肌酐检测 标准化

一、肌酐检测中可能有的问题

1、肌酐的碱性苦味酸法的反应原理是什么？ 

2、目前检测肌酐的分析大致上有几个方法？ 

3、从上世纪50年代起，推出的自动化肌酐检测方法，与以往

相比有什么不同？ 

4、促使罗氏推出苦味酸补偿法的原因是什么？ 

5、补偿肌酐苦味酸法的含义是什么？ 

5、肌酐酶法的原理是什么？ 

6、今天如何叙述肌酐检测的溯源性？ 

7、罗氏的补偿肌酐结果可否直接与酶法肌酐结果比较？ 

二、肌酐的碱性苦味酸法的反应原理是什么？ 

Jaffe在1886年观察到在碱性条件下肌酐与苦味酸反应形成红色，该反应以他名字任命，已经经历了130年检测的历史。1904年，Folin应用Jaffe反应检测尿液的肌酐。可是，从Folin应用起，至今还没有弄清楚：究竟肌酐与碱性苦味酸是怎样反应的！即：肌酐的Jaffe反应只是一个现象的描述，不是什么反应原理！所以，肌酐的Jaffe反应没有检测原理。

从Folin开始，推出的Jaffe肌酐反应，使用了全血标本，经钨酸试剂去除蛋白后，以无蛋白血滤液参与反应的。因为如此的前处理，无蛋白血滤液去除了血液中的所有蛋白，再进行Jaffe反应时，肌酐受到现今那样的蛋白干扰大致上是没有的！因此，在很长时间里，以样品的无蛋白血滤液进行的肌酐测定是肌酐的“参考方法”。今天的肌酐检测中，遇到的所谓“假性肌酐”的色素问题是自动化要求肌酐直接检测引入的！

三、目前检测肌酐的分析大致上有几个方法？ 

答：环绕克服干扰问题，肌酐检测的方法学从历史上开始大致上可以分为：

Folin的去蛋白Jaffe反应检测；

1960年代起不除蛋白的Jaffe直接检测终点法；

Jaffe速率法（未补偿Jaffe方法）；

Jaffe速率法（补偿Jaffe方法）；

采用系列酶的比色法（酶法，以罗氏产品为代表）；

强生干片酶法等（干片酶法）。

四、从上世纪50年代起，推出的自动化肌酐检测方法，与以往相比有什么不同？ 

答：先打个比方，以往早餐吃豆浆是一定要处理黄豆，将黄豆浸泡、磨成浆、分离去除豆渣、煮沸豆浆后饮用。经典肌酐碱性苦味酸方法是，必须将肌酐从样品中分离（这是当时检验条件很差之故），然后在加入碱性苦味酸反应、比色测定。今天家用的豆浆机，实际上是将浸泡的黄豆一起打碎后，不过滤直接煮沸后，就吃了！这表面上看起来像一杯豆浆，其实是混合物。

自动化要求推动直接使用样品。临床实验室依然必须检测肌酐！但是检测的样品是肌酐在内的一个复杂混合体！即需要直接采用血清或血浆的肌酐Jaffe反应方法。为了可直接检测，不出现因蛋白存在产生沉淀，可用即可，为此调整碱性苦味酸内各个组分的用量、以及调整样品和试剂的比例等。为了避免出现蛋白沉淀，也使用了表面活性剂，但自动化初期阶段还是Jaffe反应的终点法。

很快就认识到样品中的蛋白为主的非肌酐组分，对肌酐结果影响很大。出现了使用以血清为基础的校准品，作为肌酐克服基质效应的措施出现了，开始研究Jaffe反应过程，确定肌酐与碱性苦味酸反应很快，干扰作用反应则慢得多，提出反应初期的Jaffe反应速率法检测肌酐。这应该是现今依然被广泛使用的分析仪上的肌酐Jaffe反应的检测方法基础。

现今的直接肌酐Jaffe反应检测，所有的检测方法全部为反应初期的速率法。大多采用了以血清为基础的校准品，都采用或宣称SRM 914a为原始第一标准，对报告结果不做任何数学处理（即为非补偿Jaffe方法）。所有现今的碱性苦味酸检测方法，均宣称：反应线性良好，是速率法，可溯源至SRM914a，与其他公司产品具有良好的相关等。

五、促使罗氏推出苦味酸补偿法的原因是什么？ 

答：1、酶法检测肌酐的推出，对临床实验室的肌酐检测是一个很关键的挑战。使用当今认可的核素稀释-质谱分析的参考方法，按照严格定值方案对多份新鲜病人样品赋予肌酐参考值；酶法通过这些血清的参考值，将可靠性传递给酶法专用的校准品。然后，肌酐酶法与ID-MS参考方法的直接比较，充分说明酶法是所有进入常规实验室的肌酐检测方法中最佳的。可是，肌酐酶法试剂价格与苦味酸方法相比要昂贵得多。因此，尽管在检测结果可靠性上，酶法结果被大家认可，但是全球的临床实验室依然在苦苦使用苦味酸方法的目的，还是要节约实验室的开支。因此，追求苦味酸方法的检测结果可靠，成为临床实验室永远的课题。

2、肌酐酶法在许多文献中，与各个Jaffe反应速率方法比较，都指出了现今的Jaffe反应速率方法非特异性的问题。由于所有现有的Jaffe反应速率法，直接使用人血清，出现的非特异性问题大多是样品中蛋白所致的“非肌酐色素”问题。与最早的去除蛋白后，再与碱性苦味酸反应具有的干扰不相似。因“非肌酐色素”使所有Jaffe反应的肌酐检测结果，明显高于酶法结果。如何使现有的Jaffe反应直接速率法也能够得到与酶法估计的eGFR一致?

3、通过室间质量评估比对、病人样品肌酐检测结果比对，罗氏公司率先提出，对现有的Jaffe反应直接速率法进行“补偿”，使肌酐检测结果的数值与酶法肌酐结果相近。为便于分类和理解，将直接Jaffe速率方法被给予补偿的方法，以下称为：补偿Jaffe方法。

六、补偿肌酐苦味酸法的含义是什么？ 

答：1、既然未补偿的Jaffe肌酐方法结果偏高的原因是样品内蛋白所致，假设一般样品内蛋白含量相似，它们的存在使肌酐结果偏高。因此，要使Jaffe肌酐方法结果与ID-MS参考方法或酶法相似，需要减去偏高的那部分。所以，“补偿”做法就是在Jaffe肌酐结果中，减去一部分肌酐量。

2、补偿肌酐法的原理。这是罗氏前身六个美国实验室在BMC/Hitachi系统上研究空白速率的肌酐/Jaffe方法的参考区间时形成的。调整所有去除空白的速率肌酐/Jaffe方法肌酐值，即对检测结果的补偿（-0.3mg/dl）。以纠正没有血清基质的盐水空白参与实际反应被表示为肌酐的值，这是由BMC（原罗氏前身）推荐的。

为了弄清这个补偿的做法，以图1说明。

图1中是以肌酐的同位素稀释的质谱参考方法为准，与肌酐的Jaffe苦味酸速率去空白的方法，一起对多例患者样品进行比较。图中实线为比较结果的直线回归线。该线的回归等式为y=0.793x +0.243。肌酐的检测结果值以mg/dl表示。这个结果说明，由于Jaffe的苦味酸速率法受到血清内蛋白的干扰，既表现为有正截距的干扰，但却又使所有血清检测结果较参考方法偏低。

为了使Jaffe方法的实际相应值（y），得到相当于x的值，由回归关系：Y=0.793X+0.247（mg/dl）转换为：0.793X=Y-0.247，这样，可以使Jaffe直接速率法的结果，被回归关系调整为相当于ID-MS值。再做一些数学处理：

即：如果将校准的值纠正为：检测值/斜率（y/0.793），令y/0.793为y’，则原有的既不通过原点、斜率又不等于1的直线，成为新y’的只有一个截距为0.31mg/dl的、但斜率为1的直线。（如下图所示）。

图1. 肌酐Jaffe速率扣除空白速率方法与

参考方法IDMS对六份血清比对。

图2. 补偿肌酐Jaffe速率空白方法与参考方法IDMS对六份血清比对。

图2中虚线表示的为，按照上述的比较结果，经换算后以新y’的关系，表达为斜率为1、但有截距为0.31mg/dl的直线。若将每个检测结果除了除以0.793外，还减去截距0.31mg/dl（换算为μmol/L，则为27μmol/L），则所有变换的肌酐结果就与肌酐参考方法的结果，具有y’=1.000x+0.012的关系。

按照新的校准点方式，使原先比对结果成为了具有截距为约0.3mg/dl（27μmol/L）的、斜率为1的直线。因此对所有的比对结果，先除以斜率、再减去0.3mg/dl（27μmol/L），则所有Jaffe结果经补偿（减去27μmol/L）后的值与ID-MS结果形成了如图表示的：斜率为1、截距仅为0.012mg/dl（1μmol/L）的回归直线。

因此补偿的意义是为了克服非肌酐参与Jaffe反应组分干扰，如蛋白、葡萄糖、抗坏血酸、酮体等，在所有Jaffe反应的血清结果上减去27μmol/L（0.3mg/dl）。这个数量反映了血清基质参与Jaffe反应的平均贡献，这是在多中心研究中得到的。这意即无肌酐血清参与Jaffe方法反应得到的平均0.3mg/dl肌酐；这样一个“空白值”的存在，早期就有报告，但从来没有被正式应用。

问题是，这样的结论是使用了正常健康人得到的。在肾病患者中，所有患者血清内蛋白含量相差很大。这样的补偿并没有真正解决肌酐不可靠的问题。

七、肌酐酶法的原理是什么？

醌亚胺的颜色深浅直接与肌酐的浓度呈正比例，可以通过光度计检测。（注：SOD为肌氨酸氧化酶，POD为过氧化物酶，HTIB为2,4,6-三碘-3-羟基苯甲酸）。

目前，临床实验室公认，肌酐的酶法检测结果是最可靠的。当然，任何一个检测方法不是十全十美的，也已经注意到酶学肌酐检测方法中的一些问题。

八、肌酐检测现状

临床需要准确的血清肌酐检测用于计算估计肾小球滤过率(eGFR)很关键，关系到全球卫生保健，致力于改善慢性肾病的诊断和治疗。

校准的标准化，如实施校准的溯源性至较高等级的参考检测方法和参考物质，但不能纠正大量常规方法的分析干扰（非特异性偏倚）。

补偿的Jaffe方法假设了非肌酐的色素干扰在样品间是恒定的，这过于简单了。尽管得到的结果与参考方法（核素稀释-质谱分析）很接近；使血浆蛋白的假性肌酐影响最小，但无法回避碱性苦味酸方法对非肌酐色素的敏感性。

罗氏公司目前的补偿肌酐方法和酶法，都已经将患者样品的检测结果可溯源至ID/MS（核素稀释质谱法）。但是，必须注意：不可随意将罗氏的补偿法与酶法互相进行患者样品检测结果的比较！罗氏永远是：补偿法的自行比较！或是酶法不同系统间的自行比较！ 

全世界所有诊断产品公司的肌酐检测，都声称他们的肌酐检测具有溯源性！但是，常规方法的分析非特异性，即没有能力真正检测单一肌酐的，实施溯源性不能解决与检测非特异性有关的分析干扰。因为标准化没有纠正分析非特异性问题。

另一方面，大家很了解的，由于包括蛋白、酮体和葡萄糖等的所谓血浆假性肌酐色素参与反应的结果，以碱性苦味酸的方法会过多地估计血清肌酐真实浓度，肌酐值低于177mmol/L（2.00 mg/dl）的，引入很大的比例误差。即使将校准品的值调整至与IDMS一致，似乎消除了潜在校准误差后，依然还存在问题。 

有文章揭示了，一些公司在介绍肌酐产品优秀时的表现，自认为非常好。可是仔细分析，可以发现掩盖不了的事实是：斜率0.963；截距为0.204mg/dl。与目前临床要求用于计算eGFR的肌酐和CysC的检测结果，都必须具有溯源性。对于肌酐检测结果具有溯源性似乎很方便，因为每个公司都宣称它们的肌酐检测产品都有溯源性。可惜了，肌酐检测复杂性，并不是声称具有溯源性就可以了。

图3. Olympus碱性苦味酸（Jaffe）方法（AU2700平台）和气相层析核素稀释质谱（IDMS）参考方法的血清肌酐结果比较的回归分析和偏倚图。

图4. 血清肌酐的IDMS参考值与Olympus重新校准的

Jaffe方法间的绝对差异分布

意大利著名的学者M.Panteghini在一些专门讨论肌酐检测问题的文章中，又列出了图4为示例。图4说明，Olympus的Jaffe检测方法在说明书上指出，它们已经以NIST SRM 909b标准化了（重校准），它们的二级参考物质以IDMS对肌酐定值。可是，这样的检测系统与IDMS参考方法比对中，出现了肌酐浓度在较低浓度下，该检测系统与参考方法检测偏移均为正偏移。因此，Jaffe的苦味酸方法无论怎样努力，都解决不了它的致命偏移。

九、肌酐检测标准化的趋势 —— 一致性

1、肌酐结果正确度现状归纳

自上世纪末以来，有关肌酐检测可靠性报告不断，对多个肌酐检测方法的比较很多。大多报告承认目前的肌酐检测方法中，酶法（以罗氏产品为代表）结果是较好的、可靠的、可以溯源至公认的核素稀释-质谱分析（ID-MS）参考方法。

为了迎合大多临床实验室依然使用价廉的Jaffe试剂进行常规肌酐的检测需求，有无可能让Jaffe方法结果也能好一些，因此，出现了补偿的Jaffe方法。可是，该方法仅在一个较小的范围内有效，针对儿科和老年病人等依然有问题。

强生的干片酶法的评论褒贬不一。对广泛采用的直接Jaffe速率方法（未补偿）的结果可靠性，大众的评价均承认是问题，普遍结果偏高，不正确。但是，临床肾病专科对肌酐检测可靠性还很模糊。尤其国内，实验室已经改用了酶法检测肌酐，临床却认为为何病人的肌酐这么低！

室间质量评估的结果似乎并没有显示肌酐的严重问题。关键是质量评估采用的调查样品均为“处理过的样品”，它们与新鲜的病人标本间又产生了新的基质差异。调查后的结果处理，大多采用对等方法学组分类（Peer Group）归纳，互相比较差异不大。国内调查的虚假行为太多，无法予以确认。呼吁采用病人新鲜样品进行质量评估的呼声越来越高，而且不少这样的调查已经说明了问题。

但是，领先的肾内科的临床，已经强烈要求临床实验室尽早将肌酐检测的正确度放在第一位，尤其是儿科的肾内科的要求。要注意一些模糊的提法：校准改变就可以实现了标准化。这大多指的是诸如Jaffe方法的补偿做法。必须引起注意的是，这样的做法仅是在原有的检测做法上，对发出报告前的一些数据纠正。本质上，检测结果还是无法直接可溯源至参考系统。

国际临床化学学会已经提出，全球应该将肌酐的检测方法能统一到酶法、并建立全球通用的肌酐参考区间。在此基础上，国际肾病专家依据统一的肌酐结果，重新确定新的计算估计肾小球滤过率（eGFR）。这才是真正的可靠估计肾功能的做法，让全世界的人们得益！

2、肌酐的溯源性

也许在国内的任何一个实验室，使用的肌酐检测试剂盒，还找不出认为没有溯源性的！这是大家的回答。

自选试剂盒、任意搭配校准品，试剂厂商显示的报批文件证实说：我国的药监部门认可了他们的试剂盒具有溯源性、他们的校准品有溯源性。你承认吗？在溯源性认识上模糊、错误的情况，从国家到省市药监审批部门，到ISO 15189的实验室认可组织、到基层的临床实验室，简直一团糟！

实现溯源性是针对实验室对新鲜病人样品检测结果的。要使检测结果具有溯源性，一定要使用具有溯源性的检测系统。即：仪器、试剂盒、校准品、操作程序固定组合为检测系统。这个固定的检测系统经与参考系统的新鲜病人标本比对，获得国际认可具有溯源性证书的，才有资格认为具有了对病人样品可以检测出实现溯源性的可靠结果。历史上，肌酐检测一直使用美国标准和测量研究院[NIST，原美国国家标准局（NBS）]发布了SRM 914a为肌酐参考纯物质起，所有试剂盒厂商立即以该标准参考物质为准，校正自己的肌酐标准液。以这样的做法，在美国、在我国，都很快就认可了：不论试剂盒的方法学反应原理，只要标准液以SRM 914a校正的，都被认可。进而，也变成了具有溯源性。标准液是这样，以血清为基础的校准品的定值，只要可追溯源至SRM 914a的，都被说成有溯源性。

3、肌酐“溯源性”≠病人标本结果的可比性

现实问题是：病人标本的肌酐检测结果间一直对不拢。实验室间的室间比对表面上很好，可惜国内的这样的比对无法相信：调查标本不是天然患者标本、实验室间互相通气严重。

就是非常正规的大公司，如罗氏诊断，他们提供了肌酐的Jaffe方法、Jaffe补偿方法、酶法等试剂盒。它们均有溯源性，但是互相间有很明显的差异。

4、ID-MS定值血清怎么了？

卫生部临床检验中心开始向国内临床实验室提供他们采用世界公认的肌酐参考方法，即：核素稀释质谱分析（ID-MS）方法，对多份血清进行定值，形成了当今在肌酐检测上正确度最高的血清。这些血清提供给一些厂商，让他们以这些定值为准，校准它们的校准品值。可是，以为这样实施的临床标本检测结果最可靠，那知：当这个厂商与其他公司比对时，结果依然对不拢！原因何在？关键问题是接受这些血清的公司，他们的肌酐检测本身问题严重！ 其实，所有问题归纳起来，关键是被检测的肌酐被测量定义不明确，即实验室报告的“肌酐”究竟是单纯的肌酐、还是肌酐和内含其他非肌酐组分？又是哪些非肌酐组分与肌酐在一起被称为“肌酐”？这是严重问题！

从最古老的Jaffe检测的“肌酐”起，它就不是检测真正的唯一“纯”肌酐。以后随着肌酐检测方法学的改进、变化，每个方法学检测肌酐的含义不一，这怎么能使表面的“肌酐”对得拢？

5、全球趋势

由于Jaffe试剂成本实在便宜，酶法试剂要贵得多，全球依然留恋廉价的Jaffe试剂，想尽办法予以保留，近期的所谓校准补偿的Jaffe速率（扣除空白速率）方法便是一个代表。酶法的分析性能已经被大众认可，对病人标本的检测结果可靠性基本被肯定。是成本第一，还是质量第一是当今的呼声。相信随着我国经济发展，临床需要真正的肌酐结果，必然会使肌酐检测方法向酶法转移。期望临床实验室不要再等待，为了广大肾病患者的利益，尽早使用酶法检测肌酐。