宏基因组学技术助力病原体精准诊断
感染性疾病是指由致病微生物（包含朊病毒、病毒、衣原体、支原体、立克次体、细菌、螺旋体、真菌、寄生虫等）通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的一类疾病的统称。感染性疾病是重大的卫生经济学问题，国家卫生健康委员会主编的《2018年中国卫生健康统计年鉴》显示，2017年全国综合医院的门急诊人次约为33.6亿，住院人数2.44亿，有近1/3是感染性疾病，是发病率最高的病种之一。另外，据盖茨基金会成立的Institute for Health Metrics and Evaluation（IHME）发布的报告指出，2016年全球疾病造成的健康负担排名中，与感染相关的疾病占比17.99%，包括感染性腹泻、艾滋病、结核病，疟疾与热带传染病等，其总和超过了排名首位的心血管疾病。
除了发病率高，影响严重之外，感染性疾病的诊疗过程中伴随着大量经验性抗菌类药物的使用，迅速引发了全球范围的抗生素耐药和“超级细菌”的诞生。全国细菌耐药监测网（CARSS）发布的《2017年全国细菌耐药监测报告》显示，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率分别达到了1.5%、9.0%、20.7%和56.1%。这组数据意味着一些曾经可以轻松治愈的普通感染，或将导致患病时间延长并增加其死亡风险。抗生素的滥用也加速了多重耐药细菌（俗称“超级细菌”）的产生，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐多药肺炎链球菌（MDRSP）、万古霉素肠球菌（VRE）、多重耐药性结核杆菌（MDR-TB）、多重耐药鲍曼不动杆菌（MRAB）等等。由于耐药菌引起的感染，常规抗生素无法治疗，最终导致患者死亡。上世纪60年代,全球每年死于感染性疾病的人数约为700万，而这一数据到了本世纪初上升至2000万，其中死于脓毒症的人数上升了89%。
病原学快速诊断、溯源和用药选择是遏制感染性疾病传播和细菌耐药发展的关键。临床对微生物的鉴定方法分为培养和非培养两类，公认的金标准方法是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。以结核分枝杆菌为例，它是引起结核病的病原菌，每年在全球造成1000万开放性患者。由于细胞壁中富含脂质，影响营养物质的吸收，结核分枝杆菌的生长缓慢，通常需要4-6周才能确诊。相比之下，不依赖培养的镜检、抗体抗原免疫等方法，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强，但在准确性上存在明显劣势。比如镜检是通过形态学、染色性等生化性质鉴定微生物，只能粗筛，无法细分。免疫类方法则是借助荧光、酶联免疫ELISA、化学发光等方法鉴定微生物，敏感性和特异性较差。近年来，基于核酸检测的分子诊断技术发展迅速。核酸是携带和传递生物体遗传信息的大分子，几乎所有的病原体都含有核酸（DNA或RNA），而且核酸序列具有显著的物种特异性。因此，对感染患者样本中的核酸进行检测可以准确反映病原微生物的种类和含量。1985年，Mullis等人发明了聚合酶链式反应（PCR），它使得微量核酸可以在短时间内被指数级扩增[1]。因为敏感性高、特异性好的优点，基于PCR的核酸检测被广泛应用在病原体诊断领域。通过对靶标微生物核酸进行提取、富集和检测，可以一次鉴定一种或十几种病原体，非常适合用于常见病原体的筛查。以社区获得性肺炎（Community Acquired Pneumonia，CAP）为例，数十种细菌和病毒可以解释绝大部分临床病例[2]。
在急危重症感染患者中，由于遗传性疾病、肿瘤、营养不良、器官移植、药物等多种因素引起免疫缺陷，比普通人更容易受到机会性感染（opportunistic infection）。条件致病菌在环境和人体中常见，比如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），在免疫功能正常的人群中不致病，但在宿主免疫功能缺陷时入侵宿主细胞。这类患者往往起病急、进展快、病原体复杂，常规检测方法无法全部覆盖。相比之下，宏基因组测序（metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）直接对样本中的核酸进行“鸟枪法（shotgun）”大规模平行测序，得到的序列信息与已知微生物数据库比对分析，判断样本中微生物的种类和含量。理论上，mNGS可以报告所有已知基因组序列的病原体，为危重和疑难感染患者的临床诊断提供了行之有效的技术手段。自2014年在新英格兰医学杂志上首次报道一例用二代测序技术诊断钩端螺旋体感染的病例以来，mNGS在临床上的诊断价值已迅速被认可[3]。Blauwkamp等人2019年的一项研究显示，在350名败血症患者中，mNGS的检测结果与金标准“血培养”相比，一致性达到了93.7%。在166份样本中，传统检测方法（培养、血清免疫学、PCR）均显示阴性结果，但mNGS在其中的62份样本中发现了病原微生物，显示了mNGS在检出率和准确性上的巨大优势[4]。Parize等人发现mNGS对免疫抑制宿主感染的病原体诊断具有重要的参考价值，在病毒和细菌诊断上mNGS 阳性率高于传统方法3倍以上，同时具有更高的阴性预测值[5]。
由于mNGS检测准确与全面的优点，相关的技术标准和临床应用指南被陆续发表：2016年美国FDA发布了基于高通量测序的传染病诊断设备的指南草案；2017年美国微生物学会专业实践委员会和实验室规范委员会及美国病理学家协会微生物资源委员会发布了《通用病原体检测的宏基因组高通量测序试剂盒确认》，标志着测序技术在国外也已开始进入病原体检测的临床应用。在中国，2017年9月，《中华传染病杂志》发表《中国利什曼原虫感染诊断和治疗专家共识》，指出高通量测序技术应用于临床的可能性。2018年4月，《中华结核和呼吸杂志》发表了《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》，高通量测序技术首次被写入呼吸相关指南。2018年9月，《临床肝胆病杂志》发表《终末期肝病合并感染诊治专家共识》，肯定了高通量测序在病原学诊断方面的重要作用。2018年9月，《中国实用儿科杂志》发表《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（病毒篇）》和《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（细菌篇）》，指出高通量测序在未知病原体的发现上有着显著优势。2019年2月，首篇宏基因组高通量测序临床应用的专家共识《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》发表在《中华急诊医学杂志》上。标志着以病原高通量测序技术为代表的微生物检测技术已经深入临床，有着广阔的临床应用前景。
在病原学诊断之外，基因组学技术，尤其是高通量测序为细菌耐药性的检测和监测提供了新机遇。抗生素耐药性是由于基因、移动DNA元件及其细菌宿主之间复杂的相互作用，以及为控制细菌生长所施加的强烈选择压力而产生的[6]。目前已有许多与抗生素耐药性相关的基因数据库，比如Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）[7]，整合了4000多个抗性基因，涉及了外排泵、失活酶、阻遏物、底物丢失等多种耐药机制。因此，通过高通量测序获得样本中微生物的核酸序列与CARD数据库进行比对，可以获取样本中耐药基因的种类、拷贝数和溯源信息。基于培养后菌株的全基因组测序（Whole-genome Sequencing，WGS）被广泛用于病原体溯源和特定菌株的耐药性监测，但培养的耗时较长。相比之下，宏基因组mNGS不依赖于病原体培养，可以在24小时内获得结果。但因为样本中人源核酸的比例很高，需要更高的测序深度才能确保不遗漏样本中潜在的耐药基因，成本相对较高。宏基因组测序数据虽然不能直接预测耐药性，基因表达、耐药基因的宿主菌类型都会影响预测结果，但利用株系特异性的耐药基因数据库将有助于预测该株系的耐药表型。因此，虽然从基因型预测表型仍然存在一定的挑战性，但避免全球耐药性危机的需求迫在眉睫，必须用快速而全面的诊断技术来取代传统的药敏检测方法。
◆ mNGS临床应用需解决的问题
任何一项技术都存在利弊，mNGS也不例外。在开展病原微生物宏基因组检测之前，从业者需要认真思考以下几个问题并提出切实可行的解决方案：
1）时效性：mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理，操作步骤包括但不限于：核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控、pooling等。再加上测序反应和数据分析，整体流程复杂、耗时长，自动化程度低。核酸在扩增后有可能产生气溶胶污染，而大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤，因此实验室在防止污染和质量控制上需要建立一系列标准化SOP。由于技术本身的复杂性，目前mNGS多以送检为主，样本周转时间（TAT）一般为72小时。而对危重感染患者而言，时间就是生命。如何进一步缩短TAT，尽快汇报结果，是亟需解决的问题之一。
2）准确性：mNGS可以覆盖10000种以上病原体，灵敏度很高。实际检测中，这是一把双刃剑，因为临床取样、运输、样本处理、上机测序等各个环节中都有可能受到环境、容器和试剂中的微生物核酸污染。另一方面，人体含有定植性微生物（不同个体、不同样本类型，定植微生物的种类和丰度有较大差异）。这些因素都会导致结果中混有非致病性微生物。因此，如何能结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原体，是必须攻克的难题。
3）检测DNA or DNA+RNA：众所周知，一些病毒的基因组为RNA，用DNA建库的方法不能检出。此外，RNA与DNA的测序结果可以互为确认和补充。同时，RNA丰度与基因转录活跃程度正相关，检测RNA可以识别死菌和活菌，区分既往和现行感染。因此，DNA+RNA测序与单纯的DNA测序相比具有多重优势，尤其在儿童感染中有较大需求。但人源RNA比DNA有更高的丰度和复杂度，且RNA易降解，对样本运输和保存有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检测，是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。
◆ 小 结
mNGS是一项潜力巨大的检测技术，随着测序平台、实验操作、数据分析流程的完善和临床研究的深入，mNGS必定会为急危重症和疑难感染患者提供精准的病原体诊断依据，辅助临床医师在第一时间了解病因，制定治疗方案，挽救患者生命。
参考文献
Mullis, K., et al., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986. 51 Pt 1: p. 263-73.
Leber, A.L., et al., Multicenter Evaluation of BioFire FilmArray Respiratory Panel 2 for Detection of Viruses and Bacteria in Nasopharyngeal Swab Samples. J Clin Microbiol, 2018. 56(6).
Wilson, M.R., et al., Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med, 2014. 370(25): p. 2408-17.
Blauwkamp, T.A., et al., Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol, 2019. 4(4): p. 663-674.
Parize, P., et al., Untargeted next-generation sequencing-based first-line diagnosis of infection in immunocompromised adults: a multicentre, blinded, prospective study. Clin Microbiol Infect, 2017. 23(8): p. 574 e1-574 e6.
Gillings, M.R., I.T. Paulsen, and S.G. Tetu, Genomics and the evolution of antibiotic resistance. Ann N Y Acad Sci, 2017. 1388(1): p. 92-107.
Jia, B., et al., CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D566-D573.
