个体化抗栓治疗与基因检测

·首都医科大学附属北京安贞医院检验科主任，硕士研究生导师

·卫生部全国临床检验标准委员会委员

·中国医院协学会临床检验管理专业委员会委员

          袁慧        ·北京中西医结合学会检验分会副主任委员、首都医科大学检验医学系委员、北京医学会检验分会委员等

心血管系统疾病主要包括高血压、动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等，是严重威胁人类健康和导致死亡的重要原因。上述疾病的治疗包括药物治疗、手术治疗、介入治疗等多种手段。药物治疗对于心血管系统疾病的预防、控制、延缓均具有重要意义。目前临床上常规使用的抗凝药、抗血小板药、降脂药、血管扩张药等普遍存在个体差异现象，即相同剂量有的患者无效，有的患者却由于过量发生药物不良反应，给患者的生命健康带来巨大威胁。随着药物基因组学研究的深入，开展与药物疗效相关基因多态性检测，可以为临床选择合适的药物种类及药物剂量提供遗传证据，有可能在最大程度上指导心血管药物的个体化应用。

阿司匹林是最为常见的抗血小板治疗药物，至今已经有一百多年历史，最初用于抗炎、解热和镇痛，但在上世纪70年代其抗血小板作用被发现后，阿司匹林就被广泛应用于降低急性心肌梗死疑似患者的发病风险、预防心肌梗死复发、中风的二级预防、降低短暂性脑缺血发作TIA及其继发脑卒中的风险、降低稳定性和不稳定性心绞痛患者的发病风险等。

阿司匹林经肠道吸收后很快被代谢成为活性产物水杨酸，随血液分布全身。水杨酸可以与血小板内的环氧合酶（cyclooxygenase, COX）活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应，使酶失活，抑制花生四烯酸（arachidonic acid, AA）的代谢，从而抑制血栓素A2（thromboxane A2, TXA2）的生成，血栓素A2能够诱导血小板使其发生聚集反应，而血栓素生成受到抑制则可以很好地起到抗凝作用[1]。

虽然阿司匹林被广泛应用于抗血小板治疗，但是部分患者在服用常规剂量的阿司匹林后未达到预期的效果，这种现象被称为阿司匹林抵抗（Aspirin resistance, AR）。目前，阿司匹林抵抗主要分为两种，临床和实验室阿司匹林抵抗[2]。临床AR指常规服用阿司匹林后未达到抗血小板的治疗效果，实验室阿司匹林抵抗是指在服用阿司匹林后血小板抑制率未达到预期的水平。由于阿司匹林药效的发挥受到诸多因素的影响，其产生的机制尚不明确，对于阿司匹林抵抗的界定还未有统一标准。研究显示临床上阿司匹林抵抗的发生率在5%-60%[3]。

近年来，越来越多的研究显示，遗传因素可能是阿司匹林抵抗的一个重要原因。

阿司匹林是非选择性的COX酶抑制剂，COX-1是其主要底物酶，为组织结构酶，在多种组织中表达，在无核组织血小板中同样有表达。COX-1基因功能上类似于看家基因。COX-1基因位于第9号染色体9q32-33.3上，序列跨度为22kb，由11个外显子和10个内含子组成。李晓利等纳入59例阿司匹林抵抗患者，检测COX-1 6个SNP位点：rs1888943、rs1330344、rs3842787、rs5787、rs5789和rs5794。结果显示突变COX-1单体型CGCGCC显著增加了阿司匹林抵抗的发病风险[4]。但是Kranzhofer等通过研究认为阿司匹林抵抗与COX1/2基因多态性无关[5]。

血小板糖蛋白（GPIIb//IIIa）的基因多态性：血小板膜糖蛋白IIb/IIIa复合体（GPIIb/IIIa）是纤维蛋白原的受体，它介导血小板的聚集，GPIIIa亚基PLA存在多态性，表现为PLA1/A1和PLA2/A2纯合型、PLA1/A2杂合行。超过30%的心血管病患者为PLA2/A2纯合型，许多研究证实PLA2/A2纯合型与血小板活性增强有关，此型患者应用阿司匹林之后的抗血小板作用较差，说明此种单核苷酸多态性可能促成阿司匹林抵抗。迄今已发现5中GPIIIa的多态性[6]。jerzy dropinski等研究发现，在PLA1/A1型患者中，服用阿司匹林能够抑制凝血酶的生成，出血时间也延长[7]。

目前，阿司匹林抵抗的药物基因组学的研究相对较少，不同的基因多态性与之是否具有相关性还存在许多争论，依据阿司匹林代谢通路上相关基因的多态性类别进行个体化用药还有待深入研究。

急性冠状动脉综合征（Acute Coronary Syndrome, ACS）是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征。据世界卫生组织（WHO）估计，到2020年，急性冠状动脉梗塞性疾病将是世界上主要的致死原因。

经皮冠状动脉介入（PCI）术是治疗急性冠状动脉综合征的主要手段，然而支架本身会激活体内的血小板，激活之后聚集到血管支架安放的位置，重新引起血管栓塞，所以必须应用有效的的抗血小板药物阿司匹林片和/或氯吡格雷。大量的研究和长期的临床实践表明氯吡格雷联合阿司匹林在ACS尤其是行PCI术患者中具有显著的抗栓治疗作用，已被写入各大治疗指南中，成为PCI术后患者预防血栓的金标准[8]。许多临床实践发现，患者对于氯吡格雷的疗效有着较大的差异，部分患者尽管长期服用常规剂量的氯吡格雷，但是不能有效的抑制血小板聚集，增加了心血管不良事件发生率，临床上常将此现象称为氯吡格雷抵抗（CR）。有报道称大约5%-44%以上的患者未从常规剂量的氯吡格雷治疗中得到足够的抗血小板效果[9]，氯吡格雷抵抗与多种因素有关，如遗传因素、药物之间的相互作用、基础血小板反应性、以及疾病的状态等，而遗传因素起到主要作用。氯吡格雷是一种前药，本身无活性，必须通过肝脏内的一种叫做CYP2C19的肝药酶的代谢，才能转化为具有药效的活性状态，发挥抗血小板凝集的作用[10]。而CYP2C19的代谢活性在不同人中差异性非常大，在中国人中大约有14%的人是CYP2C19弱代谢型[11]，而弱代谢型患者服用氯吡格雷后依然处于心脏病发作、卒中以及死亡的高风险。

CYP2C19基因存在SNP现象，CYP2C19的突变位点有很多，已经测得36个。其中CYP2C19*2（681位单碱基变异G→A）和CYP2C19*3（636位单碱基变异G→A）可以使CYP2C19酶失活，且这两个多态性位点在东方人中可解释接近100%的弱代谢（PM）表型[12]，其中，对于CYP2C19*2携带者的用药方案已有多项研究涉及，*3在高加索人中分布频率少于0.5%，鲜有国外研究提及*3携带者的用药方案，在国内研究较多，*17虽有研究涉及，但大多数没有明确结论[13, 14]。根据CYP2C19基因型的不同可将人群分为快代谢（*1/*1），中等代谢（*1/*2, *1/*3），弱代谢（*2/*2,*2/*3, *3/*3），它们在中国人中的频率分别为42.4%，43.4%和14.2%[11]。

对于CYP2C19功能缺失型患者，其氯吡格雷转化为有活性的代谢产物大大降低，减弱了抗血小板聚集的能力。CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型为弱代谢型，氯吡格雷弱代谢型患者必须满足两个等位基因同时携带弱代谢基因，才会导致氯吡格雷代谢活性降低，抗血小板聚集效果不佳，导致血栓事件，只有通过进一步增加氯吡格雷剂量才能提高抗血小板聚集的效果，避免氯吡格雷抵抗现象的出现。据研究显示，这一现象发生率在中国约为14%，黑种人中约为4%，白种人中约为2%。

Sibbing对2485例冠状动脉支架置入的患研究发现：至少携带一个*2等位基因的患者发生支架内血栓的概率明显高于野生型(1.5% vs. 0.4%，HR 3.81, 95%CI 1.45-10.02; P=0.006)，同时发现CYP2C19* 2 /* 2 纯合子发生支架内血栓的概率最高( 2.1%, P=0.002)。得出的结论是，CYP2C19*2携带者在PCI支架置入术后发生支架内血栓形成的概率明显升高[15]。Trenk等针对797名PCI支架置入后患者的研究发现：携带一个以上CYP2C19* 2基因的支架置入术后的患者与不良临床预后有相关性，更容易出现氯吡格雷抵抗[16]。Servico de Cardiologia认为CYP2C19*2在急性动脉综合征人群中是中期的预后标志物[17]。Ilana Spokoyny通过研究后发现，慢代谢和中间代谢心脑血管疾病患者在服用氯吡格雷是有复发性脑血管事件的风险，因此常规检查CYP2C19基因型可能是必须的[18]。2012年，上海中山医院发表论文，证明*3携带者与*2携带者一样，会降低氯吡格雷疗效[19]，但对*17、ABCB1基因3435变异携带者，仍无明确结论[20]。同年，南京医科大学附属第一医院发表论文，证明*2和*3卒中患者ADP介导的血小板最大聚集率（MPA）均高于野生型患者[21]。2013年阜外医院等联合发表文章，证明在PCI手术之前，服用300 mg初始剂量的氯吡格雷比75 mg维持剂量效果要好，尤其在*2和*3患者，效果更佳显著[22]。

2.3.1通过检测识别CYP2C19基因位点的多态性，来评估判断患者使用氯吡格雷治疗的有效性，这样有利于患者的个体化治疗并有利于降低心血管事件的发生风险。尤其对于药物脱洗支架植入术后冠心病者，需要服用氯吡格雷（1年）预防血栓形成，减少心血管事件发生率。氯吡格雷抵抗的出现，增加了其心血管事件发生率，降低了患者生存率，增加了死亡风险。2010年，美国FDA要求在波立维说明书中加入“黑框警告”，旨在提醒临床医生，正在服用氯吡格雷药物的患者中某些可能因为氯吡格雷代谢不良易引发心血管事件，对于高危患者通过采用基因检测来判断该患者是否存在CYP2C19基因多态性造成氯吡格雷代谢不良，从而采取相应措施改善患者抗血小板治疗，达到最佳临床效果。

2.3.2已经使用氯吡格雷本常规推荐剂量时，CYP2C19*2和CYP2C19*3携带者需要增加氯吡格雷剂量，以增强抗血小板效果。但是目前还缺乏统一的模型，准确地计算出携带低功能代谢基因患者服用氯吡格雷的剂量。目前，只有根据基因检测的结果结合患者其它高危因素，由临床医生综合分析判断，给出氯吡格雷最佳服药剂量。综合各论文观点，主要有以下三种：

EM（CYP2C19野生型，快代谢者）给予常规剂量；

IM（CYP2C19杂合型，中等代谢者）可给予双倍、甚至四倍剂量；

PM（CYP2C19突变型，慢代谢者）可能疗效不佳，应考虑增加剂量或更换其它抗凝血药物，目前主要为阿司匹林、西洛他唑、氯吡格雷三联疗法或者换用替格瑞洛或者普拉格雷。

氯吡格雷作为一个抑制ADP受体的抗血小板药物，能明显减少血栓事件的发生，但其作用存在个体差异性。基因多态性可能是其决定性因素，CYP2C19基因多态性目前已经得到分子诊断学证实，但是CYP3A4、CYP3A5、P2Y12等基因多态性对氯吡格雷的代谢活性及靶作用可能也有着重要影响。美国心脏病学会（American College of Cardiology, ACC）/美国心脏学会（AHA）根据美国FDA“黑框警告”提出相关建议：目前，应严格遵循现行的冠心病抗血小板临床治疗指南，强调氯吡格雷对急性冠脉综合症患者的有效性，同时要重视不同的ACS患者对氯吡格雷反应的表现，需要对具体患者判断和评估氯吡格雷抵抗可能造成的风险，并积极给予相应处理。目前尚不推荐对所有的冠心病患者进行常规的基因检测，临床上绝大多数服用氯吡格雷的患者临床疗效非常显著，因此对需要进行氯吡格雷基因检测的患者需要一定的选择性。对于症状持续发作，心血管风险不断增加，而且预后较差的患者，包括对接受风险高的广泛冠状动脉病变和复杂病变形PCI治疗的患者，在开始用氯吡格雷之前，可以考虑进行基因检测，有助于明确是否存在携带氯吡格雷低功能代谢基因。

华法林（warfarin）作为临床应用最广泛的口服抗凝血药，常以消旋混合物形式用于抗凝治疗。但由于其治疗窗窄，个体差异明显且影响因素多，抗凝不足，血栓栓塞率可增加数倍以上；抗凝过量可导致出血，长期用药其出血发生率约为4%，出血危险性可达1%~5%。据统计，华法林抗凝不足引起的栓塞及抗凝过量所致的出血占心脏瓣膜术后远期并发症75%[23]。目前，华法林剂量的调整主要凭借临床经验并结合国际标准化比值（International normalized ratio，INR），但这可能存在一定盲目性，增加患者用药风险。因此，如何科学掌握和调整华法林给药剂量，优化华法林给药方案已成为临床亟待解决的问题。

随着遗传药理学和药物基因组学的发展，人们逐渐认识到遗传因素是导致华法林个体剂量差异主要的原因。目前已知与华法林药动学和药效学相关基因达30余种[24]，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1（Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）和细胞色素P4502C9（Cytochrome P4502C9，CYP2C9）基因多态性是华法林个体剂量差异的主要影响因素，分别解释约37%和6%的剂量差异[25, 26]。

华法林在体内主要通过CYP2C9代谢，负责编码CYP2C9基因存在野生型CYP2C9*1和突变型CYP2C9*2~CYP2C9*13[27]，其中与华法林代谢最密切的突变型为CYP2C9*2和CYP2C9*3，这些基因突变后可改变代谢酶结构，导致酶活性降低，华法林代谢能力减弱，使华法林给药剂量明显减少，导致华法林出血风险增加。携带CYP2C9*3等位基因患者华法林维持剂量降低30%，同时携带CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因患者出血危险性提高2倍[28]。虽然CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因突变在华法林的代谢中起很大的作用，但国人的这两种基因突变频率较低，但突变基因频率文献报道差别很大。中国汉族人群90%以上为CYP2C9*1/*1（AA型），CYP2C9*2的突变型稀有或缺失，CYP2C9*3的突变型也仅有1%~4%[29]。

华法林通过特异性抑制VKORC1，阻断凝血因子的活化而发挥抗凝作用。VKORC1在其启动子区存在-1639G/A位点多态性。Yuan等[30]研究发现，与携带VKORC1-1639A等位基因患者比较，携带VKORC1-1639G等位基因患者VKORC1 mRNA及蛋白表达水平增加，引起VKORC1活性增高，凝血因子合成增加，导致华法林的维持剂量显著提高。Yang等[31]研究认为携带VKORC1-1639G等位基因患者华法林日均剂量增加61%。中国汉族人群中携带VKORC1-1639A等位基因频率可高达90%以上，这也是导致中国人华法林剂量低于欧美国家人群的主要原因。亚洲人群VKORC1-1639AA、GA、GG基因型频率分别为80.4%、18.3%和1.3%，而西方高加索人群分别为16.3%、48.9%和36.7%。Zhu等[32]的研究中也发现VKORCl的1639位基因型为GG、GA、AA患者华法林的日维持量分别为(6.7±3.3)mg、(4.3±2.2)mg、(2.7±1.2)mg，说明携带AA基因型的患者和携带GA和GG基因的患者相比，华法林的稳定维持量要低。

美国食品与药品监督管理局（Food and drug administration，FDA）于2007年8月修改华法林用药标签，提示CYP2C9和VKORC1基因型检测有助于调整华法林给药剂量。以CYP2C9和VKORC1基因为导向的药物基因组学剂量预测模型的研究和建立成为近年来人们普遍关注的焦点。研究显示，基于CYP2C9和VKORC1以及一些非遗传因素构建的药物基因组学模型，可解释约40%~60%华法林剂量差异[33]，大大优化了华法林抗凝治疗方案。国际华法林药物基因组联合会（International warfarin pharmaeogenetics consortium，IWPC）收集了5700例来自4大洲9个国家的21个研究机构使用华法林达到稳定临床疗效的患者信息，并建立数据库。Klein[34]等对此数据库进行筛选和验证，建立了IWPC模型，可解释华法林个体剂量差异的31.4%。IWPC模型涉及多中心、多种族，是目前涉及病例规模最大的模型，许多医疗机构及心脏中心均参照此模型指导华法林抗凝治疗。

尽管目前已证实CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法林需求剂量的个体差异有关，但是华法林剂量变异的40％仍不很清楚。有学者发现编码维生素 K依赖性凝血因子Ⅱ的基因突变165 Thr>Met，VII 因子基因突变-402 G>A和Y-谷氨酰基羧化酶（GGCX）基因多态性与日本人对华法林的敏感性存在相关性[35]。载脂蛋白E，蛋白质C，微粒体环氧化物水解酶和维生素环氧化物还原酶复合体其它亚单位的基因多态性也可能与华法林需求剂量的个体差异有关有关[36]。这些基因多态性可能会更加完善基于遗传药理学的华法林给药方案，进而实现华法林的个体化用药。

硝酸甘油常用药治疗心绞痛的急用药物，其能够进入血管平滑肌细胞，在膜上或膜附近经过线粒体乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase, ALDH2）的代谢，形成一氧化氮（NO），NO通过鸟苷酸环化酶促使钙离子进入肌浆网和细胞外，造成血管平滑肌扩张，从而缓解心脏缺血症状。在临床上，存在硝酸甘油耐药现象，即连续使用硝酸甘油药物48—72小时后，其抗心肌缺血及扩血管效应降低或消失的现象，目前存在许多可能机制，遗传因素是其中可能的原因之一[37]。

ALDH2是ALDH的同工酶，存在于线粒体上，具有氧化乙醛生成乙酸的作用。最近发现ALDH超基因家族中包括19个功能基因和3个假基因，其中ALDH2其家族中醛类代谢活性最强的同工酶[38]。由于ALDH2存在84个单核苷酸多态性位点（SNP），其中其中在外显子12的多态性位点编码的ALDH2 Lys504Lys型（*2/*2）使ALDH2的氧化活性大大降低，影响了酶活性的正常发挥。在人群中主要分为三类：ALDH2 *1/*1（酶活性100%）; ALDH2*1/*2（硝酸酯酶活性8-15%）; ALDH2*2/*2（硝酸酯酶活性6-7%）[39]。大约40%的东亚人携带ALDH2*2位点[40]。在中国汉族人群中，*2携带率17%-36%不等[41]。

动物体内体外研究显示，采用ALDH2抑制剂能够部分抑制硝酸甘油的作用。证实了ALDH2活性能够影响硝酸甘油的药效发挥[42, 43]。上海复旦大学一项针对80位服用硝酸甘油的患者的研究显示，ALDH2*1/*1患者服用硝酸甘油的无效率为14.9%，而ALDH2*2携带者（*1/*2、*2/*2）服用硝酸甘油的无效率达到了42.4%[39]。然而在上述的研究中，使用ALDH2抑制剂或者天然的ALDH2突变都无法使硝酸甘油完全失效，证明硝酸甘油在体内还有其他的代谢途径。因此，ALDH2基因型只是从遗传的角度解释硝酸甘油耐药的机制，但鉴于ALDH2*2/*2硝酸甘油无效率较高，建议跟换其他硝酸脂类的药物，避免用药无效带来的风险。

几年前就有人提出了“4P”医学模式，即预测、预防、参与以及个体化医疗，精准医疗成为第五个P。精准医疗就是以个人基因组信息为基础，根据个体独特的遗传变异，为患者量身设计最佳治疗方案，选择合适的药物和剂量，以达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。因此相较传统医疗，精准医疗具有针对性、高效性及预防性等特征，将开启个体化医疗的新时代。

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