常规血液分析仪的性能验证和质量控制
北京医院 卫健委临床检验中心 —— 黄钰竹 王治国
血液分析仪（hematology analyzers，HA）或自动血细胞计数仪在分析和技术上都是高度复杂的自动分析仪。这些分析仪通常用于测量全血细胞计数（complete blood count，CBC）。CBC由几个同时测量的参数组成，这些参数包括不同血细胞的数量、浓度（如血红蛋白）和一些额外的（描述性）参数（见表1）。全世界几乎所有医学实验室每天都会进行全血细胞计数，以筛查疾病或异常情况以及随访各种医学治疗（手术、输血、用药等）后的患者情况。因此，HA产生的分析结果是许多医疗干预措施的基础，且最重要的是这些结果在分析上是有效的。因此，在临床实验室应用新的血液分析仪过程中，必须执行验证过程以确保分析性能达到标准。应该满足哪些标准或应该使用哪些准则由实验室专家决定。本文为血液分析仪常用血细胞计数参数的验证界限的选择提供了指南。
表1. CBC参数
在诊断分析仪进入市场前，制造商应根据不同的国际（国家）要求对其进行确认，比如FDA批准（美国）或CE标志（欧盟）。这种确认通常在理想情况下进行。在临床实验室实践中，每日分析性能可能有所不同。一些国际的指南和规则，如ICSH指南、CLSI指南及ISO 15189标准规定实验室验证血液分析仪的性能。除其他事项外，这些指南描述几个验证的项目，其中包括精密度、正确度、可比性和整个预期结果范围内的线性。相比之下，指南中并没有提到不同水平的最低分析性能要求，需要实验室专业人员来解决。
除了遵守这些指南外，重要的是要有关于实验室结果可靠性的信息，特别是在诊断和治疗决策关键临界值附近的信息。如果在关键值附近的分析性能不确定或偏差过大，则不应采用新的方法或分析仪。本文为自动血液分析仪的性能验证和质量控制提供实用性的指导，并为血液分析仪须满足的当前性能标准提供专家意见。
1. 验证或确认
根据ISO 15189，实验室只使用按预期用途经过确认的血液分析仪。例如，根据CLSI指南，确认原则上应由制造商按照预期范围执行的活动，以及经临床实验室验证制造商的声明是否充足。注意不同的体液（如滑膜液、腹膜液、胸膜液、心包液、脑脊液或伤口排泄物）和不同采集管（如普通采血管、肝素抗凝采血管、柠檬酸盐采血管和EDTA采血管）的谨慎是有正当理由的，因为并非所有的HA都为此目的进行过确认。调整方法和在分析测量范围之外的测量还可能需要进行全面的确认。在确认过程中，制造商面临几大挑战：
首先，某些参数必须与参考方法进行比对。目前大多数参考方法都已过时，如血细胞比容、红细胞计数、白细胞计数、白细胞分型等。在这种情况下，新方法改进的性能与相对较差的标准进行比对或校准，这导致了比分析和技术可行性更差的性能。然而，在一些国家，注册机构要求实验室用上述参考方法和/或当前血液分析仪进行比对。因此，这一要求会导致比需求更差的分析性能，同时也阻碍了创新。
其次，将“标记”的新仪器与现有方法进行比对具有挑战性。例如，样品被“标记”来识别病理性的样品，需要在不同的模式、修改或额外的诊断检查（即显微镜检查或流式细胞术）重新检测。生成这些标记的底层算法可能完全不同，这使得两种类型HA之间的比对具有挑战性。通常，制造商试图确保分析仪能识别所有病理样品，如恶性白细胞（原幼细胞）的样品。为避免遗漏病理性样品，标记算法产生带有低阳性预测值（positive predictive value，PPV）（通常是高阴性预测值（negative predictive value，NPV））的标记，也就是说大量的正常样品得到可疑的标记，且需要（显微镜）检查，从而增加了实验室不必要的工作量。
最后，制造商建立参考区间是很困难的，尤其是在儿科人群中。从健康儿童和新生儿身上获取样品已证明是困难的。针对儿童群体的参考区间来源于几十年前发表的文章，使用的技术也已过时，这些参考区间现在是否还适用？是否存在新的检测参数？是否存在新的分析技术但尚未发布其参考区间？因此，制造商应做出相当大的努力对他们新的血液分析仪在这些群体建立参考区间。
1.1 验证
ISO 15189规定，实验室应在仪器安装完后和在使用前验证其是否达到必要的性能以及它是否符合与任何有关检查相关的要求。国际血液标准化委员会（International Committee for Standardization in Hematology，ICSH）和美国临床和标准化研究院（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）均已制定HA验证的指南。根据这些指南，验证研究包括精密度（复现性）、正确度（方法比对）、分析灵敏度（检出限）、分析特异度，包括干扰物质、参考范围、患者相关性研究、线性、携带污染和分析检测范围。然而，ICSH和CLSI指南并没有明确规定不同参数这些研究的可接受限。这些指南也没有提出必须建立参数可靠性的最小范围。验证研究的广泛性取决于独立的评估数据的可获得性（最好发表于同行评议的文献中）、实验室报告CBC参数的范围以及设备评估的可用样品范围。由于血液检测参数包括细胞分类和细胞指数，某些检验（前）特征与以每浓度血浆表示的更常规的实验室试验不同。因此，需要对血液学和血液检测参数进行深入的了解来解释验证分析。
在开始验证过程之前，我们应建立医学上允许的误差。试验性能不同方面的结合构成了总分析误差。总分析误差反映试验结果的分析可靠性。如果一个实验室想要验证它在临床方面产生可靠的结果，须考虑以下几个因素：首先，建议确定临床相关性水平。表1给出了一些建议的医学决定限。由于一些临界值可以区分相关患者群体，因此围绕这些临界值的可靠性是至关重要的。例如在血小板数低于10×109/L的情况下输注血小板，在该浓度附近验证试验性能是明智的。其次，在临界值周围的总分析误差对于临床决策应该是可以接受的。这种医学上允许的误差可能取决于临床医生的期望、生物学变异以及当前技术水平的性能。
1.2 样品
在评价研究中，应使用乙二胺四乙酸钾（K2EDTA）（或K3EDTA）抗凝的新鲜人全血样品，若在室温下储存，则须在采血后4-8小时内检测。如果将样品冷冻，则血液学参数在一段较长时间内是稳定的。需要特别注意保证在验证研究中包括可能进入实验室的所有采血管。如果使用微细采血管（例如用于儿科患者和毛细血管采血），则应对其进行评估，由于这些容器内相对低的样品量可能会影响HA的样品处理（例如不充分的混匀或与HA死体积相关的问题）。还必须保证研究将包括非常广泛不同类型的潜在病理性样品，其结果覆盖整个分析范围，例如血小板和/或白细胞计数低的样品、细胞计数高的样品、具有异常细胞（原幼细胞）的样品，以及具有已知干扰如冷球蛋白、高胆红素和高甘油三酯的样品。
1.3 精密度
精密度是指样品重复测量结果之间的一致性（见图1）。批内精密度（即重复性）通常由单批20个测量值组成，并以变异系数（coefficient of variation，CV%）表示。批间精密度同样以变异系数（CV%）表示，指连续20天重复检测同一被测物，每天检测一次，并受随机误差和漂移的影响。通常采用稳定的质控样品来确定批间精密度。必须验证制造商关于批内精密度和批间精密度的声明。此外，我们应尝试至少达到当前技术水平的重复性CV要求，这样我们才能为临床医生提供最准确的信息，从而提供机会来改善医疗决策和医疗质量。表2给出了大多数相关CBC参数的当前技术水平的CV要求。我们鼓励制造商开发和创新HA，使所有进入市场的新HA都能达到当前的技术水平。
图1. 精密度和正确度示意图
注：正确度是测量结果与真值之间的接近程度，主要取决于系统误差。精密度是测量结果的重复性，主要取决于随机误差。
表2. 当前不精密度可接受标准
1.4 正确度和可比性
正确度是测量结果与真值之间的符合程度（见图1）。由于只有部分选定的参数才存在参考方法，且实际操作中难以运用参考方法，因此临床实验室的日常实践无法使用CBC的“真值”。对于白细胞分类计数而言，目前显微镜法是参考方法（一般手工计数400个细胞）。然而，该方法存在一些缺陷，如统计误差、玻片分布误差及形态学解释误差。通常在验证研究中，作为一种替代方式，将评估的HA与日常使用的仪器进行比对。在可比性研究（患者相关性研究）中，使用2种HA应比对尽可能多的样品（对每一参数400份样品或更多）。此外，包括近似相等比例的正常和异常的样品是重要的。被评估的血液分析仪与当前使用的血液分析仪或参考方法间的差异应尽可能低（见表3a）。应用线性回归比较被评估HA与当前使用HA之间的参数。相关系数（r）为1表示两者之间呈完全正相关。然而，如果新的HA比旧HA更准确的话，这将对相关系数产生负面影响，因此须谨慎解释相关系数。此外，一些参数的相关性不好，如嗜碱性细胞计数。
表3. （a）分析正确度（b）标记的效率
1.5 灵敏度和特异度
在显微镜检查和400个细胞分类计数参考的基础上，分别比较标记或未标记的样品是否能准确地区分有或没有形态异常的样品，应可以确定HA标记的临床灵敏度和特异度。然而，并不是所有的形态异常都具有同等的临床意义。我们认为标记的正确度至少要对以下方面进行评估：原始细胞、早幼粒细胞、骨髓细胞、幼稚单核细胞、异常/非典型（怀疑恶性）淋巴细胞、破裂细胞、血小板聚集、红细胞凝集以及（取决于患者人群）疟疾感染红细胞。应计算特异度（所有形态正常样品中未被标记样品的百分比）和灵敏度（所有形态异常样品中被标记样品的百分比）。最新的灵敏度和特异度要求列在表3b中，然而目前并非所有实验室都满足这一标准。虽然灵敏度对于识别所有的病理，从而提供准确的结果是很重要的，特异度主要是限制不必要的显微镜分型的数量，从而提高效率。为评估在临床实验室实践中标记的预测值和总效率，我们应选择随机样品代表正常的工作流程，因为这些值会受到形态异常发生率的影响。从真阳性数（true positives，TP，即标记为异常形态）、真阴性数（true negatives，TN，即没有标记的正常形态）、假阳性数（false positives，FP，即标记为正常形态）、假阴性数（false negatives，FN，即没有标记的异常形态）可以计算阴性预测值（NPV）、阳性预测值（PPV）和总效率。为所有类型的标记样品计算可靠的灵敏度和特异度是不可行的，我们建议包括最有用的标志。
1.6 携带污染、背景和线性
携带污染是指血液分析仪从一个样品测量携带到随后测量分析物的含量。这可能会错误地影响（通常会增加）后续样品中报告的浓度。血红蛋白、红细胞、白细胞和血小板从高到低浓度的携带是重要的。通过对高浓度样品检测3次（H1，H2，H3），接着对低浓度样品检测3次（L1，L2，L3）可以评价携带污染率。其计算公式如下：
请记住即使携带污染率小到2%仍可能会对结果产生很大的影响。例如，在携带污染率为2%的情况下，血小板计数样品的检测结果（H3）为1000×109/L，该结果使得后续样品的检测结果从5×109/L（L3，实际值）假性增加到25×109/L（L1），在这种情况下通过重复检测可以防止检测结果假性升高500%。在相同的情况下如果携带污染率仅为0.5%，第二份样品的检测结果为10×109/L，而非实际值5×109/L。
背景（空白限）是指来自非检测参数测量的任何信号（噪声）。背景可能是由干扰物质引起的，例如，来自非血液试剂的信号或HA引起的电子噪声。理想的情况是，背景计数应为0。在具有非常低的细胞计数的体液如脑脊液中，可忽略的背景计数是非常重要的。检出下限指的是最低分析物浓度，其产生的信号能可靠地区别于背景噪音。它基于低浓度样品的背景和再现性，且有效地低于报告的范围。根据CLSI指南，定量下限是白细胞计数的不精密度（CV）为15%和血小板的不精密度（CV）为25%的水平。理想的情况下，白细胞定量的下限是＜0.1×109/L，血小板检测的定量下限为1.0×109/L。应使用定量限来规定报告范围的下限（见表4）。
线性（分析测量范围）是HA提供结果与在规定的浓度范围内检测的分析物成比例的能力。对于确定的参数，在不同的稀释度下在较大浓度范围内应该是线性关系。显然，这只适用于以每血浆体积表达的参数，而不适用于细胞指数。为评价线性，用稀释液或AB血浆稀释高浓度样品，并进行重复检测。在理想的情况下，线性回归将显示为截距为0和斜率为1的回归直线。相关系数（r）应接近1。对于HA而言，线性通常不是个大的问题，线性评价中最大的挑战是执行完美的重复稀释系列。
2. 参考区间
一些特征如年龄、性别和种族可能会影响CBC参数。因此，必须有准确而仔细的验证过程来验证每一报告参数的参考区间。ICSH建议包括至少120名健康人（60名男性/60名女性），以确定参考区间是否与当前HA相同。在适当的条件下，也验证儿科参考区间，尽管在实际工作中，通常使用已公布的参考区间或HA制造商提供的参考区间。然而，如果通过比对研究证实旧的和新的血液分析仪之间有良好的一致性，则是否为新血液分析仪重新制定参考区间还有待商榷。
3. 质量控制
对于仪器内部质量控制（内部质量控制）而言，每天（或更经常）测量质量控制样品是必须的。通常，这些质量控制样品是从制造商获得的，它们由两个或三个浓度水平（低、中、高）组成。但这往往会引发几个问题：首先，通常对这些样品进行了处理来延长保质期，因此，它们的行为与普通患者的样品不同。其次，制造商的目标界限通常非常宽泛，因此可能会忽略分析仪行为上的细微变化。因此，建议在多次测量的运行周期后调整目标范围，例如，调整为均值±2倍标准差。应用制造商提供的质控样品的益处在于可应用Levey-Jennings图判断一段时间内的仪器精密度（如漂移），然而，必须记住的是，越接近保质期限，质控样品的质量越不佳。
有吸引力的替代方法是使用所谓的移动均值法。这种统计方法使用的一个事实是在大的人群中CBC的分析参数随时间推移是稳定的，因此均值的变化可能代表了分析问题。这种方法已被证明是非常可靠和廉价的，但是它不能完全代替质量控制样品的使用。
如果实验室有多台血液分析仪和/或不同的分析技术可用于检测相同参数，则应进行仪器间的质量控制。所有检测方法都应该在每个样品中产生相同的结果。如果不同检测方法的检测结果之间出现未预见的差异，这可能会导致误解和可能不必要的临床干预。为确保来自不同分析仪和检测方法的检验结果之间的一致性，需要进行仪器间的质量控制比对。通常可用多个系统检测患者样品（从而可避免稳定的质量控制样品所谓的基质效应）并对结果进行比对来实现。建议每周至少一次，每次至少检测3份样品或更多样品对多台 HA进行比对。
实验室必须参加室间质量评价（External Quality Assessment，EQA）计划也称为能力验证计划。EQA样品应以与常规患者样品相同的方式处理以获得公平的比对。EQA通常使用处理过的样品，其组成类似的病理性样品（例如极高或极低细胞计数）。对样品进行加工处理以延长其保质期并降低样品对运输相关问题（如温度波动和震动）的敏感性。因此，与患者结果进行直接比较是不可能的。实验室必须使用EQA结果将他们的结果与（国际）国内公议值或参考结果进行比较，并使用这些来改进它们的质量，以及使他们的HA与公议组一致。必须记住在没有参考方法的情况下，结果应该与使用相同分析技术的HA组进行比较，由于大多数主流方法组的不准确度可能会使公议值产生系统的偏倚。此外，EQA材料不应用于校准目的（因为EQA公议值和真值（校准品）不一定是相似的）。在一些国家，监管机构滥用EQA结果评估参与实验室的质量，这对实验室的自我改进有负面影响，且不应提倡这种做法。
4. 结 论
为了确保血液分析仪报告结果的最佳质量，建议进行全面的验证工作。本文为HA验证提供了实用的指导。在本文中已总结了基于当前技术水平的HA测量特征的可接受限。我们已描述了在HA验证过程中的缺陷和挑战，并建议实验室在制定验证指南时考虑这些因素。此外，已给出了不同的质量控制方法以确保HA报告参数的最佳质量。
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