应用临床质谱技术进行乙肝耐药检测

作者:北京毅新博创生物科技
2021-12-16

我国乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者约为3000万,居世界之首,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原发性肝癌。因此,有效防治慢性乙型病毒性肝炎是一项长期而又艰巨的任务。在临床治疗慢性乙型肝炎的方案中,使用抗病毒药物进行治疗是最主要的手段。乙肝抗病毒药物可分为干扰素和核苷(酸)类两大类。干扰素由于副作用较多,耐受性差,且不可用于失代偿期肝硬化、中重度及重型肝炎等问题在临床上限制了其使用,而核苷(酸)类药物以其便捷的服用方式,强大的抗病毒效力以及较小的副作用赢得了最大的市场。但是核苷(酸)类药物在抗HBV治疗中由于需要长久服药,因此慢性乙肝患者可能会出现病毒耐药,由此可导致治疗失败,病毒反弹,肝功能恶化,加重病情。因此,如何早期、及时、准确的发现病毒耐药,从而调整治疗方案,减轻肝脏损害,指导远期治疗,在慢性乙肝临床治疗中具有极其重要的意义。


乙型肝炎病毒耐药性的产生与其病毒特性息息相关。HBV属嗜肝病毒科,是已知真核细胞中最小的DNA病毒。其基因组全长约3200bp,具有4个部分重叠的编码区,包膜蛋白基因区(S区),核心蛋白基因区(C区),聚合酶基因(P区)和X蛋白基因区(X),而核苷(酸)类药物的靶点正是P区的产物之一,HBV聚合酶。核苷(酸)类药物包括两大类,嘧啶类似物和嘌呤类似物,其化学结构与聚合酶的底物dNTP相似,因此可以和dNTP竞争达到抑制HBV聚合酶的活性,进而抑制乙肝病毒的复制。但是,由于HBV的逆转录酶缺乏校正功能,在体内复制过程中上述4个编码区域均可能产生核苷酸的错配,所以慢性感染的病毒群体具有野生株和不同突变株混合存在的特征,且不同株间的比例经常变动。而一旦突变产生的位置造成了药物靶点的改变,那么就会导致具有耐药特征的突变株的出现,目前已知的核苷(酸)类药物的耐药突变均发生在HBV的P区中。所以,当慢性乙肝患者长期服用同一种抗病毒药物时,会给体内的混合病毒株产生一种选择压力,在野生株消亡的同时,耐药突变株会大量繁殖,赋予HBV病毒强大的适应能力,造成了疾病控制的困难。

图一:乙肝病毒基因组

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目前我国主要的核苷(酸)类抗病毒药物共有四种:阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)、拉米夫定(Lamivudine,LAM)、替比夫定(Telbivudine,LDT)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)。LAM耐药株多有YMDD区域rtM204的突变,伴或不伴有其它位点的突变,最常见的LAM耐药突变为rtM204V/I、rtVl73L和rtLl80M。ADV耐药发生率较低,181和236位置的变异与ADV的临床耐药直接相关,以rtN236T和rtAl81V/T突变为主。ETV耐药相关变异是在rtM204V+rtLl80M变异基础上,再联合rtTl84、rtS202或rtM250 3个位点中至少1个位点的氨基酸替代变异。LDT目前发现的关键的耐药类型rtM204I,与LAM存在交叉耐药。


长期抗病毒治疗必须要面对可能随之而来的病毒耐药问题,病毒耐药以基因变异为基础,继而出现病毒学突破,病毒反弹,生化学突破,从而导致治疗失败。出现疾病进展甚至出现肝功能失代偿,重症肝炎或死亡。另一方面药物之间的交叉耐药、病毒的多重耐药也会给后续治疗的药物选择带来极大的困难。随着核苷(酸)类抗病毒药物的普及及用药时间延长,HBV耐药株带来的问题日益严重,在慢性乙型肝炎治疗过程中密切监测耐药突变,成为耐药管理的重要环节。 


图二:HBV耐药曲线

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目前检测HBV基因耐药突变的方法有多种平台可供选择。直接测序法(Direct DNA Sequencing)是目前最常用的耐药检测方法之一,其原理是将HBV基因组的逆转录酶区(P区)进行扩增后直接进行测序分析。测序结果包含已知和未知突变位点信息,但此方法灵敏度低,只有当突变株超过总病毒量20%时才能检出。与其类似的克隆测序法通过将患者血清PCR产物连接质粒后转化细菌,再选取转化成功的菌落进行测序。和直接测序相比,经过此方法得到的测序结果来源于同一个病毒,灵敏度有了很大的提高,但因其步骤繁琐,耗时长,成本高等原因,不适合临床检验使用。


聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)是在进行PCR时,在突变位点引入限制性酶切位点,然后待PCR扩增完成后使用限制性酶切分析片段长度,最后根据片段长度分析突变类型。此方法应用广泛,灵敏度较高(~10%),但针对每个耐药位点以及每个位点的每种突变都需要单独设计PCR引物与限制性内切酶位点,因此检测结果会受到限制性内切酶功能状态、酶反应条件的限制,且只能检测单一突变位点,耐药监测范围有限。


反向杂交法(Reverse Hybridization Assay)的检测灵敏度约为10%,手动检测操作步骤繁琐,依靠肉眼对结果进行判读,主观性较大。如果使用自动化仪器进行检测,仪器及配套试剂价格昂贵。


焦磷酸测序法利用核苷酸链生成过程中释放出的焦磷酸,在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下与5’磷酸化硫酸腺苷反应生成ATP,然后在荧光素酶催化作用下,与虫荧光素反应产生荧光信号进行测序。与直接测序法相比,可检测到最低10%的耐药病毒,但一次反应只能检测约40个碱基序列,成本较高。


基因芯片法(Gene Chip/DNA Chip/DNA Array)在其经过特殊处理的玻片上锚定了多种针对突变位点的探针,特异性的PCR产物与探针杂交后经过洗脱去除游离状态的核苷酸序列后再在微阵列扫描仪上扫描,并用软件分析确定耐药的类型,检测灵敏度可达到10%。此方法成本较高,其结果易受到背景荧光噪音的干扰,对实验人员的操作要求较高。


实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)操作简便,可检测变异发生率低于10%的耐药变异。此方法缺点是每个位点的不同变异均需合成相应的荧光探针,合成探针费用较高,而且由于HBV序列的变异以及存在二级结构,有少于10%的序列无法与探针结合,从而影响到检测的灵敏度。


基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)在微生物和蛋白检测领域已应用于临床多年,其基本原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程,然后在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。因此它是一种软电离技术,不产生或产生较少的碎片离子,适用于混合物及生物大分子的测定。由于分子量是有机化合物最基本的理化性质参数,分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。



图三:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测原理示意图

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由北京毅新博创生物科技有限公司生产的Clin-TOF,适用于基因及核酸的检测分型,具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点,为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段,并正扮演着越来越重要的作用。与仪器相配套的乙型肝炎基因耐药突变检测试剂盒灵敏度为5%,高于其他方法,可更早检出与抗病毒药物耐药相关的HBV变异,更早发现耐药的产生。另外其检测结果能根据信号的强弱进行定量,可反映出不同的耐药病毒株所占比例,为个性化临床治疗方案的制定及调整提供极其重要的依据,对提高治疗效果具有重要意义。例如,下图中患者1(红色)体内的乙肝病毒中有9.5%是A181V突变株,患者2(黑色)则有26.7%的乙肝病毒为A181V突变株,而A181V突变与阿德福韦酯(ADV)的临床耐药有直接关系。



图四

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北京毅新博创生物科技有限公司 供稿