检测非小细胞肺癌患者血浆中循环肿瘤DNA EGFR突变的四种领先技术的跨平台比较

摘要：循环肿瘤DNA（ctDNA）是一种可以指导非小细胞肺癌（NSCLC）患者靶向疗法并监测肿瘤变化的强有力的工具，在代表性组织活检方法不可用时，该方法尤其有效。本文比较了4种能检测NSCLC患者ctDNA中表皮生长因子受体（EGFR）突变（L858R、外显子19缺失、T790M和G719X）的技术平台。比较了两种难治性突变扩增系统（cobas-ARMS和ADx-ARMS）、一种微液滴数字聚合酶链反应（ddPCR）和下一代测序平台（Firefly NGS）。鉴别了20名NSCLC患者之间的515种EGFR突变。Firefly NGS、cobas-ARMS和ddPCR的灵敏度较高，ADx-ARMS则更适于血浆和组织样品内在等位基因频率高于1%时进行EGFR突变的定性检测。我们观测到血浆和组织中三种驱动突变（L858R、外显子19缺失和G719X）的EGFR突变图谱高度一致，这三种突变是复发患者使用的第一代EGFR-TKI的目标。血浆和组织EGFR突变图谱的差异主要归因于肿瘤的时空异质性和治疗反应以及耐药（T790M）导致的突变抑制。此次研究表明在进行治疗评估和药物耐药性检测时，选择适当的EGFR ctDNA分析技术平台面临挑战。

简  介

表皮生长因子受体（EGFR）的体细胞突变在作为非小细胞肺癌生物标志物和理想目标两者中都起着重要的作用。新疗法EGFR-TKI正在成为EGFR发生突变的NSCLC的治疗手段，越来越多的患者接受了多线EGFR靶向治疗。同时，在选择压力下肿瘤亚克隆的进化轨迹如EGFR抑制剂具有固有的或获得性耐药性可以选择并驱动疾病进展。因此，研究者、医师和患者对准确的EGFR突变谱的需求越来越大，这些图谱并将有助于为治疗决策提供信息。

目前的建议是使用新鲜的、冷冻的或福尔马林固定石蜡包埋的组织（FFPE）检测EGFR突变。然而，近三分之二的NSCLC患者在诊断时已经处于晚期阶段，而且通过手术进行活检通常是不可行的。因此，很难获得足够的EGFR突变肿瘤组织以供分析。此外，由于空间和时间上的多样性，最初诊断时使用肿瘤组织样品进行的突变分析在整个治疗过程中并不适用于治疗指导，尤其是在疾病进展之后。出于这些原因，从其他替代来源如血浆、胸膜液、痰液、尿液和脑脊液等衍生EGFR突变图谱的新方法统称为“液体活检”，这类方法正在研发中。

在已被检测的替代来源中，血浆是最有前景的来源。在存在局部癌症患者和晚期癌症患者中，循环肿瘤DNA（ctDNA）的丰度从0.1%到67%不等，在肿瘤出于原发位置的癌症患者中甚至更低（0.01%）。因此，如果需要检测ctDNA中EGFR突变的，则使用一种高灵敏度的方法是至关重要的。多项研究表明，多种技术都可以在ctDNA中检出EGFR突变。与从组织样本检测EGFR突变相比，ctDNA检测评估EGFR突变的灵敏度为46%-82%，特异性为90%-99%，总符合率为78%-88%。

常用的血浆EGFR分析的技术包括难治突变扩增系统（ARMS），微液滴数字PCR（ddPCR） 和下一代测序（NGS）方法。这些方法在EGFR突变检测的灵敏度、特异性和覆盖率方面存在显著差异。ADx- ARMS（ADx® EGFR 29突变检测试剂盒）在99%的正常DNA背景下可以检出1%的突变DNA，该方法已获中国食品药品监督管理局（CFDA）批准，在中国进行临床应用。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了cobas-ARMS（cobas EGFR突变测试v2），用于检测血浆外显子19的缺失和L858碱基置换突变。相比之下，ddPCR和NGS的方法尚未得到FDA或CFDA的批准。但是，这两种方法具有使用数量优势，在研究环境中得到了广泛应用。ddPCR具有无与伦比的灵敏度（0.04%-0.1%），但它只能检出每个反应的一个位点，限制了其在多重试验中的使用。基于NGS的方法，如Firefly NGS，其性能灵敏度能与ddPCR相比，在多重试验中没有局限性。

在检测ctDNA中EGFR突变方面，不同的技术的性能比较对于优化临床环境中NSCLC液体活检的使用至关重要。本文中，我们论述了四种技术（ADx-ARMS，cobasar-ARMS，ddPCR和Firefly NGS）检测来自NSCLC患者的肿瘤组织和血浆中的临床相关EGFR突变，并对其性能进行了比较。

材料和方法

组织和血样

2009年7月至2015年11月，从北京大学肿瘤医院研究所中接受治疗的20名NSCLC患者（年龄37-76岁）处获得了组织和血液样本。患者入选标准为：新诊断为晚期或复发性或多个原发性非小细胞肺癌；已有可用手术切除肿瘤组织样本和至少205 ng cfDNA；完成病历记录包括随访记录以及通过ADx-ARMS试验测定表皮生长因子受体状态。为了将临床医生在日常实践中可能遇到的各种情形包括在内并使所有血浆EGFR突变水平的表达最大化，我们在治疗过程中招募了不同临床反应的患者。为了增加T790M等耐药突变的表达，我们招募了接受TKI治疗的患者。这项研究根据《赫尔辛基原则宣言》进行，并经北京大学肿瘤医院研究所机构审查委员会批准。所有受试者均已签署书面知情同意书。

组织样品包括切除原发性或转移性肺、转移性淋巴结或胸膜病变。肿瘤细胞在所有有核细胞中的百分比是高级病理学家经过苏木精和伊红染色后在4μm切片中评估后确定的。通过标准NGS，对至少具有10%的肿瘤细胞样品进行组织DNA分析；组织样本中肿瘤细胞少于10%的患者只接受cfDNA分析。使用实体瘤反应评估标准（RECISRT）1.1版评估治疗效果。

总之，将20毫升静脉血采集到两个10毫升的Streck细胞游离DNA BCT试管（Streck Co.，Omaha，NE，USA）中。采血后的两个小时内，在4℃的环境中以1900g离心血液10分钟，将血浆从外周血细胞中分离出来。然后，在4℃环境中以16000g进一步离心血浆10分钟，将所有剩余的细胞形成小球。然后，将血浆和外周血细胞的上相采集到几个新的5mL无菌Eppendorf管中。源于第一次离心的外周血细胞用于分离外周血白细胞的种系细胞基因组DNA。在所有的试管上贴上相应患者的姓名和样本采集的日期，并立即储存在-80℃的环境中直到DNA分离。

肿瘤组织、白细胞基因组DNA和cfDNA的提取

使用QIAamp DNA FFPETissue试剂盒（Qiagen，Venlo，The Netherlands）提取肿瘤组织基因组DNA。使用QIAamp DNA Blood Maxi试剂盒（Qiagen，Venlo，The Netherlands）从100μl血沉棕黄层中提取白细胞基因组DNA。使用QIAamp 循环核酸试剂盒（Qiagen，Venlo，The Netherlands）从8.0mL—10.8mL血浆中提取cfDNA。根据制造商说明书提取所有DNA并使用Qubit荧光计（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）定量。提取的DNA储存在-80℃的环境中待用。

白细胞和肿瘤组织中提取的基因组DNA的标准NGS分析

对基因组DNA进行超声分解处理制成峰值长度为200bp的片段。利用KAPA测序文库构建试剂盒（Kapa Biosystems，Boston，MA，USA），使用100ng片段化基因组DNA进行NGS文库构建。使用Accu-ACT panel（中国上海AccuraGen Inc）捕获基因组DNA NGS文库。不使用100bp双末端测序技术在Illumina HiSeq 2500系统（Illumina，San Diego，CA，USA）进行测序。所有探针的平均覆盖深度至少为500X。

肿瘤组织基因组DNA的ADx-ARMS检测

使用ADx-ARMS试验确定患者肿瘤组织的EGFR突变状态。组织基因组DNA的ADx-ARMS协议与cfDNA相同。

ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS对血浆cfDNA的分析根据制造商说明书，使用2种AmoyDx® EGFR 29突变检测试剂盒（ADx-ARMS）和cobas® EGFR突变试验V2（cobas-ARMS）进行血浆EGFR检测。利用QX200微液滴数字PCR系统（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）执行ddPCR试验（L858R、外显子19缺失、T790M和G719X）。使用QuantaSoft1.6软件（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）分析等位基因频率。基于AccuraGen的cfDNA技术执行Firefly NGS（Accu-Act）试验。这四种方法的细节、EGFR突变体的测定以及野生型位点以及符合率见材料和方法的附表。

a. 采用第7版AJCC/UICC TNM NSCLC分期系统。分别记录组织和血浆采样时间点；

b. 一个案例发现L858R和外显子19缺失两种突变；

c. 一个案例发现外显子19缺失和T790M两种突变。

统计分析

利用费舍尔精确检验比较四种平台的检出率和6个患者对之间的阳性和阴性符合率。利用配对t检验比较四种平台检测四种EGFR突变的灵敏度和特异性。利用斯皮尔曼的秩相关系数测定ddPCR和Firefly NGS确定的血浆EGFR突变的等位基因频率之间的相关性强度。p＜0.05时差异具有统计学意义。使用SPSS Windows版（版本19.0;SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）执行所有计算和使用GraphPad Prism（5.0版本；GraphPad，San Diego，CA）创建图形。

结  果

患者特征

总计20名NSCLC患者完成登记，其中13例（65%）出现局部（n=8）或远端（n=5）术后复发，和7例（35%）出现远端转移（n=6）或多个原发性肺癌（n=1）。组织和血浆抽样的时空特征见表1和附表S1。在全身治疗期间，15名患者（75%）进行了采血，其余5名患者在治疗前进行了采血。

ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS平台的检测率

四种平台在20名患者中发现了15种EGFR突变。这四种平台的检测率分别为ADx-ARMS 46.7%（7/15）、cobas-ARMS 73.3%（11/15）、ddPCR 66.7%（10/15）和Firefly NGS 80%（12/15）（χ2=3.972；p=0.318）（图1A）。

根据等位基因频率（＜1% vs1%）， 13个EGFR突变被分为2个亚组（7vs6），另外两个EGFR突变的等位基因频率未知，且仅由ADx-ARMS（表2 S2）或cobas-ARMS（表2中S9）检出，所以被排除。等位基因频率较低的亚组中，ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPC和Firefly NGS的检出率分别为14.3%（1/7）、71.4%（5/7）、71.4%（5/7）和85.7%（6/7）（χ2=8.138，p=0.047）。虽然ADx-ARMS的检出率明显低于其他三个平台，但是cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS之间没有显著的性能差异。在等位基因频率较高的亚组中，ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS的检出率分别为83.3%（5/6）、83.3%（5/6）、83.3%（5/6）和100%（6/6）。所有4个平台检测4个EGFR突变类型的性能之间在统计学上没有显著差异（图1C）。

四个平台的阳性和阴性符合率

在等位基因频率较低的亚组中，每一个成对的平台比较的阳性符合率为16.7%到100%不等。ADx-ARMS vs cobas-ARMS、ADx ARMS vs ddPCR和ADx-ARMS vs Firefly NGS这三对的最低阳性符合率分别为20%（1/5）、20%（1/5）和16.7%（1/6）（x2=0.484，p=1.000）。由于缺乏等位基因频率数据，样品S9被排除。cobas -ARMS和ddPCR的阳性符合率（100%，5/5）最高（图2A）。在等位基因频率较高的亚组中，每一个成对的平台比较的阳性符合率为66.7%到100%不等。6对患者无统计学差异。一致性最大的平台对同样是cobas-ARMS和ddPCR，结果相同（100%，5/5）（图2A）。

此次研究中总计有75个EGFR野生位点被发现。ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS分别发现了73、69、70和68个野生型位点。每个成对比较的阴性符合率都高于90%。6个患者对比较之间没有发现显著的统计学差异（图2B）。

图1. 等位基因频率较低（<1%）和等位基因较高（≥1%）亚组的总检测率。如果任一平台得到阳性结果，则样品分为阳性。

图1B和1C排除2个等位基因频率未知的案例（S2 ADx-ARMS和S9cobas-ARMS结果）。值表示为n。*表示显著统计学差异（p＜0.05）

图2. 6个患者对比较间的阳性（A）和阴性（B）符合率。值表示为n。*表示显著统计学差异（p＜0.05）

肿瘤组织分析中ADx-ARMS和标准NGS的一致性

使用ADx-ARMS和标准NGS两种方法对肿瘤组织进行了EGFR突变分析。在最初的肿瘤活检时进行了ADx-ARMS分析，并在此基础上对患者进行了治疗。后来对所有患者（S1- S20）玻片进行了标准NGS检测；其中2个组织基因组DNA不足（S8）或无肿瘤含量（S12），其中3个（S5、S6和S15）具有空间性不同组织采样（S6和S15）或临时不同的组织采样（S5），这三个玻片进行了ADx-ARMS和标准NGS检测。因此，我们分析了15名患者历史上的ADx-ARMS与目前NGS的EGFR突变结果一致性。我们发现这两种方法之间具有93.3%（14/15）的一致性（表2）；但是一种情况下（S3），ADx-ARMS鉴别出了L858R和外显子19缺失两种突变，但标准NGS只鉴别外显子19缺失这一种突变。

血浆和肿瘤组织EGFR突变图谱的比较

我们比较了所有20名患者的血浆和肿瘤组织样本的EGFR突变谱。组织和血样采集的时间范围为0到13年，7名（35%）患者采样间隔0-1年，5名患者（25%）采样间隔1-3年，6名患者（30%）采样间隔3-6年，2名患者（10%）采样间隔≥6年（表2）。

这四种平台在相应组织中共检测到3例L858R突变、6例外显子19缺失，5例T790M突变和1例G719X突变。同时在得到确切诊断的匹配的组织中共检出3例L858R突变、5例外显子19缺失和1例G719X突变。为了确定组织和血浆EGFR突变谱之间的一致性，我们评估了在血浆中出现但在组织中不出现的EGFR突变频率。对于cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS而言，血浆中观测到的L858R、外显子19缺失和G719X突变在肿瘤组织样品中也会出现，这表明血浆和肿瘤组织突变谱之间存在高度一致性。但是对外显子19缺失而言存在一个不同之处，那就是只有cobas-ARMS能在血浆中检出外显子19缺失，而组织检验结果为L858R。此外，仅有1个案例的血浆突变图谱在三种技术平台间发生了变化。

在T790M突变中，我们观察到了不同的模式，这是一种已经在治疗反应中出现的具有良好特征的耐药突变。T790M有5个不同之处，其中之一是由ADx-ARMS（S2）检测到的，2个是由Firefly NGS（S6，S16）检测到的，2个是由所有4个平台检测到的（S7，S8）。注意，S7和S8都使用第一代EGFR-TKI治疗。采样5个月后，S7出现了脑部转移，S8死于肺癌。

最后，10名患者的血浆中存在EGFR野生型，携带L858R（S10-S12）；外显子19缺失（S13-S15）或匹配样品中存在野生型（S17-S20）（表2）。

肿瘤组织和血浆中EGFR变异的总符合率

在血液采样中，登记了17名癌症IV期患者来确定组织和血浆间的EGFR突变图谱的总符合率。对于S5和S6患者，他们的ADx-ARMS和标准NGS组织检测结果不一致，原因是样本采集的时间和肿瘤类型不同。患者S5和S6的ADx-ARMS和标准NGS数据均作为参考，但是使用ADx-ARMS和标准NGS检出的具有2种不同突变的1个案例被考虑作为2个各具有一种EGFR突变类型的案例。对于其他15例患者而言，使用ADx-ARMS获得的组织检测结果可以作为参考。但是，2个具有两种突变的患者（S3，S4）案例也被认为是4个各具有1种突变的案例。因此总共分析了21个案例。使用组织EGFR突变图谱作为三个驱动突变（L858R、外显子19缺失和G719X）的参考，ctDNA试验的灵敏度、特异性和总符合率分别为26.7%-53.3%、100%和45%-65%（附表S2）。注意，外显子19缺失的检测灵敏度（50%-83.3%）高于L858R （12.5%-37.5%，p=0.008）和T790M（0%，p=0.003）。此外，与L858R（100%，p=0.010）和外显子19缺失（93.3%-100%，p=0.043）相比，检测T790M的特异性较低（80.0%-90.0%）（表3）。

讨  论

本研究执行了四个主要检测平台的性能比较，以检测具有不同等位基因频率的EGFR突变。我们证明cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS平台的灵敏度和特异性较高。相比之下，ADx-ARMS更适合于等位基因频率超过1%的血浆和组织样品的EGFR突变定性检测。据我们所知，目前的研究是第一次对这一领域中的两种ARMS、1种ddPCR和1种基于NGS的平台进行的比较。

我们首先在等位基因频率较高的（≥1%）和等位基因频率（<1%）较低的亚组中比较了每个技术平台的灵敏度。对于等位基因频率更高的变异体而言，这四个技术平台显示出相似的血浆检出率，介于83.3%—100%之间。然而，在分析等位基因频率较低的亚组时，检出率的差异较大。cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS平台的检出率介于71.4%—85.7%之间。但ADx-ARMS的检出率仅为14.3%。这些结果表明，与ADx-ARMS相比，cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS方法具有更高的检测限。

在我们的研究中，在与之前的研究相一致的情况下，在我们的研究中观测到了cobas-ARMS和ddPCR之间存在比较高的符合率（91%，10/11）。此外，本研究的两种ctDNA定量方法——Firefly NGS和ddPCR均具有极好的阳性符合率，即使是分析低模板拷贝亦能实现较高的阳性符合率。两种方法计算的ctDNA频率高度相关（斯皮尔曼相关性，R2=0.98，p＜0.0001，附图S1），这与之前的报告一致。因此，与ddPCR相比，Firefly NGS平台具有等效灵敏度，之前研究者普遍认为ddPCR是最灵敏的EGFR突变图谱分析平台。

我们比较了血浆和肿瘤组织样品的EGFR突变图谱，并观察了不同的平台所具有的特点，这些特点必须在试验的灵敏度和EGFR突变的固有生物学特性的背景下进行解释。首先，在三种高灵敏度的试验（cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS）中，我们观察到三种在原发肿瘤中被鉴别出来且通常为第一代EGFR-TKI目标的3种驱动突变（L858R、外显子19缺失和G719X）的血浆和组织突变谱具有较高的一致性。血浆中观测到的所有L858R、外显子19缺失和G719X突变均在组织样品中得到了证实。对于外显子19缺失而言，仅有的一个不一致之处是它只能在血浆中被cobas-ARMS鉴别，但是在肿瘤组织中L858R可以同时被ADx-ARMS和标准NGS（S9）鉴别。这样的结果只能用采样误差来解释，但它很可能是假阳性，因为它没有被具有更高的灵敏度的试验检出。

第二个不同的模式出现在对T790M的分析中。我们观测到了5个T790M的不同之处，其中所有4个平台检出了2个（S7、S8）；Firefly NGS检出了2个（S6、S16）；ADx-ARMS检出了1个（S2）。T790M突变出现在对第一代EGFR-TKI疗法的反应中。患者S7和S8中，所有4个平台都发现了T790M突变，这可能反映的是第一代EGFR-TKI的获得性耐药。

2名患者（S6、S16）在使用Firefly NGS鉴别时为T790M阳性，但采用其他三种方法鉴别时为阴性。在案例S16中，基于后续ddPCR鉴别的阴性结果，该T790M阳性可能是假阳性。这种假阳性可以通过样品的固有生物学特性（T790M的过渡突变已被证明是由胞嘧啶和5-mC的自发脱氨基作用引起）或由分析或算法特征引起的技术误差来解释。在案例S6中，cfDNA数量不足限制了通过额外的ddPCR检测对T790M的验证。在正常供体的外周血标本中，如果T790M的背景信号较高（0.5%），通过阈值优化可以强化T790M的检测。患者S6接受了第一代EGFR-TKI的治疗出现了罕见事件即一种新出现的耐药突变。有限的ctDNA选取导致的采样偏差也可能导致其他平台报告为阴性结果。这些结果表明在采取临床措施之前应该进行随访并在晚一点的时间点进行额外采血，根据试验水平执行确认试验。

此外，患者S6患有多种原发性肺癌，并在两种不同的空间分离组织中呈现L858R（标准NGS）或外显子19缺失（ADx-ARMS）突变，这表明肿瘤具有多样性。在患者S6的cfDNA分析中，ddPCR和cobas-ARMS的最初试验仅仅报告了外显子19缺失，而Firefly NGS和ADx-ARMS则报告了L858R突变。因此，血浆中可能含有L858R和外显子19缺失两种突变。据报道，另一个ddPCR确认试验也报告了血浆中L858R呈阳性，但由于cfDNA数量不足，血浆外显子19缺失未得到确认。初步实验中ddPCR和Firefly NGS在L858R和外显子19缺失的结果之间的差异可能是由ctDNA的丰度低引发随机泊松采样误差导致的结果。

T790M的最后一点不同是：ADx-ARMS发现了1个其他3种平台在肿瘤组织和血浆内鉴别为L858R阳性的T790M阳性案例。考虑到该平台的相对灵敏度，这个T790M阳性案例很可能是假阳性。

最后，6名携带EGFR野生型的患者的血浆内存在L858R（S10-S12）突变或组织中存在外显子19缺失（S13-S15）。这6名患者中，4名患者对治疗有反应，说明其血浆样品中不存在突变。其余2名患者（S14和S15）为IA阶段初步治疗且组织和血浆的EGFR突变图谱相矛盾，造成这种情况的原因可能是患者处于疾病早期血流中ctDNA的数量有限（附表S1）。

与组织样品的EGFR突变图谱相比，ctDNA试验的总符合率为45%-65%，显著低于先前研究的符合率（57%-97%）。一种可能的原因是时间，肿瘤多样性如采样外周血和肿瘤组织采样时间间隔不同。另一种可能是先前接受化疗或EGFR-TKI的患者的EGFR突变频率发生了变化。此研究中70%的患者（14/20）接受过至少1种或2种上述疗法的治疗。

除了肿瘤的时间多样性之外，肿瘤样品的空间多样性也是评估ctDNA试验临床相关性的关键因素。与肿瘤采样多样性相关的局限性已经得到了充分研究，并证明其是组织活检突变检测的主要短板。研究显示，原发和转移位点遗传组合发生变化，这与我们的发现是一致的。我们在患者S5的原发肺癌组织中发现了外显子19缺失，在转移后的胸膜和血样中发现了G719X突变。在使用第一代EGFR-TKI治疗三年后，疾病发生了恶化。重要的是，在疾病恶化时，3种灵敏度较高的技术平台仅在血浆中检出了G719X突变。这个结果表明与初始组织活检相比，ctDNA试验可以生成更加准确的突变图谱，对临床决策的制定大有益处。

此外，我们评估了ctDNA的突变图谱是否能预测即将出现的复发。我们观察了2例患者（S7, S8）的肿瘤组织和血浆样品。对组织样本的分析仅检测到外显子19缺失，而在大约两年后采集的血浆样品中检出了外显子19缺失/T790M两种突变。尽管被诊断为可能处于稳定疾病期或对疗法产生部分反应，但两名患者的病情在采样后的5个月内都出现了严重恶化。这些结果为液体活检在复发预测和临床决策中的作用提供了进一步的支持。

评估一项技术相对于另一项技术的比较优势的另一个重要参考因素是它的监管状态。在我们比较的四个平台中，只有ADx-ARMS和cobas-ARMS被批准用于EGFR突变检测。在操作上这两种方法都具有快速周转时间和简单的工作流程，对技术的要求很有限。ADx-ARMS的价格较低但灵敏度也低。另一个参考因素是试验的广度，cobas-ARMS和ddPCR也有快速的周转时间和较高的灵敏度，但二者都不能与综合的突变试验相适应，尤其是cfDNA样本的数量有限的情况下。目前，cobas-ARMS只能检测EGFR变异，而ddPCR可以一次检测一种变异但不能检测EGFR突变如外显子20插入。

相比之下NGS技术不仅灵敏度高而且覆盖的范围广，基本涵盖所有EGFR变异和其他具有临床意义的基因如ALK、ROS、RET、KRAS和BRAF。不仅如此，NGS方法支持多重检测，能轻易地进行扩展，适应日益增加的人类基因组制药突变的数量。但是NGS的方法较ARMS和ddPCR昂贵且周转时间较长。需要额外的研究进一步探索超敏变异数据的临床相关性并论证该技术的效费比。

我们的研究存在如下限制。第一没有对肿瘤组织和血浆进行平行分析，大部分患者参与研究时已经接受了治疗。第二，我们的样品规模小，需要更大规模的随访研究来确认结果。第三，由于cfDNA不足，仅重复了一小部分试验。

总之，我们的研究对四种主要技术ADx-ARMS、cobas-ARMS、ddPCR和Firefly NGS检测NSCLC患者ctDNA的EGFR突变方面的性能进行了比较性评估。尽管样品量有限，但研究涉及的病例是更大的患者群体的代表，因此可以为ctDNA分析在癌症治疗中的作用提供有价值的见解。这个小数据集证明液体活检在治疗评估和耐药性检测方面具有诸多优点。研究报告的病例将有助于加深研究者对ctDNA检测在癌症患者治疗中的作用的理解。需要进一步研究确定癌症相关变异如ctDNA EGFR突变图谱检测的指南，该指南可以纳入现有临床治疗的范例。

缩略语

NSCLC非小细胞肺癌；ADC，腺癌；SCC，鳞状细胞癌；ASC，鳞腺癌；EGFR，表皮生长因子受体；TKI，酪氨酸激酶抑制剂；cfDNA，无细胞DNA；ctDNA，循环肿瘤DNA；PCR，聚合酶链反应；ARMS，难治突变扩增系统；ddPCR，微液滴数字聚合酶链反应；NGS，下一代测序；ADx，AmoyDx；CFDA，中国食品药品监督管理局；FDA美国食品和药物监督管理局；TT，靶向治疗；CT，化疗；PEM，培美曲塞；PTX，紫杉醇；DDP，顺铂；GEM，吉西他滨；NDP，奈达铂；TXT，多西他赛；CAP卡铂；RECIST，实体瘤的反应评估标准；PR部分反应；SD，疾病稳定；PD，疾病进展；COMIC，癌症体细胞突变的目录。

补充材料

补充材料、附表和附图见http://www.thno.org/v07p1437s1.pdf

摘自《治疗诊断学杂志》，版权归其所有，仅供内部参考。

编译：张凯

审校：韩泯、方研