常规临床实验室血细胞计数仪的验证和标准化

北京医院 卫计委临床检验中心 —— 段敏 王治国

全自动血细胞计数仪（或全自动血液分析仪[Automated hematology analyzers，HA]）是世界上大多数医学诊断实验室的标准设备，是实验室诊断过程中的宝贵工具。HA能够检测血红蛋白（Hb）的浓度、进行血细胞计数以及识别血细胞特征。这种测量通常被称为全血细胞计数（complete blood count，CBC），常被用作健康和疾病的筛查工具。另外，CBC用于随时间观察或监测某些患者特征（即医疗状况或治疗），并报告与这些特征有关的值作为干预和治疗的基础。这种参数的典型例子是Hb的水平，它是输血的主要决定因素。在HA的生产和设计中，厂商进行初始确认是标准程序，并且这也是国家（例如美国食品和药品监督管理局[FDA]）或国际法规（例如，欧盟的体外诊断器械指令中）的要求。这个确认程序的目的是确保厂商对HA性能的声明是有效的，并且该确认过程包括当前HA与前一代仪器的比较。当一个诊断实验室引进一个新的HA，或者将其当前使用的HA更新为一个更现代化的模式时，应该执行一个验证过程，用于表明HA满足专门为该实验室方法设定的要求和预先规定的标准。除了确认和验证之外，标准化在CBC参数中也起着重要的作用。其中一些参数是基于通用的标准参考方法，且与所使用的HA类型无关，而其他CBC参数由大多数厂商报告，因此被认为可能或多或少是具有一定的通用性，而它们可能没有正式标准化。后一组参数会导致实验室间差异的风险增加。另外，还有一些CBC参数不是通用的或标准化的，而是取决于HA的品牌或类型，这些参数在不同的仪器上产生不同的结果。

一、血液学实验室检测标准和指南

有几个在国家层面或国际层面上开展工作的组织制定了协商一致的标准和指南，旨在防止在实验室检测和文件方面的广泛差异。这些组织包括世界卫生组织、国际标准化组织、欧洲和国际一致化会议以及美国FDA。此外，国际血液学标准化委员会（ICSH）和美国临床和实验室标准化研究院（CLSI）最近制定并发布了HA确认和验证的指南和标准，本文将对此进行讨论。这些指南分别是CLSI于2010年发布的《自动血液分析仪的确认、验证和质量保证》以及ICSH于2014年出版的《ICSH血细胞分析仪的评价指南》（包括用于白细胞分类和网织红细胞计数）。使用特定的指南是自愿的，并且仅由执行这些建议的厂商和终端用户负责。根据ISO15189的要求，临床实验室认可程序，对于任何新的HA都必须按照专业标准进行一定程度的验证。它还鼓励实验室考虑患者的风险因素以符合这些标准。

本文概述了在诊断实验室中重要的HA评估步骤，并讨论了有关各种临床重要CBC参数标准化的问题。

二、确认和验证

CBC包括白细胞（WBC）计数、红细胞（RBC）计数、平均细胞体积（MCV）、血红蛋白（Hb）浓度和血小板计数等几个参数。此外，有核红细胞（NRBC）和网织红细胞有时也被视为CBC的标准参数。有些参数在这里没有详细讨论，但是如果适用的话，都应该包含在确认或验证过程中。

（一）检验前过程

检验前的标准化和控制对于生成和报告准确的临床和诊断相关的患者结果至关重要。因此，CBC测定的检验前阶段（即采血过程以及与此过程直接和间接相关的所有问题）也是确认和验证过程的一部分。影响CBC的静脉血或毛细血管血应根据现有的国际指南（如CLSI文件H03和CLSI文件H04），以及根据现有的当地协议和程序进行采集。在标本采集过程中，需要考虑几个重要事项（见表1）。这些事项是对诊断过程中使用的血液样品的要求，也适用于确认或验证方案，因为在比较两个HA时可能导致不同的结果。

表1. 标本采集的标准程序和注意事项

缩略语：EDTA，乙二胺四乙酸；IV，静脉注射

数据引自参考文献1、4、5

通常，当进行确认和验证过程时，在不同的HA上对相同血液样品的基本成分进行测量，并对结果进行比较。在这方面最重要的检验前变量是时间，因为CBC参数的时间依赖性改变可能会发生，因为CBC是在经历时间依赖性退行性过程的活细胞上测量的。最显著的时间依赖性变化包括可通过参考显微镜观察到的形态改变引起的血细胞体积（MCV和平均血小板体积[MPV]增加）和WBC分类的变化，但也会观察到其他时间依赖性改变。因此，在确认和验证过程中，应该密切监测抽血与HA检测之间的时间间隔。样品检测应在静脉穿刺后4~8小时内进行，并且应在4小时内对两台HA的检测结果进行比对，以使比对的样品尽可能相似。ICSH和CLSI都提供了有关干扰物质的详细指南，从脂质到凝块干扰；这些超出了本文的讨论范围（排除标准和内在干扰）。对于由干扰引起的虚假CBC结果的广泛评论，读者可以参考Zandecki及其同事发表的文章。在所有其他实验室检测结束后，应对无法识别的剩余的血液进行测量。特别是原本会被丢弃的材料。

（二）由制造商执行的仪器确认

世界卫生组织将确认定义为“用于证明所使用的程序、过程、系统、设备或方法按预期工作并达到预期结果的行为或过程”。根据CLSI标准，HA制造商负责为仪器的分析应用及其性能设定目标。应使用明确规定的试验方案来研究这些目标，以及它们的性能根据可接受的参考方法或如果没有参考方法时可使用市面上的分析仪来进行确认。评估的一般参数和标本概述包括：

·空白限或背景 

·携带污染

·不精密度

·分析测量区间（analytical measuring interval，AMI）（线性）

·检出下限

·可比性

·干扰

CLSI指南给出了测量次数和应该能实现目标的详细描述。国家伦理和标准评估机构决定确认研究是否需要患者同意，如果适用的话，应规定不良事件登记的广泛风险分析。

（三）由独立机构执行的仪器评估

实验室在使用分析仪前需要进行一系列的评估过程。新仪器也可以由独立的国家机构根据ICSH指南进行评估，在此之后，最终用户必须执行较不广泛的评估。在缺乏这些官方机构的国家，最终用户实验室可以在同行评审杂志上发表的评价中寻求意见，并根据自己的目标确定自己的确认程度或验证策略。评估应包括仪器安装、用户应用、血液样品和仪器评估。

（四）由最终用户实验室执行的仪器确认或验证

ICSH和CLSI指南以及ISO（国际标准化组织）15189认可准则规定，仪器安装、设置和使用规定方法进行初始校准的责任由制造商承担。一旦达到此目的，最终用户应评估制造商对特定仪器性能的声明是否也适用于实验室的预期用途标准。这个过程通常被称为验证，但有时也被称为确认，这可能会造成混淆。验证包括对HA的性能分析如下：

·正确度

·精密度

·试验结果的可报告范围和参考区间

·背景（空白限）

·携带污染（样品）

·检出下限

·定量限

·临床可报告区间（clinically reportable intervals，CRI）

·分析测量区间（AMI）

一般来说，这些项目都应该通过与用于确认相同的程序进行验证。实验室中可获得的匿名的剩余样品可用来确定在医学决定水平是重要的短期和长期的不精密度（复现性）验证。应该选择样品以确保在分析中包括广泛变化的病理样品，以及可以处理（例如稀释）样品以获得广泛范围的结果。表2提供了CLSI和ICSH关于HA验证的简要概述。实验室类型（医师办公室实验室或学术型医院实验室），其临床隶属关系以及与患者有关的人群是可比性（相关性）验证的主要关注点。在采用新的HA时，重要的是将其与现有的HA进行比较以确保患者结果不受影响。CLSI标准列出了与制造商的规范进行模式-模式验证比较的最低验证要点。就干扰而言，类似的规则适用于前面提到的：用户应验证仪器在实践中遇到的干扰。对于ISO15189认可，实验室应根据事先的风险分析确定此类事件的重要性。ISO15189提出“如果可能的话就进行验证，如果必要时进行确认”的政策。该政策允许最终用户根据验证的程度或需要进行适当确认来确定自己的目标。本文所讨论的两个指南是可比较的，不完全相同的，但差异通常是有限的。在术语和命名上有所不同。CLSI指南一般严格遵守官方术语（例如用“被测量”代替“参数”，而后者是ICSH指南和日常实践中常使用的），但现有的定义的偏差也很小。CLSI指南主要供HA制造商和实验室（最终用户）使用，而ICSH指南仅供实验室使用。

ICSH指南可通过国际实验室血液学杂志网站（国际实验室血液学学会[ISLH]的官方杂志，www.ISLH.org）和ICSH网站（www.ICSH.org）免费获取。CLSI指南需要订阅。两个指南二选一最终取决于当地的情况和偏好。另外，由于专业原因，实验室总是很有可能偏离指南。

表2. CLSI和ICSH关于性能评估方案的比较

缩略语：LoB，空白限；LoD，检出限；s，标准差。

数据引自参考文献Rabinovitch A，Barnes P，Curcio KM，et al. H26-A2：validation，verification, and quality assurance of automated hematology analyzers；approved standard-second edition. CLSI document H26-A2. Wayne (PA)：Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010和International Council for Standardization in Haematology，Writing Group，Briggs C，Culp N，Davis B，et al. ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting. Int J Lab Hematol 2014，36:613-27.

三、标准化

目前的全球化要求全世界的临床实验室产生标准化的结果。在世界范围内，临床实验室在不同条件下运作，使用不同的标本采集程序，并使用来自不同制造商的分析仪进行检测。当只有使用同样高水平的正确度、精密度和复现性的条件下标准化才能实现。它取决于参考物质和参考方法/程序（金标准）以及涉及确认、验证、质量保证和质量控制。实验室程序和分析仪的标准化指南是基于参考物质和参考方法，且通常是由现场专家在仔细评估后创建的。

（一）自动血液分析仪的现行参考方法

对于HA，只有少数项目有可用的参考方法（即血红蛋白、红细胞压缩体积、网织红细胞计数、红细胞计数、白细胞计数、白细胞分类计数、血小板计数）。大多数参考方法是非常繁琐且在日常实践中使用是不切实际，它们只能在验证过程中使用。

·对于血红蛋白，参考方法是氰化高铁血红蛋白方法。由于各种原因（如氰化物的毒性），不再使用含有氰化物的试剂，并已被替代方法取代；因此，制造商必须仔细确认他们的无氰化物方法。血红蛋白是CBC中唯一具有参考标准的参数，国际Hb标准可用于实验室，其被用于验证方案的标准。

·对于红细胞压积（packed cell volume，PCV），可以使用微量血细胞比容法，将样品在玻璃毛细管中离心，然后测量填充的RBC柱的高度与总血液柱高度的关系。PCV方法有一些缺点（有生物危害的风险[玻璃毛细血管破裂]），并且自采样后的时间会影响PCV，因为MCV随时间的延长而增加。此外，在异常红细胞形态（例如镰状细胞贫血时，压缩RBC的毛细血管不顺畅并且可能含有相对大量的血浆）存在的情况下，PCV结果可能是错误的。当使用微量血细胞比容作为PCV确认的参考方法时，应注意包括具有异常MCV和RBC计数的样品。

·对于网织红细胞计数，采用的是流式细胞术方法，其中基于不同的细胞特性将网织红细胞与成熟RBC分开，这比使用新亚甲基蓝进行活体染色计数网状细胞的显微镜方法更精密。

·对于RBC计数和WBC计数，1994年由ICSH标准委员会的细胞计量专家小组发表了一种参考方法，并一直沿用至今。该方法基于使用电阻抗原理的自动细胞计数，取代了早期使用计数池与显微镜结合的技术。

·对于WBC分类计数，使用显微镜手动方法，分类400个细胞，由多个合格的经验丰富的显微镜专家使用罗氏染色方法从两个平均具有200个分类细胞中产生。

·对于血小板计数，基于通过特异性单克隆抗体识别血小板，已发表了流式细胞术参考方法。目前血小板计数的参考方法，特别对于血小板减少症，使用选择性血小板单克隆抗体（例如抗-CD61，抗-CD41a）。

前面介绍的一些参考方法或多或少是过时的；尤其对于红细胞和白细胞计数以及白细胞分类计数。对于红细胞和白细胞计数，目前的参考技术是基于电阻抗原理，并且可获得对这种方法更好的替代方法。新的参考方法基于光学计数（流式细胞术）与RBC和WBC的特异性荧光分类簇（CD）标记相结合。这种方法具有较少的干扰，且提高了特异性。对于WBC分类，流式细胞术现在是一种候选参考方法，因为其正确度和统计精密度高于人工方法，但仍有许多要考虑的问题。有关这一建议方法的问题之一是WBC分类从基于显微镜的命名法命名到基于CD标记的命名法的范式转变。因此，迄今尚未发表明确的参考方法。

除了这里讨论的参数之外，裂细胞计数（碎片化红细胞）最近被引入作为HA参数；然而，这个参数只在有限的HA上可用 。裂细胞在血栓性血小板减少性紫癜和其他病理状态的鉴别诊断中是一个非常有价值的参数。ICSH最近发表了关于裂细胞计数的指南，支持进一步发展自动化裂细胞测量。

（二）无参考方法的全血细胞计数参数的适用性方法

除前面提到的方法外，就没有发布其他的参考方法。许多CBC参数是临床上相关的，在科学研究中也有广泛的应用，但是没有参考方法，这会导致临床解释上的差异，以及这可能会阻碍临床和科学数据的更广泛使用和有效比较或整合。许多临床医生和研究人员甚至没有意识到报告结果的差异（例如，不同医院之间）可能是由于使用不同的HA所导致的。因此，需要更多国际公认的参考方法，特别是以下临床相关参数：

·MCV自从Wintrobe引入以来，其已被广泛应用于临床，例如在贫血的诊断算法中，以及作为各种药物的依从性的标志物。由于各种分析干扰，可能会产生MCV的差异。迄今为止，还没有发表国际公认的参考方法。然而，各种制造商提供校准物，通常基于确切的体积已知的乳胶颗粒或固定的RBC，这具有它们自身的缺点，因为它们在HA中的表现与活的RBC相比是不同的。MCV也作为其他（计算的）参数的来源，如红细胞分布宽度（RDW）。 RDW的增加与各种病理状态有关。因此，参考方法将是一个进步。

·各种不同的HA报告衍生的RBC参数，如小红细胞和增色红细胞。这些扩展的红细胞参数可能有助于一些特定RBC相关疾病的诊断检查。例如，小红细胞可以用于鉴别诊断小红细胞性贫血，以区分缺铁性贫血和地中海贫血，增色红细胞可以用于遗传性球形红细胞增多症的诊断。然而，扩展的红细胞参数的具体命名、截断值和测量方法可能会有所不同，这取决于所使用的HA的类型，这在解释报告的数据时可能导致混淆和分类错误。

·网织红细胞Hb含量是由某些HA产生的参数，该参数对功能性铁缺乏症等病理状态的诊断具有增值，甚至在透析患者缺铁性疾病的诊断和治疗指南中占有一席之地。然而，与其他一些报道的CBC参数一样，网织红细胞Hb含量缺乏标准化，并且在命名上有差异，限制了其在临床上的应用。

·MPV在各种涉及血小板计数和血小板功能的病理状态下均有临床价值；然而，由于缺乏标准化，MPV（以及诸如血小板分布宽度和血小板压积的衍生参数）的临床应用受到限制。目前，ICSH正在制定MPV标准化的指南。

·网状血小板是未成熟的血小板，仍然含有一些RNA，且其水平随着骨髓血小板产生的增加而增加。因此血小板减少症患者可以使用这一参数来区分外周血小板破坏和骨髓衰竭综合征，或作为血小板输入治疗的指南。与其他讨论的参数一样，不同类型的HA命名可能有所不同，由于截断水平和测量方法的不同，也可能会出现差异。

（三）报告单位的标准化

CBC参数的结果表达（报告单位）目前尚未在国际上进行标准化。ICSH正在制定一个解决血液学报告单位标准化的指南，但至今尚未公布。标准化具有许多明显的优势，将大大增加CBC结果的互换性和标准化，例如在患者结果的国际交流和数据研究中。但是，报告单位的标准化是一个涉及国家和国际科学组织及监管机构、政府机构、临床实践方案、研究和试验、医疗决策和实验室信息系统变化的复杂事项。因此，就报告单位而言，即使在国家范围内达成一致也是一项艰巨的任务，需要各方妥协。一般认为，报告血红蛋白浓度、红细胞计数、白细胞计数和白细胞分类计数的体积单位，优选升（L），因为这是最普遍的体积单位，尽管它不是官方SI（国际单位制）单位。目前使用的其他体积单位，如微升（μL）或分升（dL），则不太具有可接受性。目前报道的血红蛋白浓度是毫摩尔每升、克每升或克每分升；克（g）和毫摩尔（mmol）都是官方SI单位。然而，由于人体循环中的血红蛋白由不同的分子（HbA、HbA2、HbF、病理Hb）组成，其相对浓度在不同年龄组和不同病理状态下可能有所不同，因此，尽管差异可能可以忽略不计，但也无法将精确分子量分配给Hb。因此，可以认为克比摩尔更准确。就这个复杂的问题达成共识并付诸实施需要很长一段时间。

四、结论

最终用户实验室对HA的确认或验证过程涉及检验前和检验阶段的问题，应进行标准化和控制。关于这个问题有两个出版的指南，其中包含描述这个过程的基本部分的程序。两个指南包含重叠的事项，并对由于专业原因导致的协议偏差进行了描述。无论如何，这两个指南之一的最终选择由实验室专业人员决定。本文讨论了HA标准化的关键点，即它们在诊断环境中的重要性，并描述了目前仅用于少数选定的CBC参数的参考方法。在特定疾病的诊断中显示潜力的CBC参数在不久的将来可能不会被标准化。尽管如此，目前的CBC参数和报告单位的参考方法和标准化是可取的，并且将会促进这些临床相关参数的使用。

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