生物样本库的成熟： 向生物样本科学的转变

介绍：生物样本库的起源

生物样本库运行通常被认为是简单的技术和物流的方法来收集，处理和存储生物样本（本文中的生物样本包括液体样本（血液、尿液和唾液）、组织样本和细胞样本）。提到生物样本库，人们就会想到，仓库——里面是装满冰冻血液和组织样本的冰箱；或是收集石蜡切片的病理部门。一般来说，这些病理收集是100多年以前生物样本库的最初起源。因为这些收集，特别是石蜡切片的收集，在临床中对病人的诊断是必须的。逐渐，人们发现生物样本的收集对科学研究也有很大的帮助，于是生物样本库便开始发展。最大最久远的生物样本库之一——武装部队病理研究所开始于美国内战（终止与2011年，目前是美国军事联合病理中心的一部分）。在几十年的发展中，鉴于生物样本的收集有助于科学研究，很多机构相继成立，将生物样本的收集诊断工作融入到转化医学研究中。同时，近30年来，在临床研究、流行病研究、生物标志物的发现和发展研究中以及其他各式各样的应用中生物样本的使用都越来越普遍。目前，生物样本库被认为是个性化医疗（精准医疗）发展的基石。这些研究中使用的生物样本的种类已扩展到各种组织、液体和细胞，其采集和处理的方式也是多种多样的。一些大型项目中生物样本收集的失败使人们认识到生物样本的质量需要更多的关注。这就导致了最佳实践开展和生物样本方法学研究的演变。同时，人们也认识到需要建立成熟的生物样本库，并发展成为一门生物样本科学。

本综述讨论生物样本库最佳实践的发展；质量管理，询证实践；与生物样本研究发表相关的规范；伦理、法律、社会；信息科学、商业化和可持续发展等问题在生物样本科学发展中所起的重要地位。所有这些均提示生物样本库不仅仅是简单的生物样本存储的技术和手段，而是一个复杂的学科。

生物样本库最佳实践

1、生物样本库的定义

生物样本库工作包括物理设施和数据系统两类，物理设施是存储生物样本和数据的基础物理设施，数据系统是管理生物样本库的各类规范和流程。生物样本库是目前常用的术语。然而很难对其进行精确的定义。Hewitt & Watson等人的问卷调查显示在对生物样本库进行描述时，会有不同的看法。这些看法反映了现有生物样本库在规模和目的有很大的不同，从小型病理实验室——只有几台冰箱，仅收集石蜡切片，到大型机构或商业的生物样本库——有几百台冰箱、各种自动化设备、健全的安全设施和完整的质量管理系统。另外，生物样本库中样本的使用目的也不相同，包括基础实验、转化医学研究、流行病研究和临床研究等。以上这些情况，导致产生了许多不同的最佳实践，从而能够满足各种目的，进而产出各种样本和数据来满足质量要求和下游分析的需求。

2、生物样本库最佳实践的发展

随着生物样本库变的越来越大、越来越复杂，其中的样本、数据的种类和数量也越来越多，一些机构已经发布的一系列权威的最佳实践。国际生物和环境样本库协会（ISBER）已经与2005年发布了其第一版的最佳实践，随后进行了两次修订，目前最新版发布于2012年。美国国家癌症研究所（NCI）、国际癌症研究机构（IARC）、经济合作与发展组织（OECD）等均已发布了相关最佳实践。一些综述已经简要概括了各类最佳实践的发展。一般来说，最佳实践中的各类文件是根据大型机构或商业生物样本库的经验编写的（其中之一见图1），这是因为这些样本库有完善的质量管理体系、信息系统和各类生物样本的流程。随着生物样本的存储已经成为一种科学，发展基于证据的标准操作流程并融合到最佳实践已成为趋势。Engel等人研究了美国国家癌症研究所（NCI）发展最佳实践的过程并举了一个术后组织快速冰冻的例子。

图1：美国NCI样本库储存间

一般来说，生物样本库的技术和操作实践已发展为供大多数的技术和操作遵循相似或相同的流程。目前最佳实践和其他发表文章都提供了各类样本（包括血液、组织、尿液、唾液、及其他各类样本），在采集、处理、贮存和运输中的各种详细建议。流行病学研究中所涉及的生物样本的收集还需要各类的标准操作流程。新的样本类型和技术还需要定期的调整和不断更新的标准实践。在“询证实践”章节中，还会提到在选择生物样本采集、处理和贮存的的最佳方法中，鉴于各种处理前变量和可能的偏倚，还有许多没有解决的问题。

伦理、法律和规则的实践还有待解决，其中还有很多存在争议的地方（参见伦理、法律和社会问题）。这些问题还受到地区和国家的政策的影响，而这些政策使生物样本和数据的国际化共享变得更加复杂。

随着各种最佳实践的衍生和生物样本库数量、复杂型的增加，研究者就会提出一个问题——是否需要建立一个国际化的、保罗万象的最佳实践。在2010年，一项关于国际化生物样本库最佳实践的综述列出了已经有14个组织发表了最佳实践。这些实践提供了多种多样的建议。鉴于以上已经列出的原因，这种情况很难解决。因此采取和发展循证实践就变得至关重要。国际生物和环境样本库协会（ISBER）和其他国际化生物样本库组织正致力于培训生物样本库专家，促进生物样本库向国际化、一致化发展。一个很好的例子、未来的方向，就是欧洲生物体样本库与生物分子资源研究设施（BBMRI）。该组织由欧盟资助，联合各方面的力量，致力于欧洲及其他地方生物样本库的可持续发展。该组织的项目包括主办和参与各种与生物样本库相关的研讨会和培训项目、发展各种培训材料，从而促进生物样本的国际化交流。

循证实践

1、生物样本的质量

在生物样本科学发展的过去10年中，参与者从一些有影响力的失败的案例中学到了很多宝贵的东西，集中于生物样本的处理和质量问题。正如Spruessel等人的组织缺血时间对基因表达的影响的研究中提到的，“尽管科研工作者控制各种变量，尽力试图减小其对结果的影响，可是，他们通常很少知道临床样本的背景情况”。

在美国国家卫生研究所的一个项目——The Cancer Genome Atlas中，出现一些早期样本质量失败的情况，因为从已经收集的冰冻组织中回顾性地收集的肿瘤标本没有满足相关的病理及分子质量的要求。超过一半的原始收集的样本没有满足相关质量要求。最终，该计划的领导者决定采取前瞻型的收集方法，并采用严格控制的标准程序。这样使样本的合格率超过80%。

在建立乳腺癌的治疗标准方案中，研究者检测HER2基因来探究曲妥珠单抗治疗是否有效。在2007年，美国病理学会（CAP）和美国临床肿瘤学会的一个专家组发表了一个有关临床实验室间HER2异质性的大型综述研究发现，Her-2的假阳性率和假阴性率高达20%。在其发表的文章中，专家提出HER2检测的问题有一部分就来自与乳腺癌生物样本固定方法的不同。

尽管已付出了相当的努力来编制有关样本科学的综合文献，研究者还是发表了很多分析前变量影响生物样本质量的例子（本综述后面也会谈到），参见Khoury和Hewitt等人的例子。Poste强调发展新方法消减处理前变量的对样本影响的重要性；Ransohoff和Gourlay指出生物样本的处理不当会带来一定的研究偏倚。这些影响除了分析前变量，还包括在分析样本中batch effect（因为处理的样本量大，小的影响会被放大，带来严重影响）和样本来源的不同（例如来自于实验组和对照组）（表1）。

2、质量管理体系

伴随着生物样本库最佳实践的发展和生物样本科学的进步，建立质量管理体系已经成为生物样本库行业中的重中之重。目前，生物样本库的工作中已经采用了临床化学实验室的成熟的质量检验和质量控制体系，另外的专门针对生物样本库的实践。

生物样本库的基本质量管理体系需要工作中的各个方面各种标准操作流程（SOP）。工作人员需要进行SOP的培训，流程需要进行周期性的内审和外审，以及需要一个电子文件存档控制系统。ISBER、NCI、OECD及一些别的组织的最佳实践中对基本的生物样本库的质量管理体系已有描述。

随着生物样本库和生物样本科学的发展，质量管理体系也发生了变化。早期采用质量管理体系的都是临床用的生物样本库，受到FDA的监管。这些质量管理体系均是根据GMP制定的。GMP对SOPs、安全措施、设施的安装、运行及维护文件、IT系统和对所有样本和试剂的记录均有严格的标准。最近一些生物样本库，特别是从事国际合作的生物样本库，已经根据ISO进行了质量认证。所采用的ISO标准是ISO9001。但是，ISO9001是一个综合性的质量管理体系，而不是专门的生物样本库管理体系。目前，ISBER和其他组织已经组织了专家在进行生物样本库专门的ISO建设。所有ISO认证活动都有助于生物样本向更高质量管理标准的发展。

3、循证实践的方法

尽管已经认识到质量管理体系在生物样本库中的重要地位，但是生物样本的质量还是难以满足后续研究的需要。鉴于以上提出了生物样本质量的各种问题，发展循证实践成为了生物样本库工作中的重点。ISBER发布的最佳实践中已经提供了一些优化生物样本采集和处理的研究。然而这些生物样本技术仅被当地生物样本库和实验室采用，并没有进行大范围的推广和发表。英国生物样本库（UK Biobank）的实践就提供了一个很好的例子。在2008年，该项目的领导人在International Journal of Epidemiology杂志上发表了一系列的文章，详细的描述了在该计划中采取的最优化的生物样本采集方法最终包括了50万参与者。这些方法涉及到血液样本稳定性和其他各种分析方法的评价、自动化样本处理流程以及一各新型的全自动血液分装系统。

自2008年一来，就有一些机构，如美国国立癌症研究所生物研究网络（BRN）和SPIDIA（standardization and improvement ofgeneric preanalytical tools and procedures for in vitro diagnostics），就已经开始了分析前变量影响生物样本质量和下游分析可靠性的研究。在这些研究中，分析前变量包括冰冻样本的反复冻融周期、样本从采集到固定的时间、捐赠者的用药情况和其他一些因素。

BRN和SPIDIA均发表了其研究的结果。另外，NCI建立了一个生物样本研究数据库（BRD），编辑了来自各种杂志的关于生物样本的2000多篇文献的摘要和结论。图2展示了生物样本周期的各个阶段。BRD包括了分析前变量在生物样本周期的各个阶段中对样本质量影响的文章。

图2：影响生物样本质量的变量举例

鉴于生物样本科学涉及到多个学科，因此这方面的文章发表于各个领域内，包括临床化学、病理学、流行病、基因组学、蛋白组学及其他一些基础研究、转化医学和临川研究的杂志。BBRB（NCI Biorepositories and Biospecimen Research Branch）已经发表了数据来自于BRD文章的综述，作为扩展样本库循证实践的文献。图3中展示了一个例子，说明尿液收集中分析前变量是如何影响后续代谢研究的。该例子收录与BRD中。然后，涉及分析前变量和各种因素对样本质量造成影响的研究总是充满争议的。推进生物样本科学中循证实践的工作还需要更多的努力，才能使该科学更好的应用于基础、临床的研究中。文献中冲突的数据和各种经济因素仍然是采用新型的样本收集和处理标准的主要障碍。

图3：BRD收录文献示例

4、文章发表准则

另外一个生物样本科学中循证实践发展的障碍是在发表的文章中缺乏关于生物样本的采集、处理、贮存条件和其他生物样本处理细节的报道。鉴于是生物样本科学涉及多个学科，因此其问题是很难妥善解决的。正如上面提到的那样，涉及生物样本收集使用的文章可能发表于各种领域杂志上，如病理学、流行病学、基因组学、蛋白组学、临床化学等。过去10年中，NIH研究者和其他合作者均发表了一些标准，敦促文章的发表商、作者、编辑和评委加强对生物样本采集和处理细节的把握，来确保研究结果的可靠性。如REMARK指南（The REporting recommendations for tumor MARKer prognostic studies（REMARK）guidelines）中的建议就提到了对生物样本的处理，尽管该指南重点是对生物标志物的发现和发展进行指导。最近，NCI BBRB的专家领导了一个国际化委员会编写了“提高生物样本研究的质量的报告（Biospecimen Reporting for Improved Study Quality）”。该报道中提出一些标准，鼓励研究作者在发表文章的“材料和方法”中提供一系列研究变量的参数。该报道中的变量根据重要性和信息的复杂型总结分为3个等级。等级1包括的条目对研究至关重要的、研究者需要控制的，例如样本种类、采集方法、固定方法、贮存温度和期限、运输温度。等级2中的条目是对根据不同研究建立的前分析变量、如果可能的话进行报道，包括生物样本采集和处理的时间间隔、样本的固定时间等。等级3的条目包括一些较少记录的项目，如样本反复冻存的次数、样本运输中的细节、热缺血的时间等。REMARK和BRISQ同时发表了文章，很多杂志已经采用了其建议。

新出的样本采集文件是SPREC（the Standard PREanalytical Code），该文件采用密码的方式控制样本的采集过程。例如，采用TIS-BPS-N-B-RNL-A-A来控制实体组织或细胞样本的采集。

所有这些质量管理体系的建立、生物样本方法学的研究、循证实践的发展和文章的发表均是生物样本库行业发展的证明。然而这些努力只有被证明融入到最佳实践、进而被广泛采用，才能发挥作用。然而这还需要努力。

生物样本科学发展中的其他一些重要问题

以下章节将讨论生物样本库和生物科学发展中的一些重要问题，这些问题并不是样本采集、处理、贮存方法中的科学和技术问题。ISBER和NCI的最佳实践提供了更多的信息。

1、伦理、法律和社会问题

目前，伦理、法律和社会问题是生物样本库中的焦点，这些问题中存在很多的争议、也很难妥善的解决。这些问题也是新闻报道的焦点。

一般来说，生物样本库中的伦理、法律和社会问题集中于知情同意书、隐私、和样本数据的采集和发放的管理规则等方面。知情同意在美国由DHHS制定的规章统一管理。DHHS人类资源保护部门管理提供包含生物样本采集研究中的知情同意的指南。知情同意书必须告知样本的捐赠者或病人所有有关的内容，包括样本的采集过程、保密情况、捐赠者个人信息是否匿名以及生物样本和衍生物是否进行商业利用等。而且有法律（The Health Insurance Portabilityand Accountability Act Privacy Rule）规定了各种样本及其附带的信息，和这些数据该如何发布出去。

鉴于国际上还缺乏有关伦理、法律和社会问题的相关的最佳实践，这些问题还在不断的衍生。生物样本库的管理者还应考虑到的问题包括：

1、样本转移协议：在研究项目中不同的研究着之间的生物样本和数据转让应当有法律公正的文件。这些转让协议应当具体，例如，转让的样本是否能够继续进行转让或样本分析的结果是否应当与样本提供者进行共享等。在NCI的样本库最佳实践中就有样本转让协议的模版；

2、知识产权：正如NCI最佳实践中提出的知识产权的共享会影响到样本库的运营模式；

3、共享：样本及数据的共享会影响到样本库的可持续发展。而这些情况是由样本库的管理机构来管理的，同时，这些情况在样本库之间会有很大的差异。一般来说大型的生物样本库会成立相关委员会来管理这方面的内容。NCI的一个试验（the NCI Prostate, Lung, Colorectal, and Ovarian Cancer Screening Trial）就给出了一个很好的例子；

4、所有权和监管权：在美国，样本采集者就是样本的所有者。这一观念长期存在，但现在已经成为诉讼的热点。NCI最佳实践中采用“监管”这一词揭示了生物样本库在其中的地位——生物样本库并不拥有样本的所有权，仅仅是样本的监管者，直到研究结束；

5、研究结果及额外发现的反馈：这些相关但相对独立的问题目前已在生物样本库实践中经常讨论。随着患者了解到越来越多的研究内容，他们便要求获得更多的信息。而现在除了在基因咨询服务中会通知患者外，其他的情况下还没有做到。随着生物样本库集中于临床和疾病状况的研究，很多在原来没有发现的额外新发现变的越来越多。而这些发现如何反馈成为样本库伦理、法律和社会问题中的热点。

2、经济及可持续发展

生物样本库的经济效益越来越受到关注。早期，管理者将样本库设为病理部门或临床机构的一部分，所以并没有过多的考虑到生物样本存储的费用，也没有做出一些商业计划来存进生物样本库的可持续发展。通常，这种样本收集的运作并没有被认为我们目前称之为生物样本库的机构。现在，科研工作者已经在美国的NIH，临床中心和全球其他的单位中组建大型院级样本库。这些生物样本库已经有统一部门或机构进行资助。然而，鉴于过去10年间经济环境的不断恶化，对这种大型生物样本的收集工作的资助很难长久进行下去。生物样本库已经在寻求多种途径来维持其可持续发展，包括:

1、成本回收，仅仅部分达到；

2、与药企或生物技术公司建立合作关系；

3、提供附加服务，如核酸提取、临床分析、存储和咨询服务；

4、节约成本，如自动化、采用更经济的存储策略、增加生物样本的利用率进而减少库存和采用更优化的最佳实践等。

这些措施已经在一定程度上实现了生物样本库的长期可持续发展。然而，生物样本库本质上并不是一个好的赚钱项目。文化和各种制约影响了生物样本库的自立。例如，有人认为生物样本的收集就是用来做科研的，那么生物样本就应该免费的共享。事实上，生物样本库的管理者常常并不知道生物样本在采集、处理和贮存中的花费，而这就很难建立一个好的方案来弥补各种花费。另外，通过销售生物样本来赚钱也是被国家和行业禁止的。

鉴于以上各种情况，已经有一些文章关注于生物样本库的经济情况。NCI BBRB的一篇文章就描述了一种商业模式，提供了生物样本库长期可持续发展最佳实践。图4展示了生物样本库花费的各个方面，也是发展生物样本商业计划的第一步。一个全面的商业计划应当包含上述提到的各个方面来达到长期的可持续发展。然而，多数研究显示，即使精打细算、采用优化的经济规划，生物样本库的运行还是需要外界的资助的，包括公众的或私人的。

尽管有以上种种困难，经过精密的规划，生物样本库的运行还是能实现经济可持续的。Matharoo-Ball & Thomson报道诺丁汉生物样本库通过以下措施就在3年内实现了经济独立：

1、聘请经济学方面的顾问，告知他们生物样本库的各种具体实践；

2、分析各种花费，采用更经济的实践；

3、分析样本的使用情况，最大化回报；

4、建立商业模式，发掘样本的可能使用者；

5、确保生物样本获得的利益与相关股份人的利益是相一致的，这里有与生物样本的长期采集。

图4：生物样本库花费来源

结 论

生物样本的存储工作在过去的几十年见已经发生了很大的改变，由过去病理部门的一个分支——用来收集石蜡和冰冻标本，转变为涵盖多学科的生物样本科学新领域。生物样本科学也有很大的发展，从由生物样本采集和处理的实践中总结出最佳实践，到控制分析前变量、发展循证实践进而促进生物样本库全球化发展。还有其他一些因素影响生物样本行业的成功与否，包括伦理、法律和社会因素，经济因素，IT技术，质量管理体系和相关的培训、资格认证项目。

摘自：Annual Review of Pharmacology & Toxicology

编译：上海万格科学器材有限公司  职庭帆

校审： BioTissue Analytical  刘安根

转载：eBiobank