自动间接免疫荧光检测抗核抗体的 定量室内质量控制方法

作者:卫生部临床检验中心 张路 王治国
2021-12-16

抗核抗体(ANA)筛查是全身风湿性疾病的血清学检查基本工具。ANA检测的高准确度及再现性是必不可少的。ANA分析历史上一直局限于手工间接免疫荧光(ANA-IIF)显微镜。常规技术的主要缺点之一是其低的重现性。主要原因是阅片者之间的变异,检测配置上的差异及批间变异。为了克服这个问题,已开发了基于免疫的ANA筛查试验。然而,由于这些试验只针对有限选择的抗原,它们不能完全代替ANA-IIF。为此,美国风湿疾病学会仍推荐ANA-IIF作为筛查试验。


今天,常规临床实验室已发展到高效和高度自动化的环境。这既是经济因素又是质量激励因素的结果,如,更加严格——通常是政府驱动的——实验室数据的重现性标准,越来越多的申请,试验有限的补偿,及实验室日益增长专业知识要求。这种演变伴随着适当的内部质量控制(IQC)系统的越来越重要。IQC系统应该允许更简单的分析过程的监测以保证实验室内实验室数据的连续性。然而,对于基于IIF的技术产生半定量的数据执行IQC系统是困难的。对于常规的手工ANA-IIF方法,通常通过监测IIF的模式及阳性和阴性控制(NC)样品的终点滴度来执行IQC。ANA-IIF可检测到的差值通常是±两个系列的两倍的稀释。因此,普遍认为在±1倍稀释的终点滴度的变化被认为是可以接受的。在实践中,这种标准也经常应用于IQC目的。然而,这种方法对试剂批号间的变异及自动玻片处理器(如,移液误差)的变异造成的过程漂移不够敏感。


最近,已有ANA-IIF阅读及解释的自动化方法。最近的研究表明自动化ANA-IIF分析的引进可以改进一致化。在某种程度上,可以预期这样的系统可为ANA-IIF分析的IQC管理提供新的可能性。


Zenit G-sight(意大利佛罗伦萨A. Menarini诊断公司)是一款基于IFF试验的影像采集与解释的自动化系统。在系统调焦期间评估ANA-IFF阳性/阴性解释以及基于概率测量[概率指数(PI)。这个PI是使用一组训练样品的统计量计算出的定量度量(及有关调整相机敏感度参数的更特异的统计量)。分析确认数据显示阳性样品PI批内及批间的可重复性是良好的。另外,已经证明由于发现PI与终点滴度之间显著的相关,PI促进了终点滴度读数的标准化。


在文中,介绍引入自动化IFF显微镜是否能改进当前ANA-IFF IQC管理。因此,我们评估定量度量(如,Zenit G-sight得到的PI)在常规实验室能否应用生化实验的室内质量控制程序。 



一、对象及样品



第一组是由2010年1月到2013年2月期间送到实验室做ANA检测的连续血清样品组成(n=19079)。在此期间,使用经典的显微镜来进行ANA-IFF检测(参见常规IFF分析)。第二组是由2013年2月到2013年10月中旬期间送到实验室做ANA检测的连续血清样品组成(n=3735)。对于这些样品,ANA-IIF进行自动化检测。


选择匿名的常规患者样品用做IQC材料。选择ANA阴性患者样品进行混合可作为阴性质控品(NC)。在2010年1月到2013年8月期间,使用了四种不同的NC样品。选择不同ANA-IIF模式的强阳性样品(颗粒型、均质型、核仁型)作为阳性质控品(PC)。在整个研究期间,使用了11种不同的PC样品。用于质量控制目的的所有患者样品在检测前分装并冰冻于-20℃。一旦解冻,质控样品要储存在2-8℃,最多2周。本文数量来自Carolien Bonroy, Charlotte Verfaillie, et al. Automated indirect immunofluorescence antinuclear antibody analysis is a standardized alternative for visual microscope interpretation. Clin Chem Lab Med 2013; 51(9): 1771-1779。



二、以前的IQC程序



对于第一组,每日的IQC使用NC及PC样品,在每批及在维持程序之后分析这些样品。表1中列出了可接受标准。为了增加IQC方法对过程漂移的敏感度,每月监测ANA阳性患者试验结果百分率并按照表1中列出的标准来评估。


表1 常规手工及自动抗核抗体间接免疫荧光程序的室内质控的接受性标准

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a应用的Westgard规则是12S(一个质控测量值超过均值±2s质控限)作为警告规则,及22S(2个连续质控测量值超过均值±2s质控限),13S(一个的质控测量值超过均值±3s质控限)及R4S(一组中的一个质控测量值超过均值+2s,另一个超过均值-2s)作为失控规则。


三、使用自动化ANA-IIF显微镜的IQC程序



对于第二组,能与常规IIF显微镜相比,一个NC及PC样品以及ANA每月阳性百分率被用于监测质量。此外,计算患者样品的PI每日中位数并绘制在Levey-Jennings图上。PI每日中位数是某一实验室一天中检测的所有日常ANA样品计算出的PI中位数(每批的平均样品量=36;GLIMS v.8.10.4;比利时根特市MIPS ©)。使每日PI中位数,而不是移动均值,是因为一天中获得的患者PI结果不是正态分布的(D ’Agostino-Pearson试验:p<0.05)。然而,每日PI中位数的每日监测是一个正态分布过程(D ’Agostino-Pearson试验:p>0.05),因此表1中列出的自动化ANA IIF分析的参数的IQC标准进行回顾性地应用。


四、以前的IQC数据集的描述



历史上,常规的天间IQC是基于如表1中列出的NC及PC结果的定性评估(强度得分及模式的评估)。当发现违规行为时,有对事件的预期及记录事件的原因。在2010年1月和2013年1月期间,进行了411次NC和PC测量。对这些数据的回顾性分析表明NC两次得分是阳性。在两种情况下,记录的偏离为NC等份分装的交叉污染,这是手工处理错误造成的。对于PC,应用IQC标准发现违反了三次:所有三种情况强度得分下降一个以上。其中两次,IQC失效的原因可追溯为自动移液工作站的误差。一次,是引入新批号的荧光缀合物造成PC更低的荧光。在所有情况下,在解决分析失效后重新分析这些批中的患者样品。

与此同时,监控每月ANA阳性百分比(见图1)。在执行这个IQC方法之前(2008年1月到2009年12月;n=11,982)在两年期间基于每月ANA阳性百分率计算靶均值(60.3%)及靶标准差(s)(5.3%)。剔除异常值之后用D’Agostino-Pearson’s检验对这些数据进行正态性检查(基于双侧Grubbs检验;p<0.05)。


通过应用表1中列出的Westgard规则,违反了两失控规则。2011年5月到7月间ANA阳性百分率明显增加,导致违背了一次22S及两次13S(见图1)。当时,识别增加的原因是双倍的。在2011年4月末引入了新批号的试剂,与这个引入相连接,具有核仁模式的患者样品量是三倍。此外,在2011年6月,自动移液系统的维护是ANA阳性样品百分率增加的前奏。作为纠正措施,我们在2011年8月重新使用手工移液,结果ANA阳性率减低了。更换自动移液的针头解决了这个问题。


2012年6月出现了导致负22S及13S的违背的第二次大的漂移。与这个漂移同时的是在2012年4月末引入新批号的荧光缀合物(见图1)。 

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图1 每月抗核抗体阳性百分率的Levey-Jennings图(n=19,079)

左侧的y轴表示针对靶值的Z分数(值);右侧的y轴表示每月ANA阳性百分率;x轴表示年和月份。单开圈表示警告规则;双开圈表示失控规则。水平线表示靶均值及标准差(s)。黑色箭头表示引入新批号试剂。




五、分析IQC管理的质控品材料的


概率指数测量值的适用性


在调查PI用于日常IQC目的的适用性之前,我们为2013年2月到2013年4月(n=30)间的PC样品(核仁型;CV=2.2%)和NC样品(CV=41.4%)规定靶CV。由于患者样品用作质控样品,靶值由自安装之后的前6个测量值推导而来。


从2013年5月到2013年10月中旬的PC和NC质控样品的PI结果绘制的图如图2所示。对NC样品推荐的质控规则没有违背,且在此期间PI保持稳定。对于PC样品,在评估期间,半途中总共违背了五次单独的12S警告规则(一个是正方向,四个是负方向)。6月24日对正方向12S警告规则的进一步调查揭示了人为不实的影响PI的读数(基于PI计算的原始图像的检查)。对于负方向12S警告规则的违背,也视觉检查初始图像:图像要么是模糊的,或是采取在不密集的区域的。然而,在读取这些批的患者样品中并没有遇到任何问题,且下一个常规批的PC样品的PI回到正常。在2013年8月,违背了22S失控规则。这种违背可追溯到通过经典显微镜检查确认的不均匀共轭分布。


从2013年9月末开始,发现对PC质控品推荐的质控规则有几次违背:在9月末连续违背了13S及22S失控规则,在10月初在接近的时间内违背了两次12s警告规则。在这个时期内,我们也记录了ANA-IIF与抗ENA试验结果之间散在的一些不一致。后者的发现引发了进一步的调查,且揭示了在我们移液设备水平上技术问题(就像使用着色液进行的精密度实验所证实的那样)。在这个期间,在NC及PC水平上并没有观察到可视的异常。


图2 阳性和阴性控制样品概率指数(PI)的Levey-Jennings图

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左侧的y轴表示PI;右侧的y轴表示针对靶值的Z分数(值)。单开圈表示违背12S(警告规则);双开圈表示违背22S,13s或R4s(失控规则)。水平线表示靶值及标准差(s)。



六、基于患者ANA结果的IQC监控:将历史


方法与使用每日患者PI的中位数比较


在图3中,绘制出自2013年2月引入自动显微镜以来的每日PI中位数和ANA阳性百分率。每个数据点都对应于评估日期。对于每月ANA阳性百分率,显示的百分率与在评估日期之前一个月的ANA阳性百分率相一致。两种方法都是按照表1中列出的IQC标准来评估的并相互比较。应用于评估每月ANA阳性百分率的标准是基于以前的靶均值及CV(见以前IQC程序)。为评估每日患者PI的中位数,标准是基于2013年2月到2013年8月间排除异常值之后计算得到的总均值(PI 17.1)及s(PI 6.0)(双侧Grubbs;p<0.05)。


图3 从2013年2月到10月每日患者概率指数(PI)中位数(小黑点)和每月抗核抗体(ANA)阳性百分率(大黑点)的Levey-Jennings图(n=2735)

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单开圈表明警告规则;双开圈表示失控规则。水平线表示总均值及标准差(s)。黑色箭头表示引入新批号试剂;虚线箭头表示引入新瓶的试剂。


对于ANA阳性百分率没有遇到失控规则。相反,自从引进自动化显微镜以来,每日患者PI的中位数有9次超出总体均值±2s界限。第一次主要违背(+13S)出现在实施一个月之后,并与2013年3月初引进新批号的荧光试剂同时发生。与之并行的是,在ANA阳性百分率上也观察到增加(有一些延迟,因为这个评估是每月进行一次)。然而,这个增加都是在表1中列出的事先确定的每月ANA阳性百分率的可接受限之内的。比较在执行新批号试剂之前(PI 11.5;n=548)及之后(PI 16.6;n=3187)的患者PI结果的中位数的深度分析揭示新批号试剂患者PI的中位数更高(p<0.0001;Mann-Whitney U)。并且与之前批号的试剂(52.3%;p<0.001;χ2= 32.085)相比,ANA阳性百分率升高了(60.4%)。第二次主要事件是在2013年5月显示连续违反了13S和22S规则。因为这个事件与2013年3月的事件有着相似的情形,我们进一步调查了是否有其他的变量(如,在同一批号中使用新一瓶的缀合物,病理级的改变影响)可能影响PI测量值。实际上,这第二次主要事件是与使用新瓶的缀合物并行的。即使在稳定化之后,也观察到了小瓶改变之前(PI 15.2, n=932)及之后的PI测量值统计学上显著性差异[PI 18.0,n=1128,p<0.01(Mann-Whitney U)]。相反,7月份的后半部分最后瓶的缀合物改变并没有对PI测量值产生显著的影响。

 



七、讨    论



今天,尽管方法上存在缺陷,美国风湿病学会仍然推荐ANA-IIF做ANA筛查。此外,这种经典的基于IIF的试验已知低重复性的缺陷,以及同时其推荐IQC方法(如,CLISI指南)与常规实验室适当的IQC系统日益增加的重要性是不相容的。当前CLISI对ANA-IIF分析的推荐集中在手工ANA-IIF显微镜的使用,以及是定性及/或半定量的(如,终点滴度):基于自制控制品评估的过程监控,基于对之前试验过的样品的选择的分析的检测试剂批号间比对及监测试验结果落在不同参考区间类别中(即,阴性或阳性)频率。本研究已经调查了引进自动化ANA-IIF显微镜多大程度上为ANA-IIF的IQC管理提供新的,更加定量,并更不客观机会。


在以前的数据集中,只识别到了很少并无关紧要的PC及NC的IQC偏离。相反,我们记录追踪到与试剂批号改变相匹配的ANA阳性百分率水平上的两个偏差。这些数据证实监控NC及PC数据对检测试剂批号改变并不敏感。这个问题只能通过监控这个方法的固有理论延迟及传统ANA-IIF的主观性导致的ANA阳性百分率来部分得到补偿。


作为经典方法的一个替代,我们评估获得定量测量(PI)的自动化ANA-IIF是否能提供一个有价值的替代来监控分析不精密度。这种想法由先前的观察得到支持,即PI测量值显示良好的批内及批间可重复性。我们的数据证实PC及NC的PI值可认为是平稳随机过程。因此,我们发现传统上使用的Westgard统计多规则的应用适合ANA-IIF测量值每日IQC跟踪。实际上,这些多规则在质控材料PI测量值上的回顾性应用揭示了推荐的方法能够探测到我们移液设备遇到的重现性问题(9月末到10月初)。这是特别重要的,因为用我们历史方法(PC及NC直观解释在可接受限内)没能识别出这个问题。


接下来,我们评价基于ANA-IIF患者结果使用每日患者PI中位数的IQC监控作为历史上应用的ANA阳性百分率监控的替代。患者数据的质量控制已用于血液学仪器的IQC来识别系统误差已有很多年。直到现在,这种概念对ANA-IIF还未得到描述。在本研究中,我们已经证明监控每日患者结果的中位数对于自动化ANA-IIF的质量管理是增值的。实际上,平行分析显示在检测系统误差(如,由于试剂质量的差异)方面每日中位数方法比监控每月ANA阳性百分率更快且更敏感。这对于当最初批号间比对方案未能检出改变时很有意义。 


从实际的角度看上面的数据,我们推建如下质量控制程序:

1)通过监控PI值及NC及PC的IIF模式(总是检查初始的影响以防模糊不清的图像及/或伪假象)来进行的分析过程质控;

2)计算每月的ANA阳性样品百分率;

3)基于每日患者PI中位数的患者结果IQC监控。图4以流程图阐述对自动化ANA-IIF推荐的IQC程序。


图4 基于自动化的抗核抗体间接免疫荧光(ANA IIF)结果的内部质量管理设计的推荐流程图(ANA,抗核抗体;ENA,抗可提取性核抗原抗体;IQC,室内质量控制;IT,信息技术;PI,概率指数)

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a警告规则(12S):检查自动化显微镜的初始图像,并基于包含在下一批中的质控品进行重新评估:失控规则(22s,R4s或13s):处理流程图

b检查分析步骤的所有步骤,包括移液工作站,手工处理及QC材料

c检查失控活动的临床影响(通过检查ANA阳性百分率的趋势,通过比较事件前及后鉴定试验生物ANA/抗ENA阳性样品百分率,来检查病人样品的来源)

d检查分析过程所有步骤,包括如移液工作站,手工处理,QC材料,及最近引入的新仪器,人员,IT及试剂批号



我们意识到这个建议可能引发一个关于“分析可达到”质量(允许检出系统偏离以前稳定性能的改变)与“可防御的”质量(与临床决策有关)之间的平衡的讨论。最佳的质量管理开始于需要实现质量的知识。一种观点可能是由于它是一种筛查试验,不能漏掉任何ANA阳性结果。然而,ANA-IIF假阳性的增加可能会引发ENA识别试验的过渡应用,这导致了更高的成本。此外,由于ANA-IIF的本质,合适的参考或质控物只有有限的可用。因此,常规实验室为了质量控制目的通常使用没有滴定靶值的患者标本。


传统上,允许总误差是不会使分析结果的医学有用性无效的可以忍受的总的误差量。对于ANA-IIF分析,这很难定义且很少出现在文献中(没有关于PI生物变异度的数据可利用)。因此,我们的建议聚焦在监控“可得到的”分析质量的稳定性,用的是我们实验室一般应用的Westgard规则(见表1)。在这个初级水平上的任何偏离应该引起进一步的调查以评估分析过程,及对患者ANA-IIF结果的临床影响(如,通过检查ANA阳性百分率的趋势,通过在一个事件之前及之后对比ANA/抗ENA和抗dsDNA(或特定的抗核抗体)阳性样品)。当在每日患者PI中位数水平上也检测到失控事件,我们认为后者尤其重要。在这种情况下,使用者应该评估对全过程有潜在影响的任何可能变量。这意味着,除了最常见的实验室差错(如,移液错误,手工处理错误,固有的QC材料偏差)之外,像引进新仪器及人员,实验室信息系统修改,试剂改变(更换瓶及批号改变)或病理分级变异都应该考虑在内。

 


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