱导。特点是缓慢且不可逆。④ 促凝功能：血小板表面吸附的凝血因子在血小板活化时释放，参与凝血过程。另外，血小板表面磷脂也具有促凝作用。⑤ 血块收缩功能：活化血小板在肌动蛋白细丝和肌球蛋白粗丝的相互作用下伸出伪足，收缩纤维蛋白束，使纤维蛋白网间隙的血清被挤出，血块收缩，利于伤口的缩小和愈合。⑥ 维护血管内皮的完整性：血小板能填充受损血管内皮细胞脱落产生的间隙，参与内皮细胞的再生和修复过程。

（2）血小板功能测定方法

① 血小板聚集率，是测定血小板功能最为常用的方法，广泛用于抗血小板药物疗效的监测，比浊法和电阻法分别通过透光度和电阻抗的改变反应血小板的聚集情况。传统的血小板聚集率测定不能检测血小板微聚集体的形成，而微聚集体的形成可能和血小板高活性更加相关。Gabbasov等首次发明了使用激光散射器定量测定微聚集体的形成。

② 流式细胞仪，可以在短时间内分析大量血小板样本。最常用的活化标志物是CD62p（或称为GMP-140、P-选择素等），它在活化的血小板表面表达，是目前最具特异性的血小板活化分子标志物。但也有研究显示，CD62p的表达和动脉粥样硬化性疾病无关，这可能是由于血小板活化后CD62p从血小板表面释放入周围基质，减少了血小板上的CD62p表达。其他常用的活化标志物还有血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体、血小板-白细胞结合体（PLA）等。

③ 血小板功能分析系统（PFA-100），枸橼酸钠抗凝的全血样本在高切变率条件下通过膜覆盖的微孔，膜上有胶原和ADP或肾上腺素等致聚剂。血小板在致聚剂和切力的作用下形成凝血栓封闭微孔的时间称为闭塞时间（closure time，CT）。PFA-100主要用于监测GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂治疗和阿司匹林抵抗的研究。研究显示，其在鉴别对阿司匹林抵抗的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者上有很大作用。

④ 快速血小板功能分析仪（ultegra rapid platelet function analyzer，RPFA或VerifyNow）RPFA是一种自动全血比浊度测定仪，通过纤维素原包被的微球与全血反应，检测某一时间间期内血小板聚集所致光吸收的改变。主要用于床旁评估抗血小板药物治疗的反映，方法简单、快速、准确。香港大学玛丽医院通过RPFA评估规律双联抗血小板患者中的抗血小板药物抵抗，其功能水平能预测经皮冠状动脉成形术（PCI）后患者的血栓事件。RPFA还被广泛用于阿昔单抗、替罗非班、依替八肽等GPⅡb/Ⅲa抑制剂的抗血小板疗效监测。

⑤ Cone and Plate（let） Analyzer（CPA），这种方法在高切力场下测量血小板的黏附和聚集。少量（0.2mL）枸橼酸钠抗凝的全血在高切力下旋转，自动染色后经图像分析软件测量血小板黏附。方法简单快速，样本量少，且高剪切力条件可模拟生理环境。CPA可用于快速鉴别遗传性和获得性血小板功能障碍和血管性血友病（vWD），监测血小板治疗和测定血小板高活性状态（如糖尿病患者）。

⑥ 血栓弹力图（TEG），血栓弹力图的测定流程是在肝素化血液样本中加入巴曲酶和凝血因子ⅩⅢ形成初级血栓，再加入花生四烯酸和ADP形成血小板纤维蛋白凝块。血栓弹力图是血小板纤维蛋白凝块的最大弹力度，其结果与血小板聚集率的测定结果关联度好。

⑦ 磷酸化VASP测定，VASP是一种血小板蛋白，基线时处于非磷酸化状态。磷酸化过程受cAMP级联过程调控，而前列环素E1（PGE1）能激活这个级联反应。VASP的磷酸化与P2Y12受体的抑制水平直接相关。所以，氯吡格雷等抗血小板药物的效应可以通过测定磷酸化的VASP来评价，故也可以用于评价抗血小板药物的群体差异。磷酸化VASP测定方法敏感性和特异性都较强，与血小板聚集率的测定平行性好，需要的血样样本小并可使用全血。

此外，Plateletworks及电子显微镜等也可以用于血小板功能检测。

（3）血小板功能测定方法的临床应用价值

① 在心血管疾病中的应用：A. 早期诊断血栓前状态，对血栓前状态的早期诊断可以帮助判断血小板是否处于活化状态，这也是血小板参与血栓形成的前提。B. 血小板功能测定可以预测心血管疾病的临床终点。流式细胞仪测定活化血小板的表面特异性标志物能预测急性冠状动脉综合征和支架植入后患者的主要不良心脏事件（MACE）。C. 对抗血小板药物疗效的监测，抗血小板治疗是行PCI的患者围手术期和手术后药物治疗的基石。阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗是目前PCI后患者二级预防的常规治疗。尽管进行规律的抗血小板药物治疗，仍有部分患者会再发血栓事件。抗血小板药物不能有效防止动脉内血栓形成的现象称为抗血小板药物抵抗，可分为阿司匹林抵抗、氯吡格雷抵抗和GPⅡb/Ⅲa拮抗剂抵抗等。最近的研究则显示，血小板对抗血小板药物治疗的反应呈现对称的钟型分布，所以提出用血小板功能测定评估抗血小板治疗的反应是顺理成章；

② 在糖尿病中的应用：糖尿病本身就是支架内血栓的预测因子，可能在将来能通过测定血小板功能解决是否延长氯吡格雷的使用时间的问题；ACS合并2型糖尿病患者与非糖尿病ACS患者相比，前者纤溶系统明显异常，血小板功能亢进，提示发生心血管事件的危险性更大；

③ 在尿毒症透析诊治中的应用：尿毒症透析患者晚期易出现出血情况，其原因为体内凝血系统的障碍，而血小板是体内凝血系统的主力军，其功能的好坏可以直接影响凝血体系的运转，血液聚集试验可以很好的发现血小板的聚集情况，进而判断其聚集功能，对临床医生发现尿毒症透析患者出血原因有较大的临床价值；

④ 在肝脏疾病中的应用：肝硬化患者的血小板聚集率则明显减低；

⑤ 在妊娠高血压综合征中的应用：妊高症患者的ADP诱导的血小板聚集反应明显升高，释放也有所增加。另外，胶原诱导血小板聚集在妊娠25周升高提示先兆子痫等等。

吴俊主任：便潜血实验一般推荐双法检测，即化学法+免疫法，化学法原理为过氧化物染色来判断阳性，容易受还原性物质（如维生素C）的影响，化学法检测抗原量宽，不受“前带效应”影响；免疫法为血红蛋白单抗的层析法，受还原物质的影响较小，但受抗原量影响，有“前带效应”。所以，对于使用维生素C的患者，应该使用免疫法以消除影响。

张时民主任：粪便潜血目前主要有两种检测方法，化学法和免疫学方法。以化学法为检测原理的包括邻连甲苯胺法、愈创木树脂法、无色孔雀绿法等，其缺点是特异性不好，敏感度不高，但价格低廉，还可根据颜色反应判断阳性程度。这种实验方法最好要求患者实验前三天素食，以及避免因食用动物血或肉类食物，包括某些蔬菜的影响，这可能指某些蔬菜中含有过多叶绿素的干扰，而并不是维生素C干扰的问题，一般吃水果也不会影响太大。而一般保健性服用或治疗剂量的口服维生素C的量，也不会对便潜血有显著影响。如果你用的是尿试纸中的潜血模块，在低浓度维生素C含量的标本中，影响并不显著，如果是大剂量或静脉输注维生素C可能受到影响，导致假阴性问题发生，建议换一种方法复查。第二种方法是单克隆抗体胶体金便潜血实验，该方法敏感度高，特异性好，一般不受食物影响以及药物因素影响，也不会受到维生素C干扰，现在许多医院多以该方法作为粪便潜血试验的首选方法，他也可以作为化学法可疑标本的有效验证方法。他的缺点是当有上消化道出血或大量出血时，比如柏油便，会因“后带现象”导致假阴性问题发生。

郑磊主任：粪便隐血试验主要有化学法和免疫学方法两种。化学法常用的有邻甲联苯胺法、愈创木酯法等，其检测原理是血红蛋白中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的活性，催化氧化底物邻甲联苯胺脱氢为显蓝色的邻甲偶氮苯。化学法虽使用方便并可半定量，但试剂不稳定、特异性较低且干扰因素较多，如服用大量维生素C或其他具有还原作用的药物可致结果呈假阴性。免疫学方法采用单克隆抗体免疫胶体金法，其灵敏度高，且对人隐血具有高度特异性，不受食物因素影响，不受动物血红蛋白影响，也不受维生素C影响，但应警惕柏油样便等大量出血造成的后带现象引起的假阴性结果。

为尽量消除维生素C对大便隐血试验的结果影响，建议：1. 做好隐血试验的全程质量控制：如用化学法，患者在试验前3天停止服用维生素C等药物及大量含有过氧化物酶的食物；检测中严格按试剂盒说明书规范操作，避免试剂失效，做阴性和阳性质控对照试验；与临床保持沟通，分析检验报告是否与临床相符。2. 与免疫学方法联合检测。

需要注意的是，不论哪种方法检测，都只能作为筛选或辅助诊断，必须与临床密切结合。

曹兴建主任：用免疫法和化学法同时检测来排除维生素C对结果的影响。

（1）化学法：FOBT的化学方法较多，如邻联甲苯胺法、邻甲苯胺法、还原酚酞法、联苯胺法、无色孔雀绿法等。其原理是利用血红蛋白中的含铁血红素有类似过氧化物酶的作用，将供氢体（色原）中的氢转移给H2O2生成水（H2O），供氢体脱氢（氧化）后形成发色基团而呈色。呈色的深浅可反映血红蛋白（出血量）的多少。特异性及抗干扰性能较差，假阳性率较高。因为其检测的是过氧化物酶的活性，实食物因素对检测结果影响大，原因主要与非人类Hb、饮食中的假过氧化物酶以及再水合作用有关；其假阴性的主要原因与血红蛋白降解、维生素C作用和试剂贮存有关。

（2）免疫法：包括免疫单向扩散法、对流免疫电泳、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析试验等。它是用胶体金颗粒标志抗原或抗体，进行抗体或抗原的检测。粪便隐血胶体金法测定是利用双抗体夹心法，采用抗人血红蛋白单克隆抗体制成，抗体能特异地结合人血红蛋白，其灵敏度、特异性高，检测结果不会因维生素C等抗氧化剂及铁剂、动物血等干扰，假阳性率低，能够较真实反应消化道出血与否。