两种新一代戊型肝炎病毒样颗粒的基因型 及其与已知基因型的抗原特性比较

简  介

除了四种主要的已知人类戊型肝炎病毒（HEV）基因型（G1-G4）之外，文章提及了基于日本野猪提取的具有唯一核苷酸序列的2种新基因型（G5和G6）。这两种基因型能否引起人体戊型肝炎尚未可知。目前，住院患者身上从未发现G5和G6基因型。为了研究G5和G6的抗原特性，研究人员使用重组杆状病毒系统删节过的氨基端（N端）HEV ORF2蛋白质进行呈现。研究人员获取了G5和G6的病毒样颗粒（VLP）。该VLP显示的与G1、G3和G4的抗原交叉反应性大大强于与雪貂或老鼠HEV的反应性。不仅如此，抗G5和抗G6 VLP抗体可以中和G3 HEV感染PLC/PRF/5细胞的能力，因此提出G5和G6具有与人类HEV相同的血清型。

一、介   绍

戊型肝炎病毒（HEV）是引发人体戊型肝炎的病原体。无论是发达国家还是发展中国家，戊型肝炎病毒都是一个重要的公共健康难题。HEV主要通过粪口传染，发展中国家爆发的大多数HEV归因于以水为载体的传播（即：饮用水污染）。但是，发达国家显著比例的散发型戊型肝炎主要由受动物传染病污染的食品感染，而且引起这种类型的HEV毒株通常为G3和G4基因型。目前尚未有G1和G2基因型引起的动物传染病传播的报告。

HEV是一种单链、阳性RNA病毒，隶属于戊型肝炎病毒科的戊型肝炎病毒属。该科的病毒有极广的宿主范围，包括人类、家猪、野猪、鹿类、猴类、兔类、驼鹿、骆驼、猫鼬、鼠类、雪貂、红狐狸、水貂、蝙蝠、鸡类以及鱼类。基于测序信息的最新的理论，戊肝病毒科可以分为2大类：Orthohepevirus（哺乳类和鸟类相关的HEV）以及Piscihepevirus（割喉鳟病毒，鱼类HEV）。Orthohepevirus属包括（A）人类、家猪、野猪、鹿类、猫鼬、兔类和骆驼分离株；（B）鸡类分离株；（C）鼠类、大袋狸、亚洲麝香鼩鼱、雪貂和水貂分离株；（D）蝙蝠分离株。割喉鳟病毒是仅有的Piscihepevirus病毒。这些动物HEV是否能够传播到人体身上尚不明确；感染的动物是否会发展为肝炎也未可知。

在日本野猪身上发现了两种新型的HEV毒株JBOAR135-Shiz09（AB573435）和wbJOY 06（AB602441）。这两种毒株的全基因组测序显示出核苷酸序列显著的唯一性，仅仅是近似。彼此之间70%-80%的核苷酸和已知的Orthohepevirus A类似，和OrthohepevirusB、C以及D的相似度低于60%。因此毒株JBOAR135-Shiz09代表基因型5（G5），wbJOY 06代表基因型6（G6）。这两种新基因型的抗原性和血清型尚未阐明。

在当前的研究中，研究人员有效地描述了昆虫Tn5细胞内重组杆状病毒系统删节过的，源于G5和G6的氨基端（N端）HEV ORF2蛋白质，以及该蛋白的病毒样颗粒自组装。该VLP显示的与G1、G3和G4的抗原交叉反应性大大强于与雪貂或老鼠HEV的反应性。不仅如此，抗G5和抗G6 VLP抗体可以中和细胞培养系统中的G3 HEV感染，说明G5和G6的HEV的血清型与G3HEV相同。

二、方   法

2.1 转移向量的结构

在起始密码子之前包含BamHI位点和终止密码子之后包含XbaI位点的未删节的G5和G6 HEV基于基因库（AB573435和AB602441）内储存的野猪HEV序列合成并克隆到向量、pCR2.1或pUC57，形成pCR2.1-G5-ORF2质粒和pUC57-G6-ORF2（基因脚本，皮斯卡塔韦，新泽西州）。分别使用引物为G5FN13/G5CR、G5FN111/G5CR、 G6FN13/G6CR和G6FN111/G6CR的PCR扩增编码为13-和11-的氨基端（N端）-aa-删节的HEV ORF2DNA片段，使用pCR2.1-G5-ORF2质粒和pUC57-G6-ORF2作为模板（表1）。使用凝胶净化试剂盒净化扩增后的DNA片段并克隆到TA2.1克隆向量。使用BamHI和XbaI消化删节的和未删节的OFR2，并使用杆状病毒转移向量pVL1393结扎，生成pVL1393-G5-ORF2、pVL1393-G5n13-ORF2、pVL1393-G5n111-ORF2、pVL1393-G6-ORF2、pVL1393-G6n13-ORF2和pVL1393-G6n111-ORF2质粒。

2.2. 衣壳蛋白表达和重组杆状病毒的结构

重组杆状病毒被构建和描述并制定为Ac[G5ORF2]、 Ac[G5n13-ORF2], Ac[G5n111-ORF2]、 Ac[G6ORF2]、Ac[G6n13-ORF2]、和Ac[G6n111-ORF2]（表1）。为了达到大规模表达的目的，使用粉蛾属昆虫细胞系和BTL-Tn 5B1-4 （Tn5）。使用5-20%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离细胞裂解物内的蛋白质和培养基，并使用考马斯蓝着色。

2.3 VLP的净化

感染7天后收获被重组杆状病毒感染的Tn5细胞。在使用60分钟的10000×g离心分离移除完整的细胞、细胞碎片和后代杆状病毒后，将上清液置于Beckman SW32Ti rator上以32000rpm的速度运行3小时，接着在4℃的环境中的EX-CELL405培养基中复悬上一步产生的VLP小球并做隔夜处理。试用包含50nM硼酸钠、l50nM氯化钠、1%诺乃清洁剂P-40、0.5%脱氧胆酸钠和5%2巯基乙醇的变性缓冲液处理感染的细胞，接着在室温下轻轻振荡2小时。使用EX-CELL105培养基稀释溶菌产物接着以32000rpm的速度在Beckman SW32Ti rator上离心3小时。使用EC_CELL450培养基复悬这些小球。为了进行CsCl梯度离心，将4.5mL的样品与2.1gCsCl混合，并在10℃的温度下在Beckman SW55Ti rotor上以35000rpm的速度离心24小时。分馏该梯度到250uL的整数倍，对每一部分进行称重以评估活跃密度和等密度点。使用EC-CELL405培养基稀释每一部分并在Beckman TLA55 rotor上以50000rpm的速度离心2小时沉淀VLP。

2.4 电子显微镜（EM）

将净化的VLP置于碳沉积盖覆的网格内45秒后使用蒸馏水漂净。使用2%的铀酰醋酸盐溶液染色并使用80kv操作的JEOL TEM-1400电子显微镜观察。

表1 重组杆状病毒、引物和G5以及G6HEV ORF2蛋白质

2.5 氨基端（N端）氨基酸序列分析

蛋白质被CsCl梯度离心净化。在蛋白质测序仪上使用100pmol的蛋白质通过埃德曼自动降解对氨基端氨基酸（aa）进行微序列测定。

2.6 超免疫血清

使用G5sVLP或G6 sVLP对15周大的母维斯塔鼠进行免疫。通过对每只老鼠进行大腿部注射250ugVLP达成免疫。在第一次注射后的4-6周，注射半剂量的VLP进行加强。所有的注射及加强注射不能佐以其他药剂。在最后一次注射免疫后的动物进行为期一周的放血。伦理学学会应根据《感染症研究所动物实验实施指南》的110054条款检查全部的实验鼠。实验鼠应单独置于BSL-2设施内。

2.7 HEV抗原和抗HEV IgG抗体的检测

使用净化的VLP（1ug/mL，100uL/孔）执行ELISA检测抗HEV IgG，应使用VLP免疫的兔类和豚鼠血清执行检测HEV抗原（HEV Ag）的ELISA。

2.8 基于细胞培养的中和试验

使用G3HEV毒株评估抗HEV抗体的中和能力。研究人员知道HEV在人体肝癌细胞系PLC/PRF/5内生长并有效释放到细胞培养上清液中。将VLP免疫前和免疫后的鼠血清加热到56℃持续30分钟并使用培养基199稀释1:10和1:100。每毫升包含2×106个G3 HEV副本的溶液与1mL稀释的抗血清溶液混合并在37℃的环境中培养1小时，接着在4℃的环境中培养3小时。在6孔细胞培养板（5×105细胞/孔）上使用4mL包含10%（v/v）加热的灭活胎牛血清（FCS）的DMEM培养PLC/PRF/5细胞。移除细胞培养基后，添加1mL的病毒/血清混合物到每孔中。在37℃的环境中吸附1小时后，使用3倍磷酸缓冲生理盐水（PBS：不含钙和镁）对细胞进行清洗。添加4mL的包含培养基199、2（v/v）加热灭活FCS和10nM MgCl2的维持培养基到每个孔中。每隔三天更换新培养基。通过检测ELISA培养后3周的细胞培养上清液内的HEV Ag监视中和活动。在这种情况下，培养上清液内的HEV Ag检测意味着HEV未被抗体中和，反之，如果缺乏HEV Ag这则说明抗体对HEV有中和作用。

图1删节的氨基端aa G5和G6 HEV ORF2表达的时间进程。用重组杆状病毒Ac[G5n111-ORF2] 和Ac[G6n111-ORF2]感染昆虫Tn5细胞，并在指定的天数后收获（1-10）天，使用SDS-PAGE分析5微升的培养基和源于105细胞溶菌产物。使用考马斯蓝染色使蛋白质带直观化。M：分子量标记；C：模拟感染的Tn5细胞；W：野生型杆状病毒感染的Tn5细胞；1-10线Ac[G5n111-ORF2]或在1-10天内收获的感染的ac[G6n111-ORF2]Tn5细胞。

三、结   果

3.1 G5和G6 HEV ORF2的表达和VLP净化

6种重组的杆状病毒与未删节的、删节的氨基端13 aa以及删节的111 aaG5HEV ORF2、Ac[G5ORF2]、Ac[G5n13-ORF2]、Ac[G5n111-ORF2]比较，G6 HEV、Ac[G6ORF2]、Ac[G6n13-ORF2]和Ac[G6n111-ORF2]按方法章节的描述进行制备。使用重组的杆状病毒在感染复数中感染Tn5细胞，在26.5℃的环境中培养并在10天内收获。使用SDS-PAGE分析重组杆状病毒感染的细胞生成的蛋白质和上清液。在Ac[G5ORF2]和感染的Ac[G6ORF2]Tn5细胞中，主要的蛋白质带具有12kDa的分子质量，这和2天内检测的未删节ORF2蛋白质一致。但是这些蛋白质在上清液未被检出，细胞或上清液中也未观测到任何VLP（数据未显示）。与此相反，具有58kDa分子质量的蛋白质带在2天内的Ac[G5n111-ORF2]和Ac[G6n111-ORF2]感染的Tn5细胞内中被检出，表达水平在3-4天这一段内到达峰值（图1）。具有53kDa分子质量的迁移蛋白质在第四天的细胞和上清液内被发现，并在第6天到第10天的上清液内到达峰值。仅在Ac[G5n111-ORF2]和感染的Ac[G6n111-ORF2]细胞内合成p58和p53，并不在模拟感染或感染野生型杆状病毒的细胞内合成。

为了检验VLP是否成型，研究人员在第7天收获感染Ac[G5n111-ORF2]和Ac[G6n111-ORF2]的Tn5细胞培养上清液，并使用CsCl梯度离心净化。P53蛋白质主要分布在12-16片段，密度在1.284g/cm3-1.289g/cm3，平均密度1.285g/cm3（图2a和b）。VLP的氨基端aa序列由微测序决定VLP二者的氨基端aa序列为AVAPA，等同于112-aa至116-aa的ORF2残余物，这表明p53蛋白质分别来源于G5和G6 ORF2。

电子显微镜观察的12-16片段揭示了许多直径大约24nm的球状颗粒（图2c和d）这些VLP的大小与ORF2内隐藏删节部分的重组杆状病毒生成G1、G3和G4VLP相同。由于这些VLP比天然的HEV颗粒小，研究人员将其指定为G5 sVLP和G6sVLP。净化的G5和G6sVLP产量分别为每107Tn5细胞2.0mg和2.3mg。高于G1、G3和G4的产量。

在感染Ac[G5n13ORF2]和Ac[G6n13ORF2]的Tn5细胞中，观测到四种主要的具有40kDa（p40）、53kDa（p53）、64kDa和71kDa分子质量的蛋白质（图3和b）在上清液中仅检测到了p53（数据未显示）。为了净化源于细胞的VLP，研究人员在第7天收获了感染的Tn5，并用方法章节描述的变性缓冲液对其进行净化。在经过CsCl梯度离心之后，p64出现在片段8和9（G5）或9和10（G6）内，并具有1.300g/cm3的平均密度；p53主要出现在片段13和14，具有1.285g/cm3的平均密度；p40在片段3和4被检出，平均密度1.350g/cm3（图3c和d）。p40为杆状病毒感染诱导的自然野田村病毒的外壳蛋白，在早期研究中曾经报告过。氨基端aa的G5和G6 VLP测序为LPMLP，等同于14aa-18aa的ORF2残余物，表明这些VLP源于ORF2蛋白质。

电子显微镜观测到的片段8（G5）和片段9（G6）揭示了直径大约35nm的球形颗粒（图3e和f）。这些微粒的形态与自然HEV微粒相同，故分别指定为G5nVLP和G6NVLP。

图2 G5 sVLP和G6 sVLP的净化。使用CsCl均衡密度梯度离心净化感染Ac[G5n111-ORF2],和Ac[G6n111-ORF2]的Tn5细胞上清液，使用5-20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每个片段的等份，并用CB染色。（a）源于感染Ac[G5n111-ORF2]Tn5细胞培养上清液的样品；（b）来自感染Ac[G6n111-ORF2]Tn5细胞培养上清液的样品。使用电子显微镜观察VLP。（c）G5 sVLP；（d）G6 sVLP。Bar-100nm。

3.2 G1、G3、G4、G5、G6以及鼠类和雪貂HEV的抗原交叉反应

抗G5和G6 VLP的抗体分别通过培养带有G5sVLP和G6sVLP的鼠类获得。经过三次注射以后，从培养的鼠类身上得到高水平的抗G5 sVLP和G6 sVLP的高水平IgG抗体，滴度分别为1:409600和1:204800.

图3 删节的13-氨基端G5和G6HEV ORF2的表达时间进程和VLP的净化。用重组杆状病毒感染昆虫Tn5细胞并在指定的天数后收获（1-10天）。使用SDS-PAGE分析源于105细胞的细胞溶菌产物。使用考马斯蓝染色使蛋白质直观化。（a）感染Ac[G5n13-ORF2]的Tn5细胞；（b）感染Ac[G6n13-ORF2]的Tn5细胞。M：分子量标记；C：模拟感染的Tn5细胞；W：感染野生型杆状病毒的Tn5细胞。1-10线感染Ac[G5n13-ORF2]或Ac[G6n13-ORF2]并在10天内收获的Tn5细胞。使用变性缓冲液处理感染Ac[G5n13-ORF2]或Ac[G6n13-ORF2]重组杆状病毒的Tn5细胞，接着使用CsCl均衡密度梯度离心将其净化。使用5-20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每个片段的等份，并用CB染色。（c）从感染Ac[G5n13-ORF2]的Tn5细胞净化的蛋白质；（d）从感染Ac[G6n13-ORF2]的Tn5细胞净化的蛋白质。使用电子显微镜观察VLP；（e）G5nVLP的电子显微镜图像；（f）G6n VLP的电子显微镜图像。Bar=100nm。

为了探索G1、G3、G4、G5、G6以及鼠类和雪貂HEV的抗原交叉反应，研究人员通过将每种VLP作为抗原使用进行ELISA的方法比较了同源和不同源免疫血清的抗体滴度（图4）。鼠类血清抗G5和G6 HEV交叉反应与不同源的G1、G3和G4HEV相比，处于与同源G5和G6EHV相同的水平；但是，通过鼠类和雪貂VLP检测到的抗G5和G6的滴度为1:51200，显著低于通过G1、G3或G4VLP检测到的水平（图4a和b）。这些观测到的情况说明G5和G6HEV具有一个或多个与雪貂、鼠类、G1、G3和G4HEV共同的抗原表位，或伴有与G1、G3和G4共有但缺少鼠类或雪貂HEV的抗原表位。

在人体抗G1、G3和G4 HEV、雪貂抗雪貂HEV和鼠类抗鼠类HEV以及每种VLP的反应性比较中，研究人员发现人抗G1和G3 HEV的反应对G1、G3、G4、G5和G6VLP比雪貂和鼠类VLP更强（图4c和d），仅人抗G4 HEV IgG对G1、G3、G4、G5、G6、鼠类和雪貂VLP有相同的滴度（图4e）。相反，鼠类抗鼠类HEV和雪貂抗雪貂HEV与鼠类和雪貂HEV-LP的反应比与G1、G3、G4、G5、G6VLP更强（图4f和g）。这种结果也说明G5和G6HEV的抗原反应相对于鼠类和雪貂HEV与G1、G3和G4HEV更相似。

3.3 G3对抗G5 sVLP和G6 sVLP抗体的交叉中和

为了检验中和能力，研究人员将鼠类抗G5sVLP 或G6sVLP与G3 HEV混合，培养该混合物到达中和状态，接着研究人员使用该混合物接种PLC/PRF/5细胞。预先免疫的鼠类血清用作阴性质控品。鼠类抗G3LP抗体用作阳性质控品。如图5所示，G3HEV Ag在预先免疫的鼠血清培养的样品中被检出，具有1.458-1.564的光密度（OD）值。相反，HEV Ag在使用鼠类血清抗G3、G5和G6、VLP培养的样品中未被检查，这说明：抗G5和G6 VLP抗体能够中和G3 HEV。换句话说，G3、G5和G6 HEV形成一个单独的血清型。

四、结   论

野猪是HEV的一个宿主，野猪分离出去的G3和G4 HEV可能作为一种动物性传染病传染给人类。除了G3和G4 HEV，至少有三种其他新的HEV毒株从日本野猪身上被分离出来（基因库登记号AB573435，AB602441和AB856243）。先前的基因分析证明，从野猪身上分离出来的新型的HEV与G1、G2、G3和G4 HEV的核酸序列一致性低于80%，而且这些新型的分离株最近被认为在物种Orthohepatitis A中构成了G5和G6 HEV。

图4 G1、G3、G4、G5、G6和鼠类以及雪貂HEV的抗原交叉反应。ELSIA测定的每种抗VLP的IgG滴度。源于G1 HEV的VLP（□）G3 HEV（◇）；G4 HEV（×），G5 HEV（○）G6 HEV（○+）鼠类HEV（△），雪貂HEV（▽）用作抗原，X轴：OD值，y轴：血清稀释液。

图5 抗G3 HEV抗体的中和反应性。使用基于细胞培养的试验执行鼠类抗G5 sVLP和抗G6 sVLP中和G3 HEV的作用。条状是HEV Ag的OD值。Pre：预先免疫的鼠血清；G3，鼠类抗G3 VLP血清；G5：鼠类抗G5 sVLP血清；G6：鼠类抗G6 sVLP血清。鼠类血清按1:10（白色条）和1:100的比例（黑色条）进行稀释。

但是，从不同的野猪身上检测出了G5和G6 HEV，而且G5和G6 HEV是否能够传播到人以及其他动物身上的问题尚未解答。不仅如此，目前还没有建立这些HEV细胞生长培养机制，G5和G6 HEV的流行病学、病理学和抗原性尚不清楚。在目前的研究中，研究人员使用重组杆状病毒表达系统来生产VLP，并且研究人员通过比较G5和G6 HEV与其他已知HEV的抗原性来获得关于这些新毒株的更多信息。

当通过重组杆状病毒表达未删节的G5和G6 HEV ORF2时，源于该基因的重组蛋白质既不能释放到培养上清液中又不能生成VLP。在先前的工作中，删除的111氨基端aa ORF2蛋白质足以释放到上清液中并具有自组装VLP的能力。使用删节的13氨基端aa G3 HEV ORF2可以生产自然大小的VLP。在当前的研究中，研究人员据此使用了相同的策略。值得一提的是，净化的G5和G6小型空白颗粒产物产量显著高于其他基因型。从细胞中净化的自然大小的VLP似乎压缩HEV ORF2基因组。这一发现将有助于HEV基因组包装机制的研究。

G1-G4HEV据目前所知代表相同的血清型，而且研究人员先前的研究表明鼠类HEV和雪貂HEV血清型与G1、G3和G4 HEV并不相同，而且那些HEV的血清型根据它们的宿主而变化。目前的抗原性比较显示G5和G6 HEV具有相同的抗原性，而且从遗传学角度来讲，相对于鼠类和雪貂HEV，其更接近于G1、G3和G4 HEV。抗G5和G6 VLP抗体能中和G3 HEV感染的PLC/PRF/5细胞，这说明G1、G3、G4、G5和G6代表一个单独的血清型。

近来，根据戊型肝炎病毒科的分类提议，指出目前有四种Orthohepevirus种群，G5和G6 HEV和G1、G3、G4、兔类和单峰骆驼HEV一样属于Orthohepevirus A。一项关于兔类HEV和人体HEV的研究显示这二者具有一个单独的血清型，这项研究已经进行了报告。但是，Orthohepevirus A种群中的全部HEV基因型是否属于同一血清型仍然未知。这些新型HEV衣壳蛋白的表达和抗原性分析可能有助于物种和血清型之间关系的明确。

由于G5和G6 VLP显示出与其他人体HEV及其相似的抗原性和血清型，该产物的产量显著高于从其他HEV获得的产量。因此，G5和G6 VLP可能有助于疫苗的开发。

（摘自Veterinary Microbiology，版权归其所有，仅供内部参考、学习）

编译：王小茜、张凯