一种新型带内标的双重实时PCR法 用于精确定量血浆DNA

潘世扬，教授、研究员、主任医师和博士生导师。江苏省人民医院检验学部主任、南京医科大学医学检验系主任。中华医学会检验医学分会副主任委员、中国医师协会检验医师分会常务理事、江苏省医学会检验分会前主任委员和《中华检验医学杂志》编委，是《BMC Cancer》等SCI期刊审稿专家。

目前主要从事临床重大疾病诊断与治疗的分子标志物的研究。在肿瘤单克隆抗体、人血浆游离DNA、DNA甲基化及细菌耐药整合子等的研究与临床检测应用方面具有较深的造诣。新发现用于非小细胞肺癌（NSCLC）等肿瘤诊断与治疗的分子标志物SP70，获授权国家发明专利4项，国际发明专利3项。基于这些专利研究成果，建立了包括液体活检在内的多项创新性检测诊断技术，并在临床肿瘤诊疗中推广应用。近5年主持多项国家和省级重大课题。主编的200万字学术巨著《临床分子诊断学》一书，由人民卫生出版社于2013年出版。发表SCI和Medline收录的高水平学术论文50余篇。

背景：循环DNA水平在许多病理情况下升高。然而，现有实验室循环DNA定量分析技术存在的重复性差的问题，阻碍其临床应用。

方法：我们设计了一种新型重组DNA片段，可用作新开发的双重实时PCR检测的内标。这种检测方法用于定量测定血浆游离DNA总量，并且已在5,442位健康成人和200位创伤患者中得到验证。

结果：这种新型检测技术与两种传统方法相比，检测限更低为0.1ng/mL，批内和批间CV更小，而且回收试验的准确度更高。健康男性的血浆DNA中位值（20.3ng/mL，n=3,092）显著高于健康女性（16.1ng/mL，n=2,350）（Mann-Whitney两独立样本秩和检验，P＜0.0001）。血浆DNA浓度的参考区间分别是健康女性0-45.8ng/mL和健康男性0-52.5ng/mL。96%的创伤患者的血浆DNA浓度高于正常临界值上限，与相应的损伤严重程度评分密切相关（R2=0.916，P＜0.0001）。

结论：使用新型带内标的双重实时PCR定量检测血浆DNA，其测定结果更准确，在临床诊断中具有广阔的应用前景。

关键词：血浆DNA，双重PCR，定量，内标，参考区间，创伤

简介 

循环DNA是已知存在于血液中的细胞外DNA，于1948年被首次提出。自从1977年Leon等人发现癌症患者的循环DNA水平升高后，循环DNA定量研究取得了重大进展。这个新兴领域引起了人们广泛的兴趣，关于其对各种疾病的潜在临床应用的报告相继发表，比如恶性肿瘤、妊娠异常、创伤、药物中毒、器官衰竭、自身免疫疾病和器官移植排异等。然而，现有循环DNA定量分析技术存在的显著差异，阻碍其在临床实验室的应用。2004年，一项大型前瞻性研究使用PicoGreen双链DNA定量试剂盒（Invitrogen，Waltham，MA，USA）测定健康受试者和癌症患者的血浆DNA浓度，该法设置参考标准曲线。结果显示20个参与实验室测定的健康对照受试者的血浆DNA水平存在显著差异，这种差异主要来源于DNA提取过程。近年来，相继制定了多种DNA提取方案。 然而，提取过程中循环DNA不可避免的存在各种丢失可能对结果产生重大影响。

为了解决这一问题，血浆DNA定量的临床应用需要建立一种不确定度较低的精确检测方法。因此，我们建立了“带内参照的人血浆DNA定量检测技术”，通过双重实时荧光定量PCR检测方法，对血浆DNA进行定量测定。检测原理如图1所示。简而言之，从人看家基因β-actin中选取相应41bp序列与载体重组。将已知浓度的线性重组DNA作为内标加入到血浆样本中并与内源性核酸一起提取出来。使用通用反向引物通过双重实时荧光定量PCR在同一反应管中同时扩增内标和目的基因（β-actin），使扩增效率相近。扩增完成后，根据已知内标数量计算目的基因的浓度。

方  法

1. 使用内标定量血浆DNA的双重实时PCR检测

用于检测人血浆DNA的双重实时荧光定量PCR方法，如图1所示。使用TaKaRa Ex Taq R-PCR系统、版本2.1（TaKaRa）的组件，对50μL反应体积进行双重实时定量PCR。每个PCR混合物包含每种正向引物各200nM；反向引物700nM；每个探针各100nM；1单位的Takara Ex Taq HS聚合酶；dATP、dTTP、dCTP和dGTP各400nM；6mM MgCl2；1×实时PCR缓冲液和5μL纯化血浆DNA。热反应条件如下：首先95℃作用5分钟，然后95℃ 15秒、56℃ 30秒和72℃ 40秒循环50次。扩增使用7,500 Sequence detector（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）。设定扩增图的基线值以后，输出标准化报告基团信号（Rn）数据并使用LinRegPCR软件进行线性回归分析以获得目的基因和内标的平均扩增效率。选择最佳阈值以确定Ct值。由于β-actin基因及内标的扩增曲线使用了相同的阈值，因此血浆DNA浓度（单位copies/mL）的计算公式如下：

其中，C=血浆中的β-actin基因浓度（copies/mL），E=平均扩增效率，下标β和IS分别代表β-actin基因和内标。使用3.3pg单拷贝人基因组DNA作为转换因子将浓度单位转换为ng/mL。

2. 其他两种传统定量方法

如上文双重实时PCR检测所述，对β-actin基因执行单通道实时定量PCR。根据浓度范围在0.1-1,000ng/mL的人基因组DNA标准品的外部标准曲线，推断血浆DNA浓度。使用PicoGreen dsDNA kit（Invitrogen）进行荧光PicoGreen检测，并以480nm为激发光源波长，在荧光分光光度计（Spectra Max Gemini EM，Molecular Devices，Sunnyvale，PA，USA）中检测520nm波长的荧光信号，并以浓度分别0.1、1.0、10、100和1,000ng/ml的λ DNA为外部标准品，建立定量检测标准曲线，以此计算待测样本的血浆DNA含量。

3. 方法学评估

初步实验对血浆DNA、内标DNA进行双重实时PCR扩增以及两者的混合物并行进行PCR，以证实双重PCR检测的特异性。

经过紫外分光光度法定量后，将从长期保存血液（置于室温下48小时）中分离出来的血浆样本用生理盐水稀释为10-2，10-1，100，101，102，和103ng/mL，并用上述三种不同的方法进行定量以评估其灵敏度。为了评估这些方法的精密度，在同一批次中对不同DNA浓度（10-2，10-1，100，101，102，和103ng/mL）的血浆样本定量测定10次以确定批内差异，并重复测量10次以计算批间差异。

通过回收试验测定这三种不同方法的准确度。简单来说，就是将纯化血浆DNA（0、0.02、0.2、2、20和200ng）加入到200μL血浆样本中。提取总血浆DNA并使用三种不同的方法进行定量。

使用这三种方法定量测定相同的混合血浆经过三种不同的DNA纯化方案提取的血浆DNA浓度，这些纯化方案包括E.Z.N.A Blood DNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA）、QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）和传统的酚-氯仿提取法加乙醇沉淀。这三种方法还被用于定量测定400位健康成人的血浆DNA水平。

4. 健康受试者和创伤患者

研究共招募了5,442位进行年度健康体检的健康成人（中位年龄44岁；2,350名女性）以及由于急性创伤损伤到南京医科大学第一附属医院急诊外科就诊的200位患者（中位年龄49岁；112名女性），并获得了他们的知情同意书。排除年龄在18岁以下、孕妇或由于热损伤入院的患者。住院时根据损伤严重程度评分（ISS）计算总创伤程度。

5. 血样收集和处理

收集健康成人在体检期间的空腹血样（2mL）。在损伤发生后20-100分钟（中值50分钟）采集患者的外周静脉血（2mL）。所有血样均在样本收集后2小时内进行处理。简而言之，EDTA血样于室温下1,600g离心10分钟。将上层血浆转移到聚丙烯管中，转移过程中要尤其小心，避免破坏白细胞层，然后于4℃ 16,000g再次离心10分钟以清除残留血细胞。加入50,000拷贝的内标后，在提取DNA之前将包含2.5×105 copies/mL 内标、经过两级离心的无细胞血浆样本冷冻储存于-70℃。

使用Bilatest DNA/RNA kit（Bilatec AG，Viernheim，Germany）从200μL血浆样本中提取DNA，并将纯化血浆DNA储存于-70℃供进一步分析。

6. 统计分析

使用Stata/SE 9.2（Stata Corporation，College Station，TX，USA）以盲法进行所有统计分析。通过Spearman秩相关检验确定，双重实时PCR检测与紫外分光光度法定量测定的血浆DNA浓度一致，且创伤患者的血浆DNA浓度与ISS相关。单向ANOVA用于检测使用不同DNA提取方案的四组之间的差异。使用Mann-Whitney两独立样本秩和检验分析健康男性和女性以及创伤患者的中值血浆DNA浓度。在95%置信区间确定血浆DNA浓度的参考区间。使用t-检验比较不同定量检测的回收率。

结 果

1. 检测特异性和灵敏度

靶β-actin基因和内标通过相应的引物扩增后分别获得91bp和99bp PCR产物，没有进行跨种扩增。基于5' 核酸酶Taqman检测，FAM和JOE释放荧光信号并在ABI 7500 Sequence Detector的通道1和2中检测到这些信号（图2）。

对于连续稀释血浆样本的循环DNA浓度，紫外分光光度法与双重实时PCR检测（R2=0.988；Spearman秩相关检验，P＜0.0001；图3A）和使用外标的单通道实时PCR检测（R2=0.931；Spearman秩相关检验，P＜0.0001；图3B）的定量结果之间高度相关。继续扩增β-actin基因直到血浆样本的DNA浓度降低至0.1ng/mL；因而，两种实时PCR检测的灵敏度均为0.1ng/mL。在PicoGreen检测中，只有在血浆样本浓度高于1.0ng/mL时才观察到高度相关（R2＞0.90）（R2=0.961；Spearman秩相关检验，P＜0.0001；图3C）；因而，其灵敏度为1.0ng/mL。

2. 检测精密度和准确度

双重实时PCR、单通道实时PCR和PicoGreen方法检测不同DNA浓度血浆样本的批内和批间CV如表1所示。随着血浆样本的DNA浓度升高，三种方法的精密度也不断增加。然而，使用内标的双重实时PCR比其他两种方法的精密度更高，尤其是在检测DNA浓度较低（≤10ng/mL）的血浆样本时。

使用内标的双重实时PCR检测不同DNA浓度（10、100和1,000ng/mL）血浆样本的平均回收率（111.9%、109.3%和99.4%）均接近100%（P=0.066、0.165和0.896；t-检验），而使用外标的实时PCR（58.6%、80.3%和75.8%）或PicoGreen（62.6%、73.8%和77.2%）检测不同DNA浓度（10、100和1,000ng/mL）血浆样本的平均回收率均显著低于100%（P＜0.001；t-检验）。使用外标的实时PCR检测低DNA浓度（10ng/mL）血浆样本的平均回收率显著低于检测高DNA浓度（100和1,000ng/mL）血浆样本的平均回收率（P＜0.0001；t-检验）。

3. 检测稳定性

虽然外标实时PCR与PicoGreen方法检测使用三种不同方法提取的血浆DNA样本浓度结果存在显著差异（单向ANOVA，P=0.0041和＜0.0001），但我们的内标双重实时PCR法检测时差异无统计学意义（单向ANOVA，P=0.5821）。

4. 健康成人和创伤患者的血浆DNA浓度

使用三种不同的方法测定400位健康成人的血浆DNA。

图2. 评估使用内标的双重实时PCR检测的特异性。初步实验使用相应的引物和探针对血浆DNA、内标DNA进行实时PCR扩增以及两者的混合物进行并行PCR反应，以证实这种新型双重PCR检测的特异性（A）。使用相应的引物扩增靶β-actin基因和内标，分别获得91-bp和99-bp PCR产物（B）以及通过Taqman探针使JOE和FAM报告基团释放荧光信号并在ABI 7500 Sequence Detector的通道2和1中进行检测（C）。

图3. 评估三种不同血浆DNA定量检测的灵敏度。使用内标的新型双重实时PCR检测（A）、使用外标的单通道实时PCR检测（B）以及PicoGreen染料检测（C）对10倍连续稀释血浆样本DNA水平（X轴，常见的对数刻度）的定量结果（Y轴，常见的对数刻度）之间存在统计学显著相关性。

表1. 使用内标的双重实时PCR检测、使用外标的单通道实时PCR检测以及PicoGreen检测的试验内和试验间CV

图4. 使用三种方法对400位健康成人的血浆DNA进行定量分析。使用内标的双重实时PCR测定400位健康成人的中值血浆DNA浓度（18.1ng/mL）显著高于使用外标的实时PCR和PicoGreen方法的测定结果（8.2ng/mL和13.3ng/mL；Wilcoxon配对符号秩检验，P=0.0000）（A），这三种不同方法测定的血浆DNA水平之间存在显著统计学差异但相关性较弱（B-D）。

使用内标的双重实时PCR测定的中值血浆DNA浓度（18.1ng/mL）显著高于使用外标的实时PCR和PicoGreen方法的测定结果（8.2ng/mL和13.3ng/mL；Wilcoxon配对符号秩检验，P＜0.0001；图4A），这三种不同方法测定的血浆DNA水平之间存在显著统计学差异但相关性较弱（图4B-D）。

5,442位健康成人的血浆DNA水平分布如图5A所示。男性与女性的中位年龄差异没有统计学意义（Mann-Whitney两独立样本秩和检验，P=0.3589），但男性的中位血浆DNA浓度（20.3ng/mL）显著高于女性（16.1ng/mL）（Mann-Whitney两独立样本秩和检验，P＜0.0001；图5B）。血浆DNA水平与年龄之间不存在统计学显著相关性（Spearman秩相关检验，R2=0.003）。在95%置信区间内，血浆DNA水平的正常临界值上限分别是男性52.5ng/mL和女性45.8ng/mL。

如图5B所示，大多数创伤患者（96%）的血浆DNA浓度高于参考范围。中度（ISS＜16，n=53，中值浓度68.2ng/mL）、严重（（ISS 16-25，n=78，中值浓度109.2ng/mL）和非常严重（ISS＞25，n=69，中值浓度201.1ng/mL）损伤的创伤患者之间的中位血浆DNA浓度存在显著差异（Kruskal-Wallis检验，0.001）。创伤患者的血浆DNA浓度与其ISS数值呈正相关（Spearman秩相关检验，R2=0.916，P＜0.0001；图5C）。

讨  论

多种方法可以定量测定循环DNA水平，包括实时PCR、荧光分光光度法、紫外分光光度法、毛细管电泳、质谱、表面等离子体共振和电化学发光法。然而，由于DNA提取不可避免地导致DNA丢失，因而至今为止所有这些方法仅用于科

图5. 使用内标的双重实时PCR检测对5,443位健康成人和200位创伤患者的血浆DNA进行定量分析。（A）柱状图显示不同血浆DNA水平的人群正偏态分布。（B）不同性别的健康成人和创伤患者的血浆DNA箱形图显示健康女性和男性的血浆DNA浓度参考区间分别为0-45.8ng/mL和0-52.5ng/mL，且大多数创伤患者（96%）的血浆DNA浓度高于参考范围上限。（C）创伤患者的血浆DNA浓度与其ISS评分值呈正相关（Spearman秩相关检验，R2=0.916，P＜0.0001）。

学研究，尚未应用于临床实验室。内标有助于消除分析前误差，增加绝对定量的精密度。本研究设计了一种包含人β-actin基因相应序列的41-bp dsDNA人工重组质粒作为内标。使用常见的反向引物同时扩增这种内标和目的基因，以相近的扩增效率获得相似的片段长度。此外，针对两者扩增的Taqman探针分别采用不同的荧光素（FAM和JOE）进行标记，并在荧光定量PCR仪（ABI 7500 Sequence Detector）的不同通道对上述两种荧光信号分别进行检测。在定量过程中，可以在同一反应管中同时提取和扩增内标与目的人基因组DNA，以消除DNA提取和扩增期间产生的变异。

与使用外标的另外两种定量方法相比，这种新型双重PCR检测的灵敏度、重复性和准确度更高。PicoGreen方法通过直接荧光结合检测核酸，灵敏度低于实时PCR方法（通过指数式扩增检测核酸片段）。由于使用了相同的基本方法和DNA提取试剂盒，我们的双重实时PCR检测与使用外标的单通道实时PCR检测具有相同的灵敏度。在精密度方面，血浆样本DNA浓度的批间CV值增加并且在1-1,000ng/mL范围内（涵盖了健康成人和临床患者的血浆DNA水平）结果具有重复性。单通道实时PCR检测的精密度在高浓度（≥100ng/mL）低于PicoGreen检测，在低浓度（≤10ng/mL）高于PicoGreen检测。双重实时PCR检测在所有浓度的精密度均高于另外两种方法，很可能是由于内标消除了不同反应管之间的DNA提取效率差异。内标的这种作用也提高了我们新型检测方法的准确度。回收试验结果显示在低血浆DNA水平（≤1ng/mL）的偏移（bias）始终大于高血浆DNA水平（≥10ng/mL）。

DNA提取是影响循环DNA水平定量测定的重要因素。据报道，不同商用DNA提取试剂盒的提取效率存在显著差异。在本研究中，我们使用新型双重实时PCR检测，在每例血浆样本中加入已知数量的重组质粒DNA作为内标，在同一反应管中同时提取和扩增目的人基因组DNA与内标。无论采用何种DNA提取方案，都可以获得恒定的血浆DNA定量结果。因此，这种方法比使用传统的外标定量方法更有优势。

有趣的是，测定400位健康成人的血浆DNA水平时，其他两种DNA定量方法的测定结果低于双重实时PCR检测，这可能是由于在样本提取过程中血浆DNA丢失。这个因素被其他研究忽略了，但我们考虑到了。我们和其他研究都证实了不同试剂盒的提取效率存在差异，这可能是血浆DNA定量的主要差异来源之一。

循环DNA有可能成为有用的疾病生物标志物，且大量研究表明患者的血浆或血清DNA升高。然而，还没有通过大规模研究建立循环DNA浓度的参考区间，只有包括不到100位健康个体的少数报告。在本课题组大量样本研究中，我们使用包含内标的双重实时PCR定量测定了5442位健康志愿者的血浆DNA水平，并首次发现了男女之间存在细微但具有统计学意义的差异，这可能是由于不同性别之间的代谢率不同；因此，未来研究应认真考虑这种差异。根据我们的研究结果计算的血浆DNA参考区间稍微高于使用外标的单通道实时PCR和PicoGreen检测的其他报告，这些报告简单地忽略了DNA提取期间的核酸丢失。以前的研究证明严重损伤的患者的血浆DNA浓度显著高于损伤不太严重的患者。本研究进一步表明血浆DNA浓度，在损伤早期显著升高，与多发损伤患者的总体ISS评分密切相关。虽然细胞凋亡和坏死是血浆循环DNA的主要来源，但损伤期间的组织损坏和细胞死亡也会导致血浆DNA水平剧增，这应与损伤严重程度相关。使用新建立的内标检测法能够比传统方法更精确地定量测定血浆DNA，且显示ISS评分值与血浆DNA水平呈正相关（R2=0.916），相关性高于以前的研究报道（R2=0.572）。然而，血浆DNA定量在临床实验室的应用需要更详细和可靠的检测。

总而言之，我们新开发的血浆DNA定量方法，能够消除血浆样本处理期间发生的系统误差，表现出稳定的分析性能和可接受的精密度和准确度。因此，这种方法在血浆DNA定量的多中心研究以及临床用于诊断和监测某些疾病上具有非常广阔的前景。