尿白蛋白测量方法间的变异性

1 简  介

持续的尿液白蛋白（uALB）排泄是早期糖尿病性肾病的指标。不仅如此，升高的uALB浓度已经证明与糖尿病患者和非糖尿病患者的心血管疾病有关。全球肾病预后改善计划（KDIGO）慢性肾病（CKD）工作组和美国糖尿病协会（ADA）公布的临床实践指南建议：评估随机尿样中的尿白蛋白-肌酐比率（uACR，mg白蛋白/肌酐）来对肾损伤进行分类。而且，白蛋白排泄率能区分正常/轻微蛋白尿（<30mg/g），中度蛋白尿（30-300mg/g）和严重蛋白尿（>300mg/g），还可以利用这一比率帮助CKD预后和治疗。

在临床实验室中通常使用免疫比浊法或免疫浊度测定法定量uALB。Beckman Coulter最近为AU系列设备改良了他们免疫比浊法uALB试剂将AMR提高到30-45mg/dL。制造商还声称提高了测量600-2000mg/dL uALB浓度的信心。处于这个浓度时，由于存在超量抗原，多克隆抗体饱和产生“钩状”效应。这阻止了高阶免疫复合物，从而生成了比根据真实抗原浓度应该生成的光散射信号低的信号。1990年第一次出现了uALB免疫比浊法测量出现了钩状效应的记录，当uALB>50m/dL时，测量浓度被人为降低。uALB钩状效应仍是一个潜在问题。2012年，Pullan和Hitch引进了自动化实验室计算机标记算法来检测AU2700上潜在感染超量抗原的uALB标本；简而言之，符合uACR和总蛋白量标准的尿液标本在报告uALB浓度前进行人工稀释。有钩状效应倾向的AU uALB试验配方的改良尚未被系统评估，据我们所知，还没有研究比较过现代uALB试验的钩状效应。

表1. 6种商购尿白蛋白试验的分析技术规范

2材料和方法

2.1 研究样品

来自华盛顿大学的残存的、去除识别标志的尿液和血清样品用于所有研究。此次研究作为华盛顿大学检验医学分部正在进行的质量保证/治疗改进研究的一部分，因此未考虑人类受试者研究。

2.2 仪器/试验技术规范

分别在华盛顿大学（西雅图）、西北医院（西雅图）、圣保罗医院（温哥华）、佛罗里达大学（盖恩斯维尔）和西雅图儿童医院（西雅图）的Beckman Coulter AU680、Siemens Vista、Siemens BN II、Roche Cobas 和Siemens DCA Vantage 上执行uALB定量。免疫比浊法和免疫比浊测量法uALB试验利用多克隆抗白蛋白抗体生成光散射。特殊试验分析参数详见表1。

2.3 精密度

使用2个浓度的商购质控材料执行精密度实验。日间精密度试验包括对每个浓度进行20次连续测量。通过连续20天，每天分析每个浓度1次来评估隔日精密度。

2.4 线性/可报告范围

使用高患者尿液样品（49.4mg/dL）确认制造商标称的AMR（0.7-45mg/dL）内的线性。这个样品使用可检测的（<0.7mg/dL）尿液样品稀释，生成多个相对浓度：100%、75%、50%、25%和10%。一式三份分析每个标本，基于100%样品将测得的浓度与期望浓度比较。为了扩大超过AMR上限的可报告范围，通过回收研究评估10倍和51倍稀释液。对于10倍浓度的稀释液，纯标本用水进行10倍机载稀释之后（期望值4.69和3.89mg/dL的10倍浓度），测量2个尿液标本（46.93和38.87mg/dL）。每个样品重复该过程3次，计算相对于纯标本的经过稀释的标本回收物。对于51倍浓度稀释液，用水进行10倍机载稀释（期望值：37.53和38.51mg/dL的10倍浓度），人工使用盐水稀释到51倍浓度（期望值：7.36和7.55mg/dL的51倍浓度）之后，测量2份尿液标本（3750.30和385.10mg/dL）。每个样品稀释该过程2次，计算相对于10倍稀释标本的51倍稀释的标本回收物。

2.5 分析灵敏度

使用公式LoB=平均值空白+3×SD空白计算空白限（LoB）。使用连续测量20次水的测量结果测定平均值和标准差（SD）。

2.6 方法比较

使用78份残留的、去除识别标志的尿液标本评估试验间变异性。在Beckman CoulterAU680上比较原始试剂和配方改良试剂。该设备支持的样品量为（n=74），标本经冷藏运输到西北医院（西雅图）使用Siemens Vista进行分析。

2.7 钩状效应

使用5个平台和6种uALB试剂评估钩状效应。通过添加血清到存在白蛋白的残留尿液样品中制备一系列的样品（n=12；最终白蛋白浓度=0，14，28，55，110，220，440，880，1760，2640，3520，或4400mg/dL）。分析前样品分成等份并储存在-20℃环境中（冷冻7天）。通过华盛顿大学根据各个机构的物质运输协议将样品运输到合作机构。解冻样品，按需测量纯样品和稀释的样品，获得每个试验的AMR内的结果。所有设备每个样品测量至少2次。使用制造商要求的稀释液执行稀释（表1）。使用适当的稀释因数计算最终值。

2.8 统计

使用结合了EP Evaluator（Data Innovation）和cp-R临床化学软件的方法完成全部统计工作。

3结  果

3.1 精密度

日间和隔日精密度结果见表2。观测到的试验间不精密度（4-8%CV）略高，但是仍可与制造商标称的期望不精密度（<10%）和原始uALB试剂（3-4%CV）比较。尽管不精密度类似，但是配方改良试剂证明在比较2种试剂的QC平均值时，配方改良试剂呈现显著的阳性。对水平1和水平2而言，配方改良试剂报告的值分别高于生产的试剂+1.24mg/dL（+64%）和+2.39mg/dL（37%）。

3.2 线性/可报告范围

Y轴截距的斜率范围为1.017和-0.774，在制造商标称的AMR内验证线性。比较10倍机载稀释物和2个一式三份分析的纯样品测量结果证明平均回收率为101.4%（SD=2.5%），不是一直的负或正偏移。10倍机载稀释物超过可报告范围上限，达到450mg/dL。比较人工

稀释和2份一式三份分析样品的机载稀释物表明平均负偏移为7.6%（SD=3.0%）。51倍人工稀释物超过可报告范围上限，达到2295mg/dL。

3.3 分析灵敏度

空白限为0.00mg/dL，与制造商标称的0.00mg/dL的空白限相互印证。

3.4 方法比较

将Beckman Coulter AU配方改良uALB试剂与上一代AU uALB试验（Beckman Coulter原始试剂）和Siemens Vista uALB试验（图1）比较。78份残余患者尿样集合，配方改良试剂证明平均正偏移为13.53mg/dL或10.6%（戴明斜率=1.11，Y轴截距=0.19mg/dL，图

1A）。使用Siemens Vista平台分析了大部分患者样品（n=74）。Siemens Vista证明了相对于AU试验的正偏移。相对于配方改良的AU试剂，Siemens Vista具有15.21mg/dL或+10.7%的正偏移（戴明斜率=1.15，Y轴截距=-6.49mg/dL，图1B）；相对抑郁原始AU试剂，Siemens Vista试验具有28.60mg/dL或+21.2%的正偏移（戴明斜率=1.28，Y轴截距=-5.31，图1C）。

图1.（A）AU配方改良和原始试剂（n=78），

（B）Vista和AU配方改良试剂（n=74）和（C）Vista和AU原始试剂（n=74）之间uALB浓度的方法间变异性。

图2.（A）配方改良Beckman Coulter AU试剂盒（B）原始Beckman Coulter AU试剂，（C）Siemens Vista，（D）Roche Cobas，（E）Siemens BN II 和（F）DCA Vantage的钩状效应。点线描绘每个试验的AMR。不用稀释，每个标本至少一式两份进行测量。开放圆圈为试验AMR测量平均值，封闭圆圈为超过试验AMR的测量平均值。可能的话，使用超过上述AMR的uALB稀释Siemens获得AMR内的结果（数据未显示）。

3.5 钩状效应

在原始和配方改良Beckman Coulter AU试验以及4种额外商购uALB试验中描述了钩状效应（2）。对Beckman Coulter 试验而言，uALB浓度超过3000mg/dL导致原始和配方改良AU试验 测量的uALB浓度假性下降（表3和图2A，B）。对其他试验而言，DCA Vantage显示出最大的钩状效应倾向（>500mg/dL），但是Vista、Cobas和BN II受高uALB浓度的影响相对较大（表3和图2C-F）。

表3. 在分析的6种试剂中纯样品的测量浓度（mg/dL）。基于浓缩程度最高的样品获得的一系列稀释物浓度最接近期望的浓度。稀释这种“原始”样品，直到获得位于配方改良和原始AU试剂AMR以内的值，利用这些测量值的平均值评估其他样品的期望浓度。可能的话，即使纯样品结果超过了AMR，结果如列出的数字所示。此外，在情况适当时，稀释样品直到获得位于AMR范围内的值（数据未显示）。

表3

4讨  论

配方改良的AU uALB试剂符合制造商标称的性能特征。和其他制造商的配方改良uALB试剂类似，主要目标是扩大AMR。基于2年的历史uALB结果（n=19945），uALB AMR从30上升到45mg/dL应该降低16%的执行机载稀释数量。同样的，超越分析仪机载性能标本的人工时数数量应该减少52%，这是提高高度自动化实验室结果质量和总体效率的重要因素。观测到的一个显著现象是：2种AU试剂间的偏移显然是通过QC材料和患者标本得到的。不同厂商方法的比较证明测量的uALB浓度存在差异。相对于原始和配方改良AU试剂，Siemens Vista证明平均正偏移分别为~21%和~11%。uALB试验显然不标准，目前既没有参考材料又没有参考测量程序。建议根据临床决策点进行结果解析。由于尿白蛋白排泄是典型的纵向监测，一系列非标准试验的uALB测量能改变疾病预后的分析，并潜在导致临床管理活动的不当更改。实际上，即使在我们用于方法比较的小型患者样品集合中，4%的样品会因使用原始AU试剂被分为中度蛋白尿（30-300mg/g肌酐），因使用配方改良AU试剂被分为严重蛋白尿（>300mg/g肌酐）。比较使用2种最不相同的试验原始AU试剂和Siemens Vista试验生成的结果时，患者样品归类发生变化的比例会翻倍达到8%。一项涵盖超过2000名普遍健康实践者的国际调查表明尿白蛋白中值33%的变化会被视为具有临床重要性。我们观测到的方法间偏移，在结合分析不精密度和个体内变异时，能导致uALB解析的分析后错误。国家肾病教育计划（NKDEP）和国际临床化学联合会（IFCC）正在为标准化尿白蛋白测量而努力，并将改进CKD评估的效果。

钩状效应是正确uALB定量和随后临床解析存在的潜在问题。免疫比浊和免疫比浊测定试验在抗原过量时结果出现的假性偏低倾向已经被大范围的生理常数如uALB广泛记录。在uALB浓度大于3000mg/dL时，AU上的配方改良试剂的观测结果显然在AMR内，这会潜在导致肾源蛋白尿显示为非肾源。值得注意的是，对于没有标记高白蛋白样品策略的试验，如此处研究的AU试剂，超过AMR范围可能会实际隐藏感染过量抗原的样品检测。例如，一份具有高尿白蛋白，发生钩状效应，浓度为35mg/L的样品使用AU试剂时会触发机载稀释，但是使用配方改良的AU试剂则会错误地报告为35mg/dL（图2A，B）。无论如何，我们通过AU观测到的能导致这些假阴性结果的uALB浓度在容易受到钩状效应影响时，高于制造商标称的值。Siemens的BN II和Vista设备在任何检查的uALB浓度不会受钩状效应影响。Roche Cobas的“前带检查”功能确保标记出受过量抗原影响的标本，能够在稀释时避免报告假性偏低uALB浓度。DCA Vantage在标本的白蛋白浓度介于500-1000mg/dL时生成的结果位于AMR内，在所有被检测的试验中，这个试验是生理uALB浓度最容易受钩状效应影响的试验。

蛋白尿是最早用于CKD的标志物之一，尿白蛋白排泄的变化能表明疾病进展或疗法效果。一些分析因素如试验间变异性和钩状效应能干扰可靠的尿白蛋白测量，这二者都是尿白蛋白测量不容忽视的。

（摘自Clinica Chimica Acta，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：王小茜