血细胞分析案例分享
北京协和医院检验科 张时民
北京协和医学院临床检验诊断学系血液体液教研室主任，北京协和医院检验科副主任技师，从事临床检验工作三十余年。中国医学装备协会检验医学分会委员和细胞形态学自动化分析学组副组长。中国卫生摄影协会医学教育与研究分会常委，中国合格评定认可委员会（CNAS）评审专家，多本医学杂志编委及审稿专家等。北京市临床检验中心第一届临床血细胞检验诊断专家委员会首席专家，卫生部临床检验中心聘任专家。主编专业著作12部，副主编专著10部，参编多部。撰写论文，综述等文章60余篇。
前 言
血常规检验是临床最为常用的一个检验项目，也是各种疾病诊断与筛查必不可少的一个基础检查项目。而现在血常规分析基本上是采用各种型号和原理的血细胞分析仪来完成的。由于血细胞分析仪具有快速、准确和便捷等优势，一直在改变实验室血常规检验方法与检验流程。近年来血细胞分析仪由于不断改进，各种新技术的综合使用，其检测性能越来越强大，检测速度更快，检测参数也越来越多，特别是具有白细胞五分类技术的仪器的普及应用及全自动流水线化的血细胞分析系统的使用，使得实验室越来越依赖这样的设备来完成大量的血常规检验工作。
然而血细胞分析仪并不是十分完美的，各种不同原理的血细胞分析仪在检测性能上也都具有各自的优点与不足。他们对正常样本的检验一般都具有很好的性能，但是对一些影响因素，对一些异常样本特别是血细胞质量异常、形态学异常的标本，其检测性能还不是那么完美，还有许多问题发生。这就需要进行筛查与复检，这就是制定复检规则的一个要点。而复检主要是依靠各种仪器复查、标本一般性状的观察、特别是显微镜下形态学的观察，才能在众多疑点中发现异常。而形态学检验又是复检程序中关键点和关键技术。
形态学检验是临床检验基础专业中重要的组成部分，也是金标准检验项目。这个项目对人的要求较高，需要有丰富的专业知识、深厚的形态学功底、不断更新的相关专业知识。在掌握形态学检验的能力之外，还需要了解各种与之相关的检验仪器性能、特点、不足与影响因素，这样才能更加有目的地达到进行形态学镜检、复检、复查、筛查之目的。形态学检查之重要性在于可能发现一般自动化检验设备所发现不了的问题，甚至是具有诊断价值的信息。因此不断提高形态学检验水平、不断学习、不断进取，它更是从事临床基础检验专业的每个检验人必备的基本功。
形态学复检可以结合仪器的散点图、直方图、报警信息等仪器参数进行分析，更需要通过病人的诊断信息与临床资料综合分析，才能够对一些少见的异常、仪器不能发现的问题进行准确判断和正确筛检。本期杂志刊登的几个病例都是我们在临床检验工作中发现的一些问题，结合复检和相关内容，给临床一个准确的报告，防止了漏检与漏诊。此次选择刊登这些经验性文章，希望对大家工作有所启发，有所帮助。也希望大家提出宝贵建议。
一. 谈谈眼镜核形的那种细胞——Pelger-Huët畸形与假性Pelger-Huët畸形
Pelger-Huët畸形可被译作佩尔格-休特畸形，在国内还有人把它称为派胡细胞或者译作佩-休二氏异常。在许多教科书、专著和图谱上对这种细胞的介绍篇幅不是很多。由于其特殊的形态特点，令我颇感兴趣，于是查阅了更多的资料，特别是国外资料，并配合我自己拍摄的图谱照片，综合起来介绍给大家。
关于Pelger-Huët畸形（Pelger-Huëtanomaly）的特点是白细胞中的中性粒细胞的核分叶过少，其细胞核多呈杆状或仅分为2叶，杆状核形则类似花生样，分叶核的分叶之间多以细丝状连接；典型的核型可呈肾形、眼镜形或哑铃形；叶多呈圆形或椭圆形；细胞质较为致密、深染，聚集成小块或条索状，其间可有空白间隙。其形特点可参考图1和图2，图1为一个眼镜形核的细胞，图2有两个眼镜形细胞和一个杆状核细胞。（插图来自张时民、王庚主编《血象-外周血细胞图谱》P85、P86），外周血涂片即可以识别出此类细胞。
图1：Pelger-Huët畸形
图2：Pelger-Hu.t畸形
这种特殊形态的出现被认为是成熟中性粒细胞核分叶能力减退，或细胞成熟障碍所导致。一般为常染色体显性遗传性疾病，或称家族性粒细胞异常，又名Pelger-Huët粒细胞异常症。特点是多数细胞，甚至90%以上的成熟中性粒细胞不分叶或仅分两叶，除粒细胞形态异常外，其吞噬等功能正常，一般无临床症状，常规血涂片检查或其他疾病检查血象时方始发现，血细胞分析仪一般不会出现报警信息或有核左移提示。这种常染色体显性遗传疾病主要为杂合子型，这种仅分为杆状核或仅分2叶核的细胞有可能会被误认作是未成熟细胞，从而导致误诊。具有这种形态特点的白细胞在1928年由荷兰血液病医生Pelger首次报道，并于1931年由儿科医生Huët确认为一种遗传性疾病。纯合子型其细胞分叶往往为圆形的核叶，并可能有功能性问题。纯合子型个体的临床表现不一，可出现骨骼畸形，如多指症、短掌骨、短上肢，身材矮小或脊柱后凸。
如果继发于严重感染的核分叶能力减退，则被称为获得性或假性Pelger-Huët畸形（Acquiredorpseudo-Pelger-Huëtanomaly）。其核的形状特征类似Pelger异常，但核染色质浓缩程度明显低于Pelger-Huët畸形的细胞异常。其数量在中性粒细胞中＞4%。在骨髓增生异常综合征（MDS）、急性髓细胞性白血病可见，还偶见于原发性骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病。图3和图4为一感染性疾病患者外周血，其中性粒细胞数量众多，但可见少许眼镜核型的中性粒细胞，其细胞分叶之间以丝状连接，形态类似Pelger-Huët畸形，但染色质较为疏松，数量较少，根据病情诊断，应为假性Pelger-Huët畸形。
图3：假性Pelger-Huët畸形
图4：假性Pelger-Huët畸形
在外周血涂片中发现假性Pelger-Huët畸形，往往见于一些疾病晚期患者，如大剂量化疗病人会有出现。这种假性Pelger-Huët细胞也在粘液性水肿、垂体功能减退、维生素B12和叶酸缺乏、多发性骨髓瘤、肠道病毒感染、疟疾、肌营养不良、类白血病反应转移到骨髓、早期骨髓发育不良、药物过敏（如磺胺类和丙戊酸盐类药物毒性）的病例中出现。在这些疾病中，尤其是药物诱导的情况下，识别出这种识别获得性或假性Pelger-Huët异常是非常重要的，因为它省却了进一步进行血液系统疾病排除的不必要的检验需求。
因此根据已发表的一些文献报道，作者认为识别出Pelger-Huët畸形及假性Pelger-Huët畸形都是有意义的，应该及时与临床沟通，查阅相关文献或资料，用于诊断和治疗。
下面两图是作者以前在微博中发布的Pelger-Huët畸形图。
图5
图6
二、血小板计数阻抗法准还是光学法准，有时真的不绝对！
现在高端血细胞分析仪在血小板计数上可以采用两种甚至三种方法进行计数。其目的就是防范血小板计数过程中出现的各种问题，例如大血小板增多导致的血小板计数假性减少，小红细胞增多或红细胞碎片增多导致的对血小板计数的干扰，冷球蛋白血症导致的假性血小板升高问题。当然对于真正的血小板减少，两三种方法齐上阵，重复计数，提高检验精度，防范各种问题发生导致的检验错误，可减少发报告的风险。
通常认为阻抗法完全依据血小板体积与红细胞体积的差异这一维参数区分，有些武断或者不确定因素太多，容易将红细胞与血小板混淆，特别是大血小板和小红细胞、红细胞碎片增多时影响比较显著。光学法则依靠血小板与红细胞在荧光反射强度上的不同和体积大小不同将二者区分开来，是在开启网织红细胞检查通道时完成的测定。一般认为该方法检测更加准确一些，但是检验成本会有升高。但是这绝对吗？且看下面的例子。
某患者诊断为血小板减少症，来医院血液科就诊，血常规检验结果显示贫血、血小板计数2×109/L，血小板各参数无，血小板直方图平缓至右端后升起。看到这结果检验科肯定不敢签发。根据复检规则及血液科首诊病人必须复查或复检这一规则处理。推血片一张并同时开启仪器光学通道复查，复查结果如下（图7）：
图7：血小板测定结果，散点图和直方图
结果显示贫血，阻抗法血小板计数结果3×109/L，光学法血小板计数结果33×109/L，两方法间差异显著，到底哪一个结果正确？血小板直方图显示为左侧平缓，右端升起，或许为大血小板增多；红细胞直方图基本正常，不考虑小红细胞影响问题。报警信息提示血小板分布异常及红细胞碎片。若有红细胞碎片，可能引起阻抗法血小板假性升高，这是通常的概念，而该结果正好相反。只能查看血涂片查找答案或确定如何发这个报告（图8）。
图8：血涂片
血片显示血小板极度少见，查看20余个油镜视野，只见到血小板1个（A），大血小板1个（B），缺颗粒血小板1个（C），未见血小板聚集现象，血液标本无任何凝块及纤维蛋白凝丝。部分红细胞中心淡染区扩大，小红细胞易见，偶见红细胞碎片（D）。白细胞未见异常。这显然是一个血小板极度减少的血象。再换一个纯粹光学法原理的仪器测定，其散点图显示血小板不多，测定结果为3×109/L。这样看来该病例确实是血小板极度减少，可报告危急值了。
那么这仪器光学通道为何把血小板检测出一个较高的结果呢？难道将部分红细胞碎片误认为血小板了？看看光学法散点图的区别吧（图9），假性光学法血小板增多其血小板散点呈散乱分布，其散射图与正常散点图、大血小板增多散点图、血小板减少散点图的散射区域和分布不同。
图9：散点图区别（A正常散点图，B大血小板增多，C血小板减少，D血小板假性增多）
确实不能说小红细胞或红细胞碎片被加入到血小板散点图中，或许是其他因素的干扰。当然我们还要更高端的仪器，具有低值血小板自动复查功能的仪器，可以使用阻抗法、光学法、特殊血小板荧光染色的F通道检测法。三管齐下应该可以解决问题，请看下面结果和直方图、散点图。
图10：XN检测系统测定结果
血小板数量确实非常少，仅仅是阻抗法略高，其他两个通道检测结果都是1×109/L。这样问题就解决了，可以及时发放报告并立即报出危机值给临床。
小结：这个问题充分说明了检验方法的局限性。我们不能以通常的思维去判断每一个问题，即使是公认的原则。不能完全相信一种方法或原理。标本间有不同，干扰因素有不同，检测方法也有不同，遇到问题要多思考，多想办法，至少遵循眼见为实的原则进行显微镜复检。各种原理的血细胞分析仪都有其独特的方法、原理与特点，或许可以采用互补的原则处理特殊标本，以发现问题，解决问题。某些医院实验室为了节省试剂成本，把某些高端仪器的光学通道及F通道关闭，使得仪器在血小板测定上的自动多方法复查功能失去，使得高端仪器低端应用，非常容易造成最易出现分析问题的血小板计数出现错误，最终可能会影响临床的诊断与治疗，伤害患者利益，这是得不偿失的做法。
三、中性粒细胞体积大小不等你知道吗？—— 一个特殊病例引发的对不同原理血细胞分析仪应用的思考
在血常规检验中，我们都知道的一个参数叫做红细胞体积分布宽度（RDW），是表达红细胞体积大小不等的一个客观参数，任何一个品牌的血细胞分析仪都会给出这个参数，而且可能会有RDW-CV和RDW-SD两种表达方式。在血小板检验参数中也有一个类似的参数叫做血小板体积分布宽度（PDW），也是表达血小板体积大小不同的一个参数。当红细胞大小不等明显或血小板体积大小明显不同时，我们可以见到这两个参数升高，并在血片上看到他们大小不等的现象。还有一个参数只有很少品牌的血细胞分析仪有，叫HDW，是表达红细胞内血红蛋白含量均一性的参数，只有在Siemens Advia 2120血细胞分析仪上可以提供该参数。如果这个参数升高，可以看到血片上的红细胞内血红蛋白含量明显不均，有低色素的，有正常色素的还有高色素的，其染色后形态深浅不一，中心淡染区大小明显不同，从色素含量上看，细胞是分为两群的。
再有一个参数，或者是两三个参数，是表达白细胞体积大小不等的情况，也就是我们本节标题所涉及到的内容。其实能测定白细胞体积、电导性等情况变化的，只有Beckman Coulter 品牌的血细胞分析仪，其采用VCS方法对白细胞进行分析、分类，可以用电阻抗法测定细胞体积（V），用电导性技术（C）测定细胞内部结构，用激光散射技术（S）测定细胞内颗粒与核型及质量，从而达到对细胞分类的目的。也就是说每一个细胞的测定都会得出V、C、S三组测定数据，最终分析判断该细胞的类型。其实它还可对淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的各三个参数进行统计分析（见图17）。
回归主题，我们知道中性粒细胞会在传染病、严重感染、化脓性感染、中毒、恶性肿瘤、大面积烧伤等情况下出现毒性变化，而毒性变化包括出现中毒颗粒、空泡变性、杜勒小体、退行性改变和中性粒细胞大小不均。我们往往对中毒颗粒了解和印象比较深，而中性粒细胞体积大小不均往往被人忽略，因为我们只能凭经验判断细胞大小改变的程度，而没有一个客观指标。看看下面这个病例，或许能给你带来一些启发。
某患者诊断为骨髓增生异常综合征（MDS），表现为贫血和白细胞轻度增高，首先用Siemens Advia 2120血细胞分析仪进行血常规检查，发现白细胞分类结果显示单核细胞（Mono）增高，于是查看散点图（图11）。
图11：SiemensAdvia 2120血细胞分析仪测定结果及散点图
再用Sysmex XE-5000检测，散点图正常，没有任何与白细胞形态异常的报警信息（图12），单核细胞正常，没有触发复检规则，完全可以签发。两仪器结果，特别是在分类上截然不同，也令人产生疑惑。当然两品牌设备在白细胞分类上采用了完全不同的原理，前者采用过氧化酶染色法，后者采用核酸荧光染色法，两方法都是经典方法，对绝大多数样本来说，测定结果没有什么显著差异，完全可以信任。
图12：Sysmex XE-5000血细胞分析仪测定结果及散点图
但是这个结果有些特殊，我们不妨涂个片子看看。血片显示白细胞体积大小不等，体积大的中性粒细胞同时伴有核分叶过多（核右移）现象，细胞内颗粒含量不均，特别是体积较小的细胞，颗粒含量极少（图13、14、15、16）。这可能就是造成过氧化酶染色通道出现体积大小不等的两个群体，以及部分中性粒细胞颗粒缺失而出现在单核细胞区域的原因。而细胞核酸染色法，因为关注的是细胞核酸而不是体积与颗粒，所以在分类上没有表现出异常的原因。
图13：血片：大小不等，颗粒缺失，核右移
图14: 血片：体积大小不等，颗粒缺失或部分缺失，核右移
图15：血片-白细胞大小不等，颗粒缺失及空泡变性
图16：体积大小不等，颗粒缺失，核右移
而该MDS患者由于骨髓造血机制出现问题，骨髓内中性粒细胞的前期细胞发生顿挫性不规则分裂导致的形态改变，临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。从疾病分类角度看，可能属于MDS难治性血细胞减少症伴有多系发育异常，或者分类不明的的情况。具体病因和更细致的判断则需要多种检查才能确定，血常规检查只是一种初筛，发现异常需及时报告。如果没有复检筛检，这个病例则有可能被放弃。我们在最终报告中重新分类了结果，其实人工分类的结果与SysmexXE-5000测定结果非常接近，但是由于进行了血片复检，我们还是发现了问题，并在报告中描述了核右移、细胞体积大小不等、颗粒缺失等异常现象，希望引起临床重视，并做进一步检查。
中性粒细胞体积大小不等或者颗粒缺失等现象对发现疾病、诊断病例还是非常有帮助的，因此不要忽略这个现象。要善于发现中性粒细胞体积大小不等而显现的毒性改变，甚至是造血系统问题的发生。如果能有BeckmanCoulter的血细胞分析仪，则其会给出中性粒细胞体积大小不等的客观参数（NE-V-SD）或者颗粒分布不均的客观参数（NE-S-SD），或许能够客观地帮我们发现问题，这也是该系列仪器在白细胞分析上的独特之处（图17）。
图17：BeckmanCoulter LH750血细胞分析仪的白细胞研究参数界面和散点图
小结：本文目的不在于评价某种仪器的优劣。其实不同原理的仪器都有各自的特点，如果仅使用一个品牌的仪器，有些问题发现不了，有些问题被隐藏，有些问题则又无法解决。因此实验室有条件的话应该配置多种不同原理的血细胞分析仪，遇到特殊病例，用不同原理的仪器进行检测，或许能发现和解决更多问题。但是前提是它们之间在绝大多数样本上的检测结果应该保持基本一致，仪器间比对能够通过。它们其实更适于解决所谓的疑难问题，根据各自的特点，发挥它们独特的作用。
本文目的并非要说明某种原理或某品牌仪器的好与不好，也不是说能给出分类就好，分不出类别就不好，或分类出现错误就不好。作者的目的在于说明正因为在某方面出现的结果不正确或差距较大，也许就是这个特殊病例的特殊表现，这或许能为我们查出问题带来思路。其不利的一面或许就是有利的一面，使我们有机会发现不同、发现问题，从而想办法解决问题。同时也希望各血细胞分析仪生产研发单位不要一味模仿某个品牌，要开发出有自己特点的血细胞分析仪，在提高检验精度的前提下，有所创新、有所发展、有所特色、有所不同。
注：病例转载于张时民新浪博客
