非小细胞肺癌EGFR T790M 检测技术跨平台比较

摘要：基因编码的表皮生长因子受体（EGFR）的体细胞突变状态在确定非小细胞肺癌靶向治疗模式中起着非常重要的作用。在大约50%的案例中，存在EGFR T790M突变会对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性。由于肿瘤的异质性、突变的丰度低和晚期疾病患者的重新活检难度高，在肿瘤组织中检测EGFR T790M突变是一项巨大的挑战。所以，许多研究者提出循环肿瘤DNA（ctDNA）可以作为一种非侵入性的突变分析方法。ctDNA中EGFR突变的存在预示着在一线环境中对EGFR TKI的反应。分子检测目前被认为是NSCLC的治疗标准之一。标准的商业试剂盒和针对性的突变分析的出现彻底改进了突变检测平台检测EGFR突变的准确性。本文综述了多种检测肿瘤组织和血浆中EGFR T790M突变的常用平台。

简 介

肺癌是导致癌症死亡的主要原因，大约80%的肺癌病例都是非小细胞肺癌（NSCLC）。在NSCLC靶向治疗中，表皮生长因子受体（EGFR）是一种有前景的选择。亚洲NSCLC人群EGFR突变的频率约为30%，而白种人约为10%。EGFR TKI如吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼都已经用于NSCLC的EGFR靶向治疗。酪氨酸激酶抑制剂的作用方式是通过与EGFR激酶域的ATP结合位点相结合来抑制激酶活化和下游信号转导。该靶向疗法的反应率约为56%-74%，中值无进展存活期（PFS）可达10-14个月。

EGFR基因最常见的突变包括：外显子19的框内缺失突变和外显子21的杂合子突变。多个；临床试验已经证明EGFR突变与EGFR TKI灵敏度之间的相关性具有预后价值。虽然患者最初使用EGFR-TKI时反应良好，但部分的患者都会因出现T790M耐药突变产生获得性耐药。这需要通过使用第二代EGFR抑制剂（阿法替尼和达克替尼）来克服，但是，这些抑制剂的反应率低（＜10%）和PFS)也较短（＜4个月）。而且它们也与皮肤和胃肠道的毒性作用有关。对T790M的耐药突变非常有效的第三代EGFR TKI是AZD9291。结果显示，在对前两代EGFR TKI产生的T790M介导性耐药的患者中，该药物的反应率为61%，而且皮肤和胃肠道发生不良反应的概率也很低。AZD9291也以EGFR敏化突变（外显子19缺失和L858R）为目标。

对使用TKI治疗后的进展事件进行监测非常重要，因为其有助于制定治疗策略以克服耐药机制。为了研究这些耐药机制，建议重复进行组织活检。但是在临床实践中，由于活检所需的程序具有侵入性和肿瘤组织的多样性，使得活检面临极大挑战。目前一种非侵入性程序即循环肿瘤DNA（ctDNA）已经出现，并被认为是EGFR突变检测具有特异性和灵敏度的生物标志物。在肿瘤组织中检出的突变与血浆ctDNA检出到的突变高度一致。

目前一些临床平台可以用于检测EGFR突变，这些平台包括扩增阻滞突变检测系统（ARMS）、cobas TaqMan PCR、数字聚合酶链反应，包括微液滴数字PCR（ddPCR）和BEAMing（磁珠乳液扩增PCR）数字PCR、Mutant-enriched PCR、高分辨率溶解（HRM）分析、变性高效液相色谱（DHPLC）和下一代测序（NGS）。这些技术检测血浆和肿瘤组织的检测率、灵敏度以及特异性均不同。

实时监测EGFR突变是确定适当的治疗策略的根本；因此迫切需要侵入性程度较低的程序与高灵敏度、高特异性且经济有效的诊断平台相结合。因此，我们综述了现有EGFR T790M突变检测技术及其检测血浆、组织、体液样品中相关突变的灵敏度和特异性。

EGFR T790M突变检测的伴随诊断平台

目前基于PCR进行EGFR检测的诊断平台包括cobas、ARMS、BEAMing、ddPCR、HRM、DHPL、质谱基因分型、电场诱导释放和测量（EFIRM）和NGS。本文将综述血浆和肿瘤组织检测方面使用范围较广的平台的灵敏度和特异性。这些用于EGFR突变检测的诊断平台的特征见表1。

cobas（罗氏）

该平台是一种实时PCR技术，用于鉴定EGFR的42个位点突变包括T790M。该过程有两个步骤，第一步是从组织或血浆中提取DNA，第二步是使用特定引物对DNA进行扩增，并使用荧光染料探针进行检测。它设计用于在同一块检测板上同时运行组织和血浆样本，从而使临床医生能轻松地对计划中的治疗策略进行比较。

用cobas cfDNA样品制备试剂盒在将血浆从全血中分离出来后处理血浆样品，用cobas DNA样品制备试剂盒提取DNA处理组织样品。样品制备后，利用PCR技术在同一块检测板上运行这两种样品完成扩增和检测，从而可以进行血浆和组织的头对头比较。组织和血浆的cobas工作流程见图1。

ARMS

等位基因特异聚合酶链反应的设计使用序列特异PCR引物检测小的缺失或单碱基突变。Taq DNA聚合酶选择性地扩增特异突变序列用一种三端引物区分匹配和错配，因此仅扩增目标等位基因DNA。完全匹配时，扩增性能良好，出现误配时就会出现低背景扩增。PCR引物与探针共价结合；探针荧光团与冷却器（并入探针）相互作用减少荧光性。PCR期间，探针与分割荧光团和冷却器的扩增子结合增加PCR管的荧光性。

表1. EGFR突变检测诊断平台比较

图1. cobas（罗氏）和ARMS（Qiagen）工作流程。工作流程包括样品制

备，使用特殊DNA样品制备试剂盒从样品中分离DNA，在实时PCR中运行

样品DNA，结果用于临床解析和靶向疗法。

ARMS（Qiagen）：EGFR RGQ PCR试剂盒第二版是一种利用实时PCR技术检测突变的诊断试剂盒。该试剂盒在Rator-Gene Q 5 plex HRM设备上使用。该程序分为2步，第一步包括评估总样品DNA的控制实验，第二步包括评估突变DNA的控制和突变试验。ARMS的原理见图2。

ARMS（AmoyDx）：AmoyDx® EGFR突变检测试验（CE-IVD）是一种检测外显子18、19、20和21EGFR突变的诊断试剂盒。该技术使用结合了新的荧光探针设计的2步PCR扩增程序，可用于新鲜和冷冻的组织样品、血液血清或血浆。

数字PCR

数字PCR克隆扩增和定量核酸。它能利用非常少的样品从一个模板上扩增和生成扩增子。利用荧光或测序区分不同的等位基因。该技术优于传统PCR，能转换指数模拟信号并输出用于统计分析的线性数字信号。

图2. ARMS（Qiagen）的原理

Sysmex Inostics BEAMing数字PCR技术是一种将乳液PCR与磁珠和流式细胞术相结合的高敏平台。该技术的工作流程包括利用PCR进行DNA分离和扩增。该过程包括将DNA分子群转换为包被引物的磁珠群，随后进行乳液PCR和荧光探针杂交DNA。执行流式细胞术读取结果。BEAMing 数字PCR的工作流程见图3。

微液滴数字PCR Bio-rad技术基于水乳液微液滴技术。包含目标DNA的样品被片段化处理为20000个微滴。终点PCR扩增每个包含目标DNA的微滴。计算阳性微滴完成目标DNA定量。该方法可以得到绝对精确的目标DNA计数而且无需标准曲线，比实时PCR的灵敏度更高。

图3. 数字PCR（BEAMing）的工作流程。使用液滴生成器生成微滴；使用微滴读取工具读取。

QuantStudio数字PCR因配备芯片技术所以工作流程更简单，样品加载后使用系统软件执行PCR扩增、结果读取和分析。

QuantStudio 3D数字PCR采用一种密封芯片技术。与其他平台相比，它的价格便宜了50%。工作流程包括DNA稀释控制，在混合控制DNA、主混合物和参考试验后进行数字PCR反应。PCR反应加载到QuantStudio® 3D数字20k PCR芯片上，加盖后浸入液体密封。使用QuantStudio® 3D数字PCR设备完成芯片的热循环和结果读取和分析。

NGS

下一代测序技术革新了基因组分析的生物学研究。Illumina MiSeq系统用于目标基因组测序，MiSeqDx系统用于分子诊断。Miseq通过合成技术进行测序，这是一种可逆的基于终止子的方法，它可以检测单个碱基并将其并入DNA链中来生成异常的数据质量。逐个碱基测序消除了错误并提高了结果的质量。它的工作流程简单并配备基因组分析平台进行数据分析和共享。Thermofisher Ion Torrent NGS技术是由半导体芯片驱动的简单、可扩展且低成本的定向测序方法。离子扩增技术可以使用1ng的基因组DNA或RNA来扩增数千个目标。它可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品或ctDNA。测序工作流程需要耗时低于2天。Ion Torrent Oncomine cfDNA试验可以检测到基因中0.1%的突变。Oncomine肺部cfDNA试验可以检测到EGFR基因的几个热点包括T790M。

图4. NGS（Ilumina）的工作流程。方法包括模板制备、测序、成像和分析。工作流程涉及文库制备、簇生成；测序、对齐和数据分析。片段化

处理基因组DNA并使用5’和3’适配器连接制备NGS文库。这些片段使用PCR扩增并使用凝胶纯化。加载到流式细胞并杂交。尽管进行桥式扩增

的片段在克隆簇内扩增。接着使用逆向终止子逐个碱基进行测序消除序列前后特定错误。测序后使用生物信息学软件将生成的结果读数与参考基因组对齐鉴别差异。

EGFR T790M检测的样品

传统意义上肿瘤活检用于获取诊断、预后、复发、药物反应和药物耐药性信息。随着靶向疗法的出现，目前至关重要的一点是连续监测组织中出现的分子变化，这需要重复进行活检，疾病实时监测所需的连续重复活检面临着不能执行侵入性程序、不能自行活检和肿瘤组织的多样性等诸多挑战。

因此，血浆中的ctDNA检测是一种很有前景的工具，因为该方法的侵入性程度低，有助于EGDR突变的检测。一些研究已经表明ctDNA很可能源于肿瘤病变和转移位点，很可能代表患者的肿瘤基因组。由于易于获得、实践方便，ctDNA是突变检测很有前景的工具。通过反映肿瘤内和肿瘤间见的多样性，它有实时监测疾病负担的和预后的潜力。

使用其他体液进行肺癌突变检测的研究很有限。唾液、尿液和胸膜积液是其他可用于临床EGFR突变检测的生物样品。一种名为EFIRM的核心技术使用唾液进行EGFR突变检测。EFIRM与cobas之间在EGFR突变检测方面具有良好的相关性。几项研究已经表明，利用PCR技术可使用恶性胸腔积液代替组织和血液用于EGFR突变检测和监测。T790M耐药突变患者中，尿液ctDNA已经作为一种评估疾病进展和治疗反应的完全非侵入性样品出现。大多数研究都采用PCR技术或将其与NGS联合使用。通过让PCR与MiSeq相结合，一项监测尿液样品T790M动力学的研究揭示68%的患者在使用TKI治疗后存在T790M突变。在这些阳性患者中，10名患者的结果与组织活检的结果类似，3名组织活检为阴性的患者的血浆和尿液呈阳性。另一项研究报告称尿液和组织活检检测T790M突变结果的相似度为72%。血浆和尿液检测检出了组织活检未检出的额外T790M阳性案例。

血浆和组织中EGFR T790M检测用诊断平台的比较

EGFR基因变化的分子检测被视为NSCLC患者护理的标准。美国临床肿瘤学会、美国病理学家学会、国际肺癌研究协会、分子病理学协会和美国国家综合癌症网络的多个指南支持进行通过基因突变检测来指导治疗决策。

EGFR突变的分子检验指南建议使用一种性能卓越、周转时间在2周以内的经过确认的方法以防出现第二或获得性耐药，该方法应具有足够的灵敏度来检测第二突变。新的欧洲指南也鼓励在NCSLC患者中普及外显子18-21突变的检测。美国食品药品监督管理局批准罗氏公司的cobas作为EGFR突变检测的比较诊断工具（外显子19缺失、外显子21的L858R、外显子20插入包括T790M），利用组织或血浆检测指导TKI靶向疗法（埃罗替尼和奥希替尼），批准ARMS therascreen（Qiagen）作为外显子19缺失和外显子21（L858R）碱基置换突变的比较诊断工具指导阿法替尼的应用。

在识别EGFR突变的过程中，组织和血浆之间的一致性在处理液体活检是否可以作为组织的分子替代物的问题上起着至关重要的作用。研究报告显示ctDNA的特异性和灵敏度为100%，根据EGFR突变的不同，ctDNA和组织活检之间的一致率在27.5%-100%之间。一项涉及白种人NSCLC患者的IV期非盲单点研究（N=652）显示在评估吉非替尼的有效性和安全性的研究中，在血浆和肿瘤组织之间检测EGFR突变（ARMS，Qiagen）的一致性高达94%。在平台交叉比较研究中，利用cobas（Roche）、ARMS（Qiagen）、ddPCR（Bio-rad）和BEAMing ddPCR平台使用血浆和ctDNA检测T790M突变的一致性分别为57%、48%、74%和70%。数字平台检测T790M突变的灵敏度和一致性优由于非数字平台。另一项检测肿瘤和血浆中T790M突变一致性的研究见表2。这些研究报告的一致性范围为48%-94%、灵敏度范围为29%-81.8%、特异性范围为83%-100%。技术是引起一致性、灵敏度和特异性发生变化的主要驱动因素。

一些研究已经证明了在血浆（表3）和组织样本（表4）EGFR T790M检测中各种平台的使用情况（表4）。直接测序在EGFR突变检测中得到了广泛的地应用。研究报告称，直接测序的检测限在25-30%左右。但是该方法复杂、耗时且在临床实验室实践中没有进行标准化。虽然直接测序有灵敏度低的缺点，但是有几项研究报告却认为直接测序检测EGFR T790M的检出率为0%-50%不等。这种差异可以归因于T790M突变的低丰度（由于技术问题突变检测灵敏度较低而未检测到），也可以归因于样本量小。一些研究在T790M突变检测中比较了直接测序和其他技术（Mutant-enriched-PCR、RFLP-PCR、LNA-PCR、Mutation-biased PCR），并证明其他方法的灵敏度较高，检出率也高。

ARMS是另一种常用的血浆和组织EGFR突变检测方法。尽管该方法的特异性较高，但是与HRM、ddPCR、cobas、集落杂交和BEAMing相比，灵敏度较低。另一个研究使用结合了特异性等位基因竞争性阻断剂（ACB）与TaqMan定量PCR ARMS性结合的称之为ACB-ARMS PCR的方法进行EGFR T790M检测，在组织样品的检测中，该方法检测T790M突变的检测率为22.2%，而scorpion ARMS的检出率为0.00%。

定量平台如ddPCR和NGS广泛用于T790M的检测，尤其是TKI疗法期间的动态监测。Ishii等人报告数字PCR（Bio-Rad）检测T790M的灵敏度为82%、特异性为86%，使用血浆ctDNA检测与肿瘤组织间的一致性达到了83.3%。定性数字PCR检测T790M突变的灵敏度比ARMS更高，TKI治疗前后血浆样品的检测率为31.1%vs.5.5%（P＜0.001）和43.0%vs.25.2%（P=0.001）。利用血浆ctDNA，数字PCR进行的T790M突变的定量动态监测有助于预测EGFR TKI的临床结局，这是传统连续重复活检不可能办到的事情。在检测T790M突变方面，ddPCR的灵敏度和特异性高于cobas、BEAMing、ARMS和传统PCR。

利用Ion Torrent个人基因组工具的靶向NGS可在60%未被其他常规平台诊断的病例中检测到T790M抗体突变。除了EGFR突变外，还能检测到其他可能在TKI耐药中起作用的致癌突变。NGS的高通量分析阐释了这种分析在靶向治疗中的重要性。另外两项研究也证明靶向NGS在组织和血浆的耐药突变检测中的应用。与直接测序相比，质谱（MALDI-TOF-MS）法的组织中T790M突变检出率分别为质谱法83.3%和直接测序33.3%。MALDI-TOF-MS的结果与NGS之间具有良好的相关性。

cobas是一种常用于组织或血浆的突变分析的半定量方法。Thress等报告了肿瘤组织和血浆之间使用这种方法一致性为78.6%，另一项研究也表明组织和血浆之间阳性一致性比率为64%。利用cobas和NGS对T790M突变的定量分析（P＜0.001）得到了95%的一致性。cobas和NGS的灵敏度分别为72%和100%，特异性分别为74%和100%。尽管基于PCR的技术只能鉴别已知的突变，但是因为便于使用、周转时间短和成本低，因此比NGS更受青睐。

TKI治疗前后NSCLC患者的T790M发生率

在EGFR突变中观察到了种族差异。东亚地区的突变率为30% -40%，而高加索地区为5-13%，这标志着东亚流行病学中分子分析具有相当的重要性。在EGFR突变中，T790M突变发生在低于5%的未经治疗的EGFR突变的肿瘤中，在对第一代TKI产生耐药性的EGFR突变肿瘤中发生率约为50%。表3和4总结了NSCLC患者使用TKI前后组织和血浆样品中T790M突变的发生情况。虽然大多数的研究都没有报告患者的种族，所有的研究应该将研究分为亚洲研究和非亚洲研究。亚洲研究已经使用了cobas、ddPCR、发光、ARMS、直接测序和Ion torrent PGM平台检测T790M突变。T790M突变的频率范围为0%-35%，大多数研究报告在NSCLC患者使用TKI前该频率前低于5%。三项研究报告了患者使用TKI前T790M突变发生率在50%以上。这种高频率可归因于其中一项研究的样品量小，其他2项研究检测低丰度T790M突变的方法的灵敏度高（ddPCR和集落杂交）。使用TKI治疗后的T790M突变发生率介于0%-70%，但部分研究报告的NSCLC患者出现这一耐药突变的发生率为50%左右。这种使用TKI后出现的T790M低检测率可归因于检测技术灵敏度较差（直接测序）和肿瘤样品的多样性。

非亚洲研究使用ARMS、cobas和PNA-PCR进行突变检测。TKI使用后的T790M发生率大约为50%-60%。该比率直接与一线和二线治疗产生获得性耐药的时长有关。这一比率的变化可以归因于检测平台灵敏度的差异。不同研究关于组织和血浆内的T790M的检测率也不同（表3和表4）。不仅如此，Sueoka-Aragane等人证明特定亚组的患者如吸烟者、男性以、外显子19缺失人群以及出现新病变的患者更容易检出T790M突变。

一些研究证明，中国人群的T790M流行率随着使用的检测技术的不同而变化。Zhao等人确认了3种平台RTD-PCR测序、TaqMan探针PCR和Sequenom MassArray在78份组织样品中的7份中检出了T790M突变。ddPCR检测组织样品中EGFR突变的灵敏度和特异性高于qPCR，而且ddPCR能检出T790M突变但是qPCR不能检出。ARMS检测使用TKI后的患者的T790M突变发生率为48.3%，但使用TKI前的中国人群中ARMS不能检出T790M。另一项研究的报告称在TKI耐药患者中使用NGS检测T790M的检测率为36.1%。

结 论

此次综述中我们比较了多种检测EGFR T790M的诊断平台。多种平台如cobas、BEAMing、ddPCR和NGS能检测NSCLC患者的的EGFR TKI耐药突变，尽管它们的灵敏度、特异性和周转时间不同。在需要突变定量时，BEAMing、ddPCR和NGS效果较好。目前迫切需要关于EGFR TKI治疗后血浆ctDNA中EGFR T790M突变检测的前瞻性研究。

所有数据表明与组织活检相比，血浆检验是有用处的，尤其是那些必须连续监测EGFR T790MM耐药突变的患者。其他体液也可以作为发生EGFR突变的NSCLC患者靶向疗法实时监测的潜在替代物。

摘自《Oncotarget》，版权归其所有，仅供内部参考。

编译：张凯

审校：方研