胱抑素C标准化减少了试验变异性 和改善了肾小球滤过率的评估
1简 介
自从Grubb及其同僚的第一次阐述以后，胱抑素C（cysC）对于估计GFR的作用越来越重要。大型人群试验已经证明与仅仅基于肌酐的GFR方程相比，基于胱抑素C或综合（包括胱抑素C和肌酐）的方程具有附加价值。与血清肌酐相比，胱抑素C的主要优势是它对肌肉质量的依赖程度较低，而且在预测ESRD风险和死亡率时效果更好。此外，已经有证据显示GFR方程估计GFR的准确度高于单纯测量GFR。肾病全球预后改进计划（KDIGO）建议对肌酐GFR值介于45-59mL/min/1.73m2的患者使用基于胱抑素C的GFR方程确认慢性肾病（CKD）的诊断。在估计GFR的情况下，生物标志物测量方法的标准化非常重要。一些文章已经指出基于肌酐和/或胱抑素C的GFR估计缺乏标准化校准会产生不良影响。因此，肌酐试验标准化过程已经有了很大进步。目前大部分的肌酐酶促试验已经通过质谱标准化，可以称之为可溯源IDMS（同位素稀释质谱）。为了达到和肌酐相同的标准化水平，必须在参考材料中规定胱抑素C准确定量的参考方法和国际标准。胱抑素C试验标准化的一个重要步骤在2010年已经完成，国际临床化学联合会（IFCC）工作组已经为制造商制定了国际认证参考材料ERM-DA471/IFCC。而且最近已经发表了针对胱抑素C的ID/LSMS方法，支持在IFFCC标准中进行胱抑素C浓度精确测定。但是，最近的文章表明使用市场上出售的不一致的材料导致了一些人对一些胱抑素C试验准确度的怀疑：Grubb等人表示可以再现不同胱抑素C试验的变异性，但是这些乐观的结果还没有被其他研究者确认。举例来说，Eckfeld等人分析了来自132家实验室的胱抑素C结果，发现了胱抑素C结果存在很大偏移并断定制造商需要改进其胱抑素C测量和校准程序。
目前研究的目标是研究欧洲2种常用胱抑素C试验（西门子浊度和罗氏比浊法）间的分析差异，进而研究校准对互换性的影响。第二个目标是通过试验研究2种常用胱抑素C方程CKD-EPI和CAPA的估计GFR的区别。最后，我们使用柏林倡议研究（BIS）（一项老年CKD流行病学人群研究）的血样比较这些试验对基于胱抑素C方程的准确度的影响来评估测定GFR。
2材料和方法
2.1 研究参与者和特征
目前研究的参与者是BIS的一部分，BIS研究开始于2009年，这项研究的参与者接纳和排除标准以及研究涉及和目标的详细信息随处可见。2010年1月份至2011年6月间招募了2069名参与者进行基准访问，到2013年，这些参与者中的1699名接受了长达2年的随访。在初始的2069名受试者中，2065人进行了基准双重胱抑素C测量（西门子浊度和罗氏比浊法分析），1601人在2年随访中接受了双重胱抑素C测定，具有双重测量点的受试者样品总计为3666份。此外，在子研究中2069名基准参与者中的570名，我们执行了碘海醇血浆清除进行精确GFR测量。在这570名受试者中，567人接受了双重胱抑素C测量。简而言之，静脉注射5mL碘海。注射后5小时在8个时间点在对侧手臂采集血样。在Hitachi HPLC系统上使用二极管阵列检测器进行高效液相色谱分析。使用血浆浓度与时间的受试者操作特征曲线下面积计算GFR。Equalis（瑞典乌普萨拉市Equalis AB）提供外部质量控制。根据DuBois和DuBois方法，碘海醇结果纳入人体表面积索引。涉及参与者的所有程序和数据符合2000年赫尔辛基宣言涉及人类受试者医学研究的伦理法则。
2.2 胱抑素C试验
全部样品储存于-80℃的环境中，胱抑素C在这个温度能保持稳定。2010年，我们在海德堡Labor Synlab的罗氏/Hitachi Cobas S系统（Integra800）上使用未经校准的罗氏颗粒增强投射免疫比浊法（PETIA）Tina-quant®1代试验。随后我们将这一试验标记为“1代”。在平均浓度为1.04mg/L和4.48mg/L时，1代试验的试验间变异系数分别为5.57%和4.51%。2013年，在海德堡Labor Limbach的BNTM II系统上使用PENIA颗粒增强悬浮体散射（PENIA）N LateX® 试验测量了胱抑素C。在浓度为1.13和2.29mg/L时，血清胱抑素C的试验间变异系数分别为3.4%和4.6%。在根据ERM-DA471/IFCC对BN II系统的胱抑素C进行标准化后，制造商的健康受试者参考区间为0.59-1.05mg/L。西门子提供了全部的试剂和质控材料。
此外，2014年在海德堡Labor Limbach 的罗氏/Hitachi Cobas S system （Cobas c 501）上使用新开发和校准的2代Tina-quant® 试验测量了胱抑素C。在浓度为1.0mg/L、1.7mg/L和4.1mg/L时，试验间变异系数分别为2.3%、3.2%和1.3%。罗氏诊断提供了全部试剂和质控材料。
1代试验未经ERM-DA471/IFCC校准，而2代试验则相反，2代试验从2014年开始可以商购。
2.3 试验的比较
在总BIS人群（n=3666）中比较了罗氏1代试验和西门子试验。在碘海醇测量的子人群（n=567）中比较了罗氏2代和西门子试验。
2.4 不同试验估计GFR的比较
在两个研究人群（BIS人群（n=3666）和碘海醇子人群（n=567））中，我们比较了CKD-EPI和CAPA估计的GFR结果，这二者都使用ERM-DA471/IFCC标准化胱抑素C值建立，并在其方程建立的样品中包含70岁以上个体。
CKD-EPI：
胱抑素C≤0.8：133*（胱抑素C/0.8）-0.499*0.996年龄（*0.932如果为女性）
胱抑素＞0.8：133*（胱抑素C/0.8）-1.328*0.996年龄（*0.932如果为女性）
CAPA：
130*胱抑素C-1.069*年龄-0.117-7
最终使用西门子和2代试验的方程性能与参考方法比较，即用碘海醇测量的GFR。
2.5 统计分析
描述性分析包括平均值（mean）、标准差（SD）、中值和连续变量四分位数以及分类变量的绝对频率和百分比。
为了进行试验比较，我们执行Passing Bablok方法，一种不包括样品分布或测量错误特殊假设线性回归程序。非参数Passing Bablok程序比较2种分析方法的优势是不太容易受极端值的影响。在执行试验比较时，我们使用Bland-Altman描记进行包括考虑随机测量错误一致性范围的方法比较。试验间的偏移为罗氏PETIA和西门子PENIA试验的平均差，阳性值表示罗氏PETIA试验估计过高。
为了将估计GFR（eGFR）与测定GFR（mGFR）的比较和估计量进行对比，我们使用于Bland-Altman分析。评估eGFR和mGFR的平均差作为偏移。偏移的SD作为精密度评估，准确度是mGFR（P10和P30）的10%和30%内的估计百分比。使用McNemar检验完成方程性能显著差异检测。
1结 果
表1a和1b显示显示了BIS基线人群（n=2065，其中1601人在2年内接受了第二次胱抑素C测量，总计n=3666份胱抑素C血样）和碘海醇子人群（n=567）的主要特点。基准BIS人群的平均年龄略高于碘海醇人群，分别是80.4岁与75.5岁。在BIS总人群中，53%是女性，79%服用抗高血压药物，26%为糖尿病，平均BSA为1.81m2；碘海醇人群的特征是：43%为女性，77%的个体患有高血压，24%为糖尿病，平均BSA为1.85m2。表2概述了3个胱抑素C试验和2个BIS研究人群。
.1 试验比较
3.1.1 罗氏PETIA 1代与西门子PENIA
西门子和罗氏1代试验的平均（±SD）胱抑素C浓度（n=3666）分别为1.18±0.41mg/L和1.26±0.42mg/L。Passing Bablok回归显示如下方程：y（西门子）=-0.0689101+0.998336×（罗氏1代）（图1A）。两个胱抑素C试验的 Bland Altman（图2A）分析显示罗氏1代和西门子试验的平均差（±SD）为0.08±0.13mg/L，一致性范围为-0.18和0.34mg/L。罗氏1代和西门子试验的相对差为7%（±10）。罗氏1代与西门子试验的一致性可接受，P10、P20和P30分别为62%、90%和98%。
表1a. 基准BIS参与者的主要特征
BSA=体表面积；BMI=体重指数；eGFR=估计肾小球滤过率，罗氏1代=罗氏1代试验；mean（范围）；糖尿病定义为糖化血红蛋白>6.5%或使用治疗糖尿病的药物；高血压定义为使用抗高血压药物
表1b. 碘海醇参与者人群的主要特征
GFR估计方程：
CKD-EPI：
胱抑素C≤0.8：133*（胱抑素C/0.8）-0.499*0.996年龄（*0.932如果为女性）
胱抑素＞0.8：133*（胱抑素C/0.8）-1.328*0.996年龄（*0.932如果为女性）
CAPA：
130*胱抑素C-1.069*年龄-0.117-7
BSA=体表面积；BMI=体重指数；eGFR=估计肾小球滤过率，罗氏1代=罗氏1代试验；mean（范围）；糖尿病定义为糖化血红蛋白>6.5%或使用治疗糖尿病的药物；高血压定义为使用抗高血压药物
3.1.2 罗氏2代PETIA 与西门子PENIA
西门子和罗氏2代试验的平均（±SD）浓度（n=567）为1.14±0.38和1.14±0.37mg/L。PassingBablok回归显示出基本完美的方程，达到（空白）小数位：y（西门子）=0.00+1.00×（罗氏2代）（图1B）。2个胱抑素C试验的Bland Altman（图2B）分析揭示罗氏2代试验和西门子试验的平均差（±SD）为0.003±0.06mg/L，西门子和罗氏2代试验的相对差为-0.06%（±5）。与西门子试验相比，罗氏2代试验的一致性实质上得到了改进：P10、P20和P30分别为95%、100%和100%。
3.2 使用每种胱抑素C试验CKD-EPIcys和CAPA估计GFR的比较
3.2.1 罗氏1代PETIA与西门子PENIA
CKD-EPI方程中（n=3666）西门子和罗氏1代的平均估计GFR为63±21mL/min/1.73m2和57±19mL/min/1.73m2。Bland Altman分析揭示罗氏1代和西门子试验的平均差（±SD）-5±8mL/min/1.73m2（图3A）。与西门子试验比较罗氏1代eGFRCKD-EPI的一致性可接受，P10、P20和P30分别为54%、88%和98%。
3.2.2 罗氏2代PETIA与西门子PENIA
CKD-EPI方程中（n=567）西门子和罗氏2代的平均估计GFR为65±20 mL/min/1.73m2和65±20mL/min/1.73m2。Bland Altman分析揭示罗氏1代和西门子试验的平均差（±SD）0±4 mL/min/1.73m2（图3B）。与西门子试验比较罗氏1代eGFRCKD-EPI的一致性实质上得到了改进，P10、P20和P30分别为89%、99%和100%。
表2. 样品、血样数量和胱抑素C试验类型概述
a非标准罗氏1代比浊Tina quant® 试验
b西门子标准浊度 NLatex® 试验
c非标准罗氏2代比浊Tina quant® 试验
3.3 eGFR与mGFR的性能（n=567）
平均mGFR为60±16mL/min/1.73m2与mGFR相比eGFRCKD-EPI的平均差罗氏2代为5±10mL/min/1.73m2，西门子为5±11mL/min/1.73m2。与
mGFR相比西门子在和罗氏2代的eGFRCKD-EPI在偏移、精密度或准确度上没有显著区别（表3）。
对于CAPA方程，使用罗氏2代试验的平均eGFR为67±19mL/min/1.73m2，使用西门子试验的值则为66±19mL/min/1.73m2。与mGFR相比，eGFRCAPA的平均差，罗氏2代为6±10mL/min/1.73m2，西门子为6±10mL/min/1.73m2。对于CKD-EPI方程，与mGFR相比，西门子和罗氏2代的eGFRCAPA在偏移、精密度和准确度上没有区别（表3）。
比较使用mGFR和CKD-EPI的2个GFR方程的性能显示，与CAPA（86%）（p值0.02）相比，罗氏2代P30（89%）的值较好，否则2个方程之间的方程性能没有显著区别。
表3. 西门子和罗氏2代试验与mGFR相比
eGFRCAPA和eGFRCKD-EPI的偏移、精密度和准确度
eGFR：估计GFR；mGFR，测定GFR；SD，标准差，偏移是eGFR和mGFR的平均差，P10和P30按照mGFR 10%和30%估计的百分比计算。
GFR估计方程：
CKD-EPI：
胱抑素C≤0.8：133*（胱抑素C/0.8）-0.499*0.996年龄（*0.932如果为女性）
胱抑素＞0.8：133*（胱抑素C/0.8）-1.328*0.996年龄（*0.932如果为女性）
CAPA：
130*胱抑素C-1.069*年龄-0.117-7
a使用具有mGFR和CKD-EPI的GFR方程比较性能，显示与CAPA（p值为0.02）相比罗氏2代试验P30值显著较好。否则2个方程之间的方程性能没有显著区别。
比较使用mGFR和CKD-EPI的2个GFR方程的性能显示：与CAPA（86%）（p值0.02）相比，罗氏2代P30（89%）值显著较好，否则2个方程之间的方程性能没有显著区别。
图1A：罗氏1代（PETIA）和西门子（PENIA）胱抑素C（mg/L）试验（n=3666）比较，Passing Bablok相关性斜率、截距、随机差和线性有效性的细节。相关性方程：y（西门子）=-0.0689101+0.998336x（1代）；细节：截距A=-0.068919（95%CI：-0.08107至-0.05574；）斜率B=0.9983（95%CI：0.9872至1.0088）；剩余标准差（RSD）=0.09301±0.1823，与线性没有显著偏差。
B：罗氏2代（PETIA）和西门子（PENIA）胱抑素C（mg/L）试验（n=567）比较，Passin Bablok相关性斜率、截距、随机差和线性有效性的细节。相关性方程：y（西门子）=0.00+1.00×（罗氏2代）：截距A=0.00（95%CI：-0.01837至0.00）；斜率B=1.00（95%CI：1.00至1.0204）；RSD=0.04272±0.08373；与线性没有显著偏差（p=1.00）。
图2A：罗氏1代PETIA与西门子PENIA胱抑素C（mg/L）试验（n=3666）的Bland和Altman。中间实线（0.08mg/L）表示偏移。虚线表示的是一致性区间上限（0.38mg/L）和下限（-0.18mg/L）。
B：罗氏1代PETIA与西门子PENIA胱抑素C（mg/L）试验（n=567）的Bland和Altman。中间实线代表偏移（0.003mg/L）。虚线表示的是一致性区间上限（0.12mg/L）和下限（-0.12mg/L）。
图3.A：使用罗氏1代PETIA与西门子PENIA CKD-EPICYS估计的GFR（mL/min/1.73m2）Bland 和Altman（n=3666）。中间实线代表偏移（-5mL/min/1.73m2）。虚线代表一致性区间上限（10mL/min/1.73m2）和下限（-20mL/min/1.73m2）。
B：使用罗氏1代PETIA与西门子PENIA CKD-EPICYS估计的GFR（mL/min/1.73m2）Bland 和Altman（n=567）。中间实线代表偏移（-0mL/min/1.73m2）。虚线代表一致性区间上限（9mL/min/1.73m2）和下限（-9mL/min/1.73m2）。
4结 论
在此次研究中，我们能证明现有校准的西门子（PENIA）和罗氏（PETIA）胱抑素C（cysC）试验可以得出具有可比性的结果。罗氏胱抑素C试验的偏移从1代的7%下降2代的0%证明2代试验和西门子试验具有互换性。因此，计算eGFR时，结果间的偏移应从-5mL/min/1.73m2下降到0mL/min/1.73m2。此外，我们能证明使用西门子或罗氏2代评估的eGFR在与mGFR比较时，能达到相同的准确度。
使用基于生物标志物的方程估计GFR需要准确并标准地测量这些生物标志物，最小化方法特异性偏移。实际上，大部分方程都是从回归模型中开发的，这些模型包括标志物、肌酐或胱抑素C，具有重要的数学意义。不仅如此，GFR和肌酐或胱抑素C之间是指数关系，所以小的生物标志物浓度变化如在非标准罗氏1代试验中观测到的变化，足以使GFR估计产生重大变化。这一点在正常肌酐或胱抑素C水平中显得尤为重要，且能通过肾脏生物标志物和GFR之间的指数关系轻松解释。因此，血清肌酐和胱抑素C测量的标准化对普通人群尤其是探究肾功能与发病和死亡率之间关系的流行病学研究至关重要。一些研究已经大量阐述了在标准化肌酐试验后CKD发病率的重大区别。
目前，已经开始使用经过校准的、标准化的和可溯源的肌酐试验开发最常见的基于肌酐的方程。制造商已经参照参考方法即质谱法（IDMS可溯源试验）校准肌酐试验，成功实施了标准化工作。独立的研究已经显示大部分的酶促试验可有效IDMS溯源。即使制造商声称已经确认了溯源性，该情况在碱性苦味酸法中尚缺乏证据。
由于分子结构的原因，即使这种方法已经可是实现胱抑素C的测量，通过质谱法测量胱抑素C还是比较复杂。但是，据我们所知这一方法还未被用于测定IFFC工作组参考材料ERM-DA471/IFCC规定制造商应该校准其试验时胱抑素C“真值”的测定。胱抑素C的标准化需要改进浊度法和比浊法之间的差异，但是使用相同比浊法的不同试验间仍能观测到差异。西门子PENIA方法已经发现校准随着时间推移发生变化，应避免使用单一方法。正如肌酐已经完成标准化那样，胱抑素C的标准化是胱抑素C用于临床GFR估计的先决条件。目前已经可以实现校准，但是仍需证明制造商是否已经实际实施校准程序。一些文章近来报告了显著而中肯的胱抑素C差异，这让人们对制造商是否实施了有效校准产生了怀疑。
我们的结果应该可以让人放心，因为2种最常用的胱抑素C试验罗氏（PETIA）和西门子（PENIA）在胱抑素C浓度和估计GFR方面达到了一致。严格来说，我们不能证明这些试验已经根据参考材料进行了校准。但是，事实是新型罗氏2代试验证明与1代试验相比，2代试验与西门子试验的一致性更佳，1代试验是间接但重要的校准指标。其他间接的争议是2个方程估计GFR结果绝佳的一致性，这两个试验都是使用经过校准的胱抑素C方法开发的。这两个基于胱抑素C的方程即CKD-EPI和CAPA方程，在估计GFR方面显示出合格的性能，在我们研究30%的老年受试者人群中，准确度达到85%-90%。我们的研究有2个局限。第一，我们的结论仅仅能适用于本研究中的3个特别试验，需要对市场上多种其他试验的使用进行比较。第二，我们的结论只适用于欧洲提供的试验。基于现有的文献，在美国进行差异化校准可以实现，我们推测西门子公司已经开始着手这方面的工作。就全球而言，胱抑素C的校准研究在欧洲的协调性较好，优于美国。但是假设需要未来的研究加以印证。
总而言之，在我们研究的庞大老年人群中，我们的研究显示西门子（PENIA）和新开发的罗氏2代（PETIA）试验获得了相同的胱抑素C结果。方程性能不会受到胱抑素C试验选择的影响。在成人人群中，CKD-EPI和CAPA可以用于通过胱抑素C估计GFR。本次的研究工作显示成功的校准可以让胱抑素C分析取得重大进步。
（摘自Clinica Chimica Acta，版权归其所有，仅供内部参考）
编译：张凯
审校：王小茜
