结直肠癌筛查的应用及其意义

结直肠癌（CRC）是全球发病人数第三多和致死人数第四多的癌症，2012年新诊断结直肠癌病例约140万人，死亡病例70万。CRC的发病率和死亡率地区差异很大，超过三分之二的病例和大约60%的死亡病例出现在高人类发展指数（HDI）的国家。CRC被视为最明确的癌症过渡标志之一，在经历了快速社会经济变革的国家中已经取代了与感染相关的癌症以及主要与西方生活方式相关的癌症成为居民最易患的癌症。

目前在许多中高HDI的国家中（尤其是东欧、亚洲、南美）CRC的发病率和死亡率快速升高，而在一些HDI指数最高的国家如美国、澳大利亚、新西兰和一些西欧国家，CRC的发病率和死亡率却逐步下降或趋于稳定。造成这种现象的原因是这些国家在疾病预防中做出的努力，尤其是早期诊断和息肉切除术（至少在美国）的推广，再加上围手术期护理的进步以及化疗和放疗的进步导致了发病率的下降，造成这些高收入国家CRC的死亡率也呈下降趋势。

根据目前的流行病学调查和人口统计学资料推测，到2030年全球CRC负荷将增加60%，将出现220万新发病例和110万死亡病例。因此了解当前CRC流行的模式及其演变前景非常必要。在此，我们从地理层面上描述了184个国家CRC的发病率和死亡率，在时间层面上描述了37个国家CRC的发病率和死亡率变化趋势，这些数据将有助于将癌症预防和护理与降低癌症负荷关联起来。

图1. 2012年世界范围内男性结直肠癌发病率和死亡率

（根据世界标准人群，每10万人，调整的年龄。）

图2. 男性和女性年龄标准化的结直肠癌发病率（左图）和死亡率（右图）与人类发展指数（HDI）之间的相关性。

图3. （A）最近一段时期（10年）内男性结直肠癌发病率和死亡率的AAPC；

（B）最近一段时期（10年）内女性结直肠癌发病率和死亡率的AAPC

图4. （A）最近一段时期（10年）内男性结直肠癌发病率和死亡率的AAPC；

（B）最近一段时期（10年）内女性结直肠癌发病率和死亡率的AAPC

在美国，结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。根据美国国家卫生统计中心提供的死亡率数据，阿拉斯加当地人和非洲裔的发病率最高，亚裔和太平洋岛屿居民的发病率最低，男性的发病率比女性高30%—40%。种族和性别的时间模式大体相同，但年龄的时间模式不同。2000至2013年间，50岁及以上年龄段的成人发病率为32%，65岁及以上年龄段的老人末端肿瘤发病率下降幅度最大（发病率[IRR]0.50；95%置信区间[CI]，0.48—0.52），50至64岁年龄段人群的直肠肿瘤发病率下降幅度最小（男性IRR，0.91；95%CI，0.85—0.96；女性IRR，1.00；95%CI，0.93—1.08）。2009至2013年，除阿拉斯加外的其他州中，有七个州50岁及以上年龄段人群的总CRC发病率年下降幅度超过5%；但是大部分州的50岁至64岁人群的直肠肿瘤发病率仍然比较稳定。2000至2013年，低于50岁以下人群的CRC发病率上升了22%，这一趋势受到末梢结肠肿瘤（IRR，1.24；95%CI，1.13—1.35）和直肠肿瘤（IRR，1.22；95%CI，1.13-1.31）的驱动。和发病率模式类似，2000至2014年50岁及以上人群的CRC的死亡率下降了34%，50岁以下人群的死亡率上升了13%。在50岁（平均风险）或之前（例如CRC/晚期腺瘤家族史）开始进行筛查有助于抗击CRC，消除高质量治疗的差异。

在美国CRC的发病率和死亡率的大幅度下降，很大程度可归功于筛查预防和早期检测。2008年，ACS、代表美国胃肠病协会的美国多团体结直肠癌任务小组（USMSTF）、美国胃肠镜协会和美国放射学会更新了一般风险成人人群的CRC和腺瘤性息肉早期检测筛查和监测指南。2001年更新了对处于风险升高和高风险成人人群的建议，2006年ACS和USMSTF联合发布了息肉切除术和CRC切除术后监测指南。

建议进行的CRC筛查试验分为2类：1）主要检测癌症的试验，包括粪便潜血试验（gFOBT）和免疫化学粪便潜血试验（FIT）以及脱落DNA（sDNA）的粪便试验；2）能检测癌症和晚期病变的试验，包括内窥镜和反射检查，即弹性乙状结肠镜检查、结肠镜检查、双对比钡剂灌肠检查和CT结肠镜检查（或虚拟结肠镜检查）。这二者的区别有助于初级护理医师了解决策制定并理解这些筛查试验的特点、优势、缺点/局限性。与此同时，还建议对较高CRC风险的个体进行加强监测，这意味着如有可能建议进行结肠镜检查，这包括更加频繁和更早的检查。在这里所涉及的CRC高风险个体，主要指的是：1）存在腺瘤性息肉病史的个体；

2）存在CRC有效切除史的个体；

3）存在CRC家族史或一级亲属诊断为结直肠腺瘤的个体，基于亲属的诊断年龄采取不同的建议；

4）由于炎症性肠病显著发作期间出现高风险的个体；

5）由于已知或疑似存在遗传疾病如林奇综合征（遗传肠癌）或家族性腺瘤性息肉病，存在高风险的个体。

表1. 结直肠癌筛查策略的特点a

表2. 分析中使用的筛查试验特征

图5. 终生结肠直肠筛查策略的益处、伤害和负担。

2008年更新了CRC筛查指南，ACS在建议的高敏粪便试验中加入了sDNA试验；但是在指南发表后不久，该试验被从市场上召回，厂商开始侧重于研发第二代产品。新一代试验与上一代不同的地方是新一代试验是一种多目标试验，即新一代试验将血红蛋白免疫分析与包括KRAS突变、异常基因甲基化和β肌动蛋白的定量分子sDNA试验结合（作为人类DNA定量参考）。升级的sDNA试验的性能特点见2014年的《新英格兰医学杂志》。美国和加拿大年龄在50—84岁定期接受结肠镜检查筛查的人群被招募参与该研究。该研究的参与者被要求提供粪便样品并签署90天内完成结肠镜检查的知情同意书。sDNA试验的检测结果将与同期使用相同粪便样品和结肠镜检查的FIT试验的结果相比较。在9989名可以评估的参与者中，65名参与者患有CRC（0.7%），757名参与者（7.6%）的结肠存在晚期腺瘤或≥1cm的固着锯齿状息肉。sDNA试验检测CRC和晚期病变的灵敏度分别为92.3%和42.4%，而FIT检测这两项的灵敏度分别为73.8%和23.8%。研究者估计需要进行筛查检测一种癌症的数量，使用结肠镜检查为154，使用多目标试验为156，使用FIT为208。2014年FDA批准了多目标试验Cologuard进行CRC筛查，医疗保险和医疗补助计划（CMS）已经批准存在一般结直肠癌风险的个人使用大肠卫士进行CRC筛查时医疗保险准予报销。基于研究的结果和FDA的决定，ACS撤销之前关于sDNA试验的决定，目前的指南重新将sDNA试验纳入推荐，按照厂商的建议以三年为间隔使用sDNA试验进行筛查。

为了更加详细的对CRC患者的肿瘤类型进行深入研究，研究者对1998到2007年华盛顿州西雅图结肠癌家族登记项目中诊断为侵袭性CRC的患者（n=2706）进行了招募，对这些参与者进行生存评估直到2012年。从2050名参与者中采集肿瘤样品并基于下列肿瘤标志物分为5个亚型：1型（微卫星不稳定性[MSI]高，CpG岛甲基化表型[CIMP]阳性，BRAF突变阳性，KRAS突变阴性）；2型（微卫星稳定[MSS]或MSI低，无CIMP，BRAF突变阴性，KRAS突变阳性）；3型（MSS或MSI低，无CIMP。BRAF突变阴性，KRAS突变阳性）；4型（MSS或MIS低。无CIMP，BRAF和KRAS突变阴性）；5型（MSI高。无CIMP，BRAF和KRAS突变阴性）。使用多重填充来填充丢失数据的肿瘤标志物（1-3个）。研究手段利用COX回归估计风险比（HR）和95%置信区间（CI）观测特异性疾病亚型与总死亡率之间的关系，调整了年龄、性别、体重、诊断年份和吸烟史。研究结果表明，与患有4型肿瘤的参与者相比，患有2型肿瘤的参与者的特异性疾病死亡率最高（HR=2.20，95%CI：1.47-3.31）；患有3型肿瘤的受试者的特异性疾病死亡率也较高（HR=1.32，95%CI：1.07-1.63）。5型肿瘤患者的特异性疾病死亡率最低（HR=0.30，95%CI：0.14—0.66）。与总死亡率之间的关系和与特异性疾病死亡率之间的关系类似。这一病因学途径定义的CRC亚型与存活率之间的关系显著不同，说明了CRC分子多样性的临床重要性。

 除了对上述基因组基因信息的研究与挖掘，随着科学技术的不断进步，游离细胞DNA（cell free DNA）正在成为一类新的肿瘤检测与诊断的生物标志物。

cfDNA和ctDNA的特点

大部分的细胞在凋亡或坏死时会释放cfDNA，数量可能很大。在血液循环之外，可在多种体液中检出cfDNA，包括尿液、脑脊髓液、胸膜液和唾液。cfDNA分子的遗传和表观遗传变化反应起源于细胞的基因组和表观基因组。甲基化分析揭示健康个体血浆内的大部分cfDNA来自造血细胞。这些细胞在高强度运动后会释放cfDNA。观察证明循环中cfDNA的半衰期为16分钟至2.5小时，足以通过ctDNA分析“实时”获取疾病负担情况。其他研究表明cfDNA通过核酸反应进入循环，并通过肾排泄进入尿液。肝脾会摄取cfDNA，随后被巨噬细胞分解，也会导致体液中出现cfDNA。由于细胞膜、胞外囊泡和蛋白质的关系不同，循环中个体片段的稳定性可能会增加。

大约20年前，研究者就通过凝胶电泳测定了cfDNA的分子大小为~180bp，这表明cfDNA可能与核小体有关。基于测序的方法已经精确测量其尺寸为166bp，这与围绕核小体的DNA长度（~147bp）加上与组蛋白H1相关的连接DNA之后的长度相近。cfDNA片段大小显示10bp的梯形模式，表面上这是由核酸酶在具有DNA双螺旋的暴露位点分裂DNA链所致。血浆和尿液的cfDNA裂解规律不同，这与尿液中的核酸酶活性较高有关。

血浆中cfDNA分子比非突变cfDNA分子短，PCR和测序已经证实了这一点。动物异体移植试验是研究cfDNA的好方法，因为任何人体DNA序列必须要源于肿瘤异体移植物。在小鼠一种移植模型内测量的cfDNA片段的长度介于134至144bp之间，但导致该长度较短的原因不明。相对于母体的cfDNA，胎儿的cfDNA片段长度也较短于接受移植的患者体内相对于造血细胞衍生的cfDNA片段，非造血细胞衍生的cfDNA片段也较短。造血细胞间核小体环绕和核酸酶活动的不同是cfDNA大小不一的主要原因，其他组织也有可能发挥一定的作用。使用长阅读测序技术已经鉴别出健康个体体内存在的长cfDNA片段（>1000bp），这些长片段释放到血液中可能与外来体或肿瘤细胞凋亡有关。现有提取方法通常不能回收这些长片段。常用的文库制备方法则引入进一步的偏移：单链DNA文库制备可以使用损伤的末端回收DNA片段，应用到cfDNA时，该方法鉴别出大量的短于100碱基的片段。多种提取和测序方法可能因此形成互补数据。这些数据与相应组织样品的组织学分析结合能为cfDNA片段的生物学测定和cfDNA的生物学来源提供新的思路。

生理学和病理学考虑

cfDNA已经被认为是Toll样受体9（TLR9）的配体，该受体主要在免疫细胞丰富的组织内被发现，是外来DNA片段传感器。在小鼠体内，与肥胖相关的脂肪细胞降解会释放cfDNA导致巨噬细胞通过TLR9活化积聚，造成脂肪组织炎症和胰岛素耐受。另一项研究表明cfDNA可能通过TLR9相关的信号抑制凋亡前半胱天冬酶，发挥免疫调节作用。

体外试验表明cfDNA可能通过细胞内化，提高cfDNA分子介导基因或DNA水平转移的可能性。一项报告显示尽管疾病分离避免肿瘤细胞污染，但是和KRAS突变结直肠癌患者血浆样品相关的NIH-3T3小鼠细胞可以在体外转化。另一项研究证明，ctDNA通过非同源末端连接整合到受体细胞核DNA内。线粒体DNA也观测到类似现象。总之，对于cfDNA和ctDNA而言要探究的东西还有很多，加深对这二者的了解对cfDNA和ctDNA在肿瘤学中的应用具有重要影响。

ctDNA分析的方法

ctDNA的分析范围很广，从单一突变到全基因组分析都有涉及。个体突变分析采用设计合理的试验能以简单的流程达到高灵敏度。Mid-2000s用于血清和血浆热点突变检测后就开始使用等位基因特异性PCR方法了。一些试验以试剂盒的形式获批进行临床应用，但是分析灵敏度有限。微流体平台的DPCR试验是高灵敏度定量试验，广泛用于ctDNA水平定量。在选定的基因座改进检测已经被单碱基延伸法、电泳突变等位基因富集方法、核酸酶活性或改进的PCR证明。这些试验具有多重能力，依靠突变和野生型等位基因的特异亲和力。但大部分试验需要针对突变或靶定的基因座的特殊引物或探针，性能有限。因此这些试验通常适用于研究少量突变和热点癌症突变的分析。如果样品需要多个反应，就会增加采样误差，对于拷贝数非常低的突变DNA，试验的总体性能会大幅下降。

为了研究较大数量的基因座，可以利用PCR扩增或杂交捕获技术的靶向测序。测序区域可能为单个外显子（千碱基）到整个基因组（~50Mb）。现有基因测序试验能采用大于1%的等位基因片段检测突变。通过降低测序的背景错误率—例如通过分子条码，或运行多个副本—可以在低于0.1%的等位基因片段检测ctDNA。基于扩增子的试验已经被优化用于ctDNA分析，这类试验可以在数千个碱基中标定几十到上千个扩增子，同时具有高灵敏度。杂交捕获方法可以将研究的基因组区域增加到几十到上千个碱基。即使输入材料有限，但通过使用多个患者特异性试验结合靶向测序的方法，可以进一步提高ctDNA检测的灵敏度。

通过对全基因组的低深度（~0.1X覆盖范围）测序，可以鉴别扩增和缺失，样品间或样品和对照组间相同大小基因组区域测序读数的相对数量可以进行后续比较。这样的影子WGS（sWGS）已经用于检测胎儿异倍性，还可以用于检测特殊癌症拷贝数变化。SWGS的突变等位基因片段检测限为5%至10%，所以在检测较早阶段的疾病时灵敏度有限。如果需要对少量循环拷贝数变化进行分子检测，就需要通过单核苷酸多态性靶向测序实现较高的灵敏度，使检测的拷贝数变化低至0.5%。

试验的检测限会因个体疾病状态和肿瘤突变的特征发生变化。通常会通过先前患者肿瘤样品中鉴别的定量突变（或其他变化）评估血浆肿瘤负担。对于需要多个基因或热点试验检测的突变，假阳性的风险会随着多重假设试验的试验规模的增加而增加，还需要过滤器增加特异性；但是使用过滤器会降低罕见变异体的灵敏度。之前关于突变的认知（例如通过肿瘤测序数据）能检测背景错误率之上的特殊患者突变。因此，除用于突变特点描述外，基于测序的试验是ctDNA测量和监测的灵敏定量工具。

使用多种方法可以定量ctDNA，如突变等位基因浓度（每毫升拷贝数），或突变等位基因片段。每种方法都受到分析、分析前和生理特征的不同影响。例如，ctDNA周转率的代谢变化对突变等位基因的影响大，但是对突变等位基因片段的影响小，且影响血细胞内种系DNA释放的分析前因素会以较大的幅度减少突变等位基因片段。ctDNA的分析（片段和浓度）以及总cfDNA和ctDNA片段的分析能提供补充信息，在以不同的方式使用或联合使用时具有一定的优势。

概念验证研究是ctDNA临床应用大型前瞻性研究的良好起点，证明ctDNA可能是药物研发、瘤内多样性和克隆演化的有用研究工具。未来比较ctDNA指导决策和护理标准的随机试验将是决定性的，EMA已经为这样的试验试剂提供了良好的实践指南。检验ctDNA分析用于临床治疗监测的试验正在进行。在一项试验中，接受埃罗替尼治疗的NSCLC患者正在接受前瞻性监测，如果血浆内出现耐药突变，则将进行额外检测研究疾病进展的信号。另一项旨在证明晚期乳腺癌患者血浆内鉴别出的靶向突变的效果，该研究的发现将仅支持未来血浆突变图谱的应用和治疗分层。总之，这些研究强调该领域正在从ctDNA的探索阶段向ctDNA指导决策制定的临床试验阶段发展。

加深对cfDNA和ctDNA的理解将有助于实施液体活检。应该研究治疗的不同时间点，细胞凋亡、坏死核活性释放对这二者的作用。我们对cfDNA释放和清除机制的有限理解阻碍了目前研究的解析。在不进行解析的情况下，进行ctDNA测量再现和动态研究将变得非常重要，因此我们试图解析治疗反应的ctDNA信号。所有肿瘤亚克隆与总ctDNA是否成比例或它们在血流内的表现是否基于其他生物因素如肿瘤血管或代谢活动目前尚不明了。体外细胞条码试验和尸检能说明个体亚克隆的作用，组织学研究可能能够明确调节ctDNA释放的因素。ctDNA和cfDNA片段的大小不同说明在回收特定大小的片段时，优化处理和提取方法可能能够改进整体性能。

尽管ctDNA分析与其他循环生物标志物分析相比灵敏度和特异性较高，但是采用多标志物方法能对患者疾病状况有更加全面的了解。例如，总cfDNA浓度与疾病状态和预后有关。cfDNA的表观遗传学分析能鉴别癌症基因的超甲基化或使cfDNA片段水平升高的细胞类型，可能能够提供关于肿瘤微环境的信息，锁定体细胞突变。其他循环核酸如mRNA和微小RNA能提供额外层面的信息。靶定具有独立释放机制的多种核酸类型（例如通过隔离核外RNA和cfDNA）可能能够提高MRD的检测灵敏度。活跃释放的核酸可能是检测对疗法具有耐受性亚克隆内突变的优先选择，但是疗法开始后死亡的细胞的片段可能能够鉴别对治疗有反应的亚克隆。尽管可能从cfDNA一段基因表达方式，外来体、CTC或血小板内的测序RNA能提供更加直接的证据。血浆和其他体液如尿液或脑脊液内的cfDNA分析能提供补充信息。我们进一步强调Gormally等人十年前的建议：与cfDNA有关的蛋白的特征是患者疾病和cfDNA生物学丰富的信息来源。

临床采用液体活检取决于患者和医师的实践优势、所需基础设施和经济状况。组织活检将在癌症管理中继续发挥关键作用，尤其是组织学诊断和癌症分类。目前，专业的实验室已经开始处理CTC和ctDNA样品，未来在条件允许的情况下，医院实验室可能也能够执行本地分析。

具有个体热点突变鉴别临床级别灵敏度的床旁护理设备开始用于组织和血浆样品。2015年首次证明了孕妇血浆DNA单分子（第三代）测序的可行性，随后证明可以检测细胞系DNA结构性变异。埃博拉病毒肆虐期间这些设备的灵活性证明它们可以进行实时基因组监测。目前这些平台的缺点是错误率高，使得单核苷酸变异和插入缺失的检测存在挑战。其他的挑战还包括短DNA片段测序，这需要最优化的文库制备方法。测序能力也受到限制（目前为~150Mb）。通过实时选择性测序可以靶定特殊扩增子。这些研究支持床旁分子检测，尤其是不需要费时费力的DNA纯化步骤时，可以对血浆进行分析。

最初EMA和FDA批准该方法用作血浆内突变检测的伴随诊断，新出现的ctDNA临床试验是液体活检在个体化肿瘤学实际应用中的里程碑。随着技术的改进，癌症的无创分子分析的使用范围会越来越广，提供的信息有助于开启新的基因组研究之门，并有助于临床决策。为了完全发挥液体活检的潜在能力，进一步探究ctDNA的生物学非常关键。因此液体活检尚有大规模应用的潜力，且已经开始让患者获益。

图6. 疾病管理期间循环肿瘤DNA分析的应用。

A. 假设接受手术（或其他疗法）、出现复发接着接受系统治疗的患者的时间进程图解。说明了患者护理期间液体活检的潜在应用。患者开始时侧重单一疾病，但在治疗后出现多次转移和明显克隆（以其他颜色表示）。

B. 被分类的循环肿瘤DNA（ctDNA）提供的信息，广义上作为定量信息（与肿瘤负担相关）或基因组信息。单一时间点的ctDNA定量能对疾病和预后进行分级，基因组分析能指导靶向疗法选择。因此纵向分析允许定量跟踪肿瘤负担，监测治疗反应，如通过比较随时间变化的基因组图谱，可以检测克隆演化。

图7. 无细胞DNA的来源和变化范围。细胞通过凋亡、坏死和分泌释放无细胞DNA（cfDNA）。

cfDNA可能来自癌细胞，但还可能来自肿瘤微环境、免疫或其他器官的细胞。血流中，cfDNA可以呈游离状态或与胞外囊泡如外来体有关。cfDNA中能发现遗传和表观遗传变化的多个分层。

图8. 当前和未来灵敏检测循环肿瘤DNA的算法。

A. ctDNA的分析可以从单一基因座解析到全基因组分析。现有数字PCR试验可以凭借简单的工作流程实现高灵敏度，但是不能多重使用，性能有限。靶向测序通过抑制背景噪声可以解析多个基因座且灵敏度高。

B. 分子条码中，唯一的分子序列在文库制备时被添加到每个分子，因此来自相同开始分子的测序读数可以被鉴别出来。通过比较所有相同分子的读数，可以获得单一共有序列，因此可以防止PCR或测序的错误。

C. 为了提高分析的灵敏度—例如疾病诊断—可能共同使用其他体液或取代血浆。体液采样或邻近肿瘤位点的细胞学标本升恒的肿瘤DNA浓度高于血浆中的浓度。

D. 循环肿瘤DNA（ctDNA）的长度比cfDNA短。因此试验选择较短的片段可能富集癌症源头的序列，能够提高低ctDNA百分比样品的灵敏度。

表4 循环肿瘤DNA分析实用性和技术平台的比较

ARMS，amplification-refractory突变系统；BEAMing，微珠、乳液、扩增和磁性；CAPP-Seq，深度测序癌症个性化特征表述；CE欧盟认证；cfDNA，无细胞DNA；ctDNA，循环肿瘤DNA；COLD-PCR，较低可变温度共扩增PCR；EGFR，表皮生长因子；FAST-SeqS，快速非整倍性筛查试验测序系统；FDA，美国食品药品监督管理局；LINE-1：长散布核苷酸要素1；mFAST-SeqS，改进型FAST-SeqS；NaME-PrO，探针重叠核酸酶辅助次要等位基因富集；PARE末端重排个性化分析；Plasma-Seq，血浆测序；Safe-SeqS，安全测序系统；SCODA，同时阻力系数变化；Tam-Seq，标记的扩增子深度测序；WGS，全基因组测序。

图9. CTC和ctDNA作为个体化医疗液体活检的临床应用。

M0患者和发生转移的M1患者可重复采集血样预测复发，监测治疗效果，理解潜在耐药机制。治疗前可以对患者进行分层，给予最有效的药物，坚持治疗后CTC/ctDNA增多表明疗法耐受，这些信息可以让患者在肿瘤负荷更重且不可治愈、或突变前及早采用更有效的疗法。BC：乳腺癌；PC：前列腺癌；CRC：结直肠癌。

图10. 有效和无效疗法对CTC和ctDNA的影响。

A. 如果治疗有效则患者反应良好，原发和/或转移位点的大部分敏感肿瘤细胞被治疗摧毁。作为直接的结果，对疗法敏感的肿瘤细胞（橙色）凋亡并释放肿瘤DNA（ctDNA）到外周血液中。但是，有活性的肿瘤细胞（紫色）的少量具有耐受性的亚克隆将增殖并释放CTC到血液中而不是释放DNA。这些细胞的一小部分可能最终凋亡并释放少量的DNA（紫色）到血液循环中。

B. 如果疗法无效，患者反应不良并存在少量对治疗敏感的肿瘤细胞（橙色）但是治疗前许多对疗法具有耐受性的肿瘤细胞（紫色）就已经存在。疗法将消除敏感的肿瘤细胞，但是具有耐受性的肿瘤细胞会存活下来、增殖并通过血流扩散增加数量而不是释放大量的肿瘤DNA（紫色）。

cfDNA的应用大大提高了液体活检（liquid biopsy）的检测能力，而存在于血清中的其他ctDNA，例如miRNA则对于大肠癌的诊断和预后都具有重要的作用。

研究者在58对原发CRC（pCRC）和相应匹配的肝脏转移（LM）患者以及186份血清和154份匹配组织标本中（群体1），使用定量PCR对miR-203的表达进行了表征。然后，在独立的群体（群体2）中对144份CRC患者的血清miR-203进行了测定，从而建立了CRC转移相关研究模型。并通过原位杂交测定组织内miR-203的表达模式。

与匹配的pCRC组织相比，LM的miR-203表达显著上调。血清miR-203以阶段独立的方式显著上调，高miR-203表达与两个患者群体中患者的低存活率有关。血清miR-203水平升高表明较差预后的风险高（HR=2.1），淋巴结节转移（OR=2.5）、肝脏转移（OR=6.2）、腹膜转移（OR=7.2）和远端器官转移（OR=4.4）的风险高。与对照组相比，肝脏或全身转移的动物血清miR-203的水平显著较高。这一研究结果表明，高水平的血清miR-203与较差的存活率和转移有关，提示其可作为CRC患者的无创预后和转移预测生物标志物。

除此之外，miRNA还能够被用于作为CRC早期筛查与诊断的生物标志物。miRNA是很短（20-22nt）的非编码RNA，通过mRNA降解或平移抑制下调基因表达。已经发现多种癌症组织存在不同的miRNA表达，不同的miRNA存在不同的致癌作用和肿瘤抑制作用。2008年，Chen等人在人血和其他动物血液的血浆和血清成分中发现了miRNA。该研究证明在暴露于极端严峻的外部条件如极低或极高pH、10次冻融循环、超期储存、沸腾和核糖核酸消化后miRNA在血清中仍能保持稳定。此外，由于存在于血清和血浆中，在体液中如尿液、唾液、羊水中都能检出miRNA，使其成为疾病无创生物标志物的理想选择。

循环miRNA的表达具有区分前列腺、卵巢、肺部和乳腺癌症患者和健康对照组的潜力。一些研究探索了循环miRNA检测CRC的应用。最初的研究分析了一小部分CRC患者样品中的循环miRNA，并与健康对照组进行了比较。其他研究对miRNA在混合血浆样品中的性能进行了分析并利用额外的个体样品确认了候选生物标志物。其他研究在更大的样品组中进行研究之前利用少量CRC组织/血清/血浆样品进行了性能研究。这些研究得到的结果有时相互矛盾，因此最近又有研究利用更大的样品组进行性能分析，更大的样品组包括腺瘤患者的血浆，希望能改进疾病监测的特异性。

2008年，美国癌症协会公布的指南强调了早期癌症检测、检测并且摘除息肉和筛查对疾病预防的重要性。利用循环生物标志物对CRC进行早期检测的研究经费不足，而且缺乏腺瘤性息肉样品，不能区分早期和晚期癌症。研究者对48份血浆样品的研究数据集执行了667种miRNA的性能分析，研究组包括8份正常血浆、8份息肉样品、16份腺瘤样品、8份早期癌症样品（I/II期）和8份晚期癌症样品（III/IV期）。随后在一个确定群组中对3种miRNA：miR-34a、miR-150和miR-923进行了进一步检测。确定群组包括97个独立血浆样品，分别为20份正常样品、20份息肉样品、20份腺瘤样品、23份早期癌症样品和14份晚期癌症样品。此外，我们在一个包括40份CRC样品和正常对照组织的独立数据集内确认了2种miRNA的表达会发生变化。研究结果表明，高水平的循环miR-34a和低水平的miR150可将息肉患者从晚期癌症患者中鉴别出来（AUC=0.904），低水平的miR-150可将腺瘤患者从晚期癌症患者中鉴别出来（AUC=0.875）。此外，在一个包含40份CRC样品和正常组织对照组的独立公共数据集中也确认了miR-34a和miR150的表达会出现变化。

可见，随着在CRC患者血清中更多的miRNA被检测与分析，相信会有更多的miRNA可作为CRC的检测与筛查标志物，并随着其临床研究的不断深入，其作为商业化产品的成功开发也指日可待。

编译：Will Xavier、张凯