分子诊断POCT类产品 —— 一站式“样本进, 结果出”解决方案

自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应（PCR）以后，PCR技术很快成为学术研究和临床诊断的热点技术。相比于其他体外诊断方法，使用PCR技术利用样本在两个或三个温区内的反复升降温过程，实现对于核酸信号的指数级成倍放大，再通过特定的检测手段读取信号进行分析判读的方法大大提高了疾病检测的灵敏度与特异性，为新型检测技术的发展和疾病预防控制立下了汗马功劳。

但是，较之传统的生物化学检测或免疫蛋白检测，以PCR技术为基础的分子检测方法在使用成本，操作复杂性以及实验室建设方面都有较高要求。由于PCR反应本身对于待测样本的纯度要求高，核酸提取制备过程繁琐耗时等特点，完成PCR反应通常需要用到一系列昂贵仪器和复杂的实验室人工操作。同时，由于PCR反应本身极容易受到外界污染影响，造成结果失真，PCR反应通常需要在专业建立的PCR实验室内进行。另外，由于分子检测的总过程耗时较长且成本较高，有一定规模的PCR实验室通常采用提高样本通量的方法来降低单次检测平均时间与成本，这在某种程度上制约了分子诊断的灵活性。

目前，在绝大多数经济发达地区，医院往往配备了专业PCR实验室以集中处理有分子诊断需求的样本，并由严格受训过的专业人员操作。然而，在一些偏远地区尤其是医疗基础不完备的地区，以及发达地区的次一级医疗机构，受制于资金和专业受训人员的缺乏以及样本量的不足，建立专业的PCR实验室是一项非常巨大的挑战。相反的，这些医疗机构往往选择将样本外送检测，或是用其他体外诊断方法代替分子检测方法，虽然在某种程度上暂时解决了缺少专业PCR实验室的不足，但是伴随着检测时效性以及检测精度的牺牲。

正是在这种情况下，以分子诊断为技术基础的即时检测（POCT）解决方案应运而生。这类产品往往利用一个一次性使用可抛弃式的测试盒，将样品处理、核酸提取以及PCR检测所需要的各类试剂预先封装在盒内。使用者只需要经过简单的培训，便可自行将样品加入测试盒内，然后将测试盒放入仪器相应位置，剩下的工作由仪器全自动完成。通常1到2个小时后，整个反应流程结束，使用者可以通过仪器附带的专业操作软件进行结果判读或报告输出。较之传统的分子检测方法及硬件要求，这种全自动一体化分子检测POCT平台及一次性使用测试盒实现了“样品进-结果出”的全新核酸检测方法。其特点是:

■ 小型POCT分子检测平台，移动方便节省空间

■ 无需建立专业的PCR实验室

■ 无需专业受训的实验室操作人员

■ 样品的全流程在封闭空间内完成，隔绝了外界污染源

■ 仪器全自动操作，减少了手工操作带来的误差

■ 检测时间短，往往1-2小时完成整个PCR检测流程

■ 对于传染性较强的样本，测试盒内封闭空间大大降低了对实验室生物安全性的要求

■ 由于“一机一盒”的设计，通量较低

■ 一次性测试盒价格昂贵

鉴于以上特点，分子诊断POCT类产品及其一次性测试盒在一些特殊场景的使用具有得天独厚的优势，尤其适用于不具备专业PCR实验室搭建和维护条件的医疗机构以及通量要求不高但是对自动化程度依赖性较大的情境。不同于生物化学检测和免疫荧光检测的POCT类产品，分子诊断POCT类产品及其一次性测试盒开发的技术难度高，产品开发周期长，风险较高。另外因为产品开发过程中往往需要用到医学、生物化学、分子生物学、机械、流体力学、电子、光学、热学、塑胶加工、软件等多学科交叉知识，对研发人员的专业背景及工作经验要求极高。目前，除了个别厂商在某一特殊领域有所突破外，分子诊断POCT类产品及其一次性测试盒在国内市场尚属空白地带，具有独立自主知识产权及核心技术的产品线还比较少见。国外市场上，从大约十余年前，便有Cepheid，BioFire等公司积极推出具有自己鲜明技术特点的分子诊断POCT解决方案，并迅速占领了相应的市场。近几年，更是有越来越多的分子诊断POCT类产品问世，并且几乎每家公司都有其独特的技术特点。鉴于产品开发周期长，风险高等特点，国外的分子诊断POCT类产品往往由一些中小型公司开发完成，这些公司的产品或是利用创始团队的智慧提出设计方案，或是借助大学和科研机构的实验室半成品进行深入开发完成。这并不意味着市场竞争不激烈，相反的是，很多体外诊断（IVD）领域的大公司也在虎视眈眈的密切注视着市场的一举一动，一旦发现合适的产品，便利用其资本优势迅速进行并购，再加上其本身的品牌效应及规模，可在短时间内推出产品。近年来，此类大手笔并购在IVD领域屡见不鲜。例如，2014年法国的生物科技企业生物梅里埃（BioMérieux）以4.5亿美元外加偿还净金融负债的方式收购了分子诊断公司BioFire；同是2014年，罗氏（Roche）诊断斥资4.5亿美元买下位于美国马萨诸塞州的IQuum公司，并将其主打产品LIAT系统并入罗氏诊断Cobas产品线；2016年9月，IVD巨头丹纳赫（Danaher）以40亿美元的现金收购分子诊断明星公司Cepheid；2017年另一IVD巨头雅培（Abbott）花费58亿美元整合了美国IVD领域上市公司Alere，包括其旗下基于恒温扩增技术平台的Alere-i分子诊断POCT产品。2017年，国内的POCT企业万孚生物也加入国际并购大军并且以约1.25亿人民币的价格认购英国分子诊断POCT公司Atlas Genetics 13.63%的股权，并获得其产品在中国地区的独家代理权。就在今年，凯杰（Qiagen）公司以1.47亿美元买下了另一家分子诊断POCT产品公司Stat-Dx。可以预见，类似的并购在未来几年还将会陆续发生。

以Cepheid公司最著名的分子诊断POCT产品GeneXpert为例，其产品包括仪器，一次性测试盒及控制软件三大部分。一次性测试盒在出厂时将样品处理、核酸提取及扩增过程中所需的各种试剂预先填充在内，其中核酸提取试剂以液体形式封装，而核酸扩增过程中所需要的试剂以干球形式预装，便于长期保持及运输。测试盒由两部分组成，一个方形的盒体和一个置于后方的扁平的反应管。盒体内包含多个腔，用来存放不同试剂及反应液。盒体的上方有一个开口，用于样品加入。盒体的下方有一个专利技术的内置旋转阀，阀上的通道恰好与每一个腔分别对应，当转到旋转阀时，通道可以依次按预先设计的流程连通不同腔，实现在密闭空间内的多路流体分配。GeneXpert测试盒的另一项核心技术是其细胞裂解方法。不同于常用的加热及化学裂解液，GeneXpert在盒体的底部设计了一个超声接收装置。利用其仪器中的超声源发生器产生kHz频率的超声波，通过一个超声探头和盒上的超声接受装置，将超声波的能量导入盒内样品中以实现裂解功能。这样设计的好处是可以最大程度的对于不同样本中的细胞实现充分裂解，同时也使得整个样品处理时间大大缩短。目前，GeneXpert的测试盒有多达四十余种，产品涵盖了传染病、性健康、病毒学、肿瘤学等多个大类（图1）。

图1. Cepheid公司的分子诊断POCT产品GeneXpert（图片来源网络）

GeneXpert测试盒的反应管是一个厚度约1.2mm的中空结构，两侧通过热压方式粘合两片透明薄膜，构成闭合空腔。纯化过的DNA样品在盒体内与扩增所需试剂充分混合后被输送至反应管，然后转动旋转阀将反应管隔离。独特的光学系统设计可以允许最多检测到管内六种不同波长的荧光信号。由于只有单一的反应管，GeneXpert测试盒的检测靶点数受限于荧光信号的波长选择，目前看来这是其不足之处。

后续的其他产品似乎也注意到了这一点，并且通过不同设计方式增加检测靶点数量。例如，比GeneXpert略晚开发的美国BioFire公司的分子诊断POCT产品FilmArray则着重突出检测组（Panel）的概念。其主打卖点是采集一次样本，放入一次性测试盒中，便可以同时检测多达二十余种目标基因。FilmArray测试盒侧面看呈L形，由一排较硬的带有活塞的储液筒和一片较软的热压成型的流体通道组成。蜂窝状的中空、排列紧密的多反应腔室置于热压塑封内，每个微型反应室包含PCR扩增反应需要用到的干试剂。测试盒内在出厂时内部预置了负压真空，因此当样品进入微型反应腔时，液体可以自动填充整个腔室而避免残留气泡。由于每一个微型反应室在分液之后相互隔离，因此可以在每一个反应室内放置不同目标基因的引物和探针，以达到多重PCR检测的目的。FilmArray采用巢式PCR原理，对样品进行预扩增之后再进行荧光PCR检测。其蜂窝状排布的微型反应室配合CCD相机进行单色荧光信号判读（图2）。

图2. BioFire公司的分子诊断POCT产品FilmArray（图片来源网络）

FilmArray主推检测组(Panel)概念以实现多重PCR检测。目前已推出的检测组有呼吸道感染检测组、血液感染检测组、胃肠道感染检测组和脑膜炎感染检测组。

除上述两类产品外，近些年国外陆续有其他公司推出其分子POCT诊断平台及产品，鉴于篇幅所限，在此不再一一列举。这些一次性使用的分子检测测试盒，基本都由一个三维立体的盒体和一个或多个二维扁平的反应管组成。三维立体的盒体内包含多个腔室用于存放样品处理及核酸提取的各类反应液；而扁平状的二维反应管便于快速实现液体温度升降及光学检测。不同盒体及反应管的设计进而影响后续加工工艺、组织流程及质量控制以及测试盒整体成本。总体来说，分子诊断POCT类产品的测试盒价格仍然偏高，除堆叠仪器硬件内核外，目前还没有其他更好的办法扩充检测通量。但是，考虑到专业PCR实验室的搭建及维护成本、专业操作人员的人工成本，以及“一机一盒”带来的检测灵活性，分子诊断POCT平台在一些特定场合仍然大有用武之地。

在我国，目前GeneXpert的分子诊断POCT产品仅有MTB／RIF测试盒取得了注册证，并且已广泛用于各级疾控中心及医院的检测实验室。MTB／RIF测试盒可以同时检测结核杆菌及利福平耐药性，作为常规结核检测中显微镜涂片和细胞培养方法的补充，发挥了巨大作用。但是综合其成本考虑，这类分子诊断POCT产品的单次检测价格相对于我国的整体消费水平仍然太高。MTB/RIF测试盒因为得到基金补贴的缘故，目前可以以较低的价格使用。另外，因为结核样品的初步筛查一般先由显微镜涂片检测等方法完成，因此当进行结核分子诊断检测时，样品的数量已大大减少，对于检测高通量的需求并不迫切。

除了上述考量点外，我国的医疗体系、法律法规及医疗保险流程和西方国家不尽相同，因此一些国外产品进入中国市场时，在没有充分调研使用需求的情况下，未必适合中国国情。例如，在女性宫颈癌防治中非常重要的人乳头状瘤病毒（HPV）筛查检测中，对检测通量的要求极大，同时又迫切需要自动化检测流程以节省时间和人力成本。另外，我国的物价部门对于HPV检测收费有严格的限定。这些现实问题决定了国外厂商的分子诊断POCT类产品很难被直接用于HPV筛查工作。相反的，国内厂商如博晖创新，则另辟蹊径开发出一种微流控芯片加传统机械手臂配套的半封闭检测平台，有效的解决了HPV检测中的上述问题，反而赢得了市场的认可。这些都是后来厂家在产品开发过程中需要深入思考的内容。可以预计，未来由于医疗分级需求、自动化操作、进一步提高检测准确率及人力资源等方面的考量，分子诊断POCT产品还将会有更大的市场空间。如何将产品的技术开发环节与量产工艺装配、价格成本控制及使用者的实际需求相结合，是后续产品能否占领市场的关键。

（本文所述内容仅代表作者本人观点）