《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》要点及解读

2014年新英格兰医学杂志报道了一个通过宏基因组辅助检测治愈了一位原因不明、反复发热、具有癫痫及脑积水症状的14岁男孩的案例后，mNGS正式应用于微生物诊断拉开了帷幕。国际与国内在方法学提升与临床应用评估方面进展迅速，推动了mNGS的临床转化，并写入多项临床指南及专家共识。本期杂志刊登了《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》，其对宏基因组在急危重感染患者中应用场景、研究进展、基本流程和质量控制、报告解读、局限性及发展方向做出详细概述。本文以图文形式勾画了专家共识的要点，并就其中若干要点进行了解读。

一、感染疾病的现状

感染的发病率和死亡率仍居高不下，感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，脓毒症（严重感染）患者病死率高达50%[1]，各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁。因此，临床上对病原体的诊断提出了更高的要求。

二、mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向

感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病，而传统微生物诊断的方法是体液培养检测和药敏试验，但阳性率仅10%左右；PCR检测在敏感性、特异性和检测时效上明显优于培养法，但因为该法基于已知病原菌的基因组序列，所能提供的信息有限，依然不能解决临床诊断阳性率低的问题，基于宏基因组新一代测序技术（metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），且无需特异性扩增[2]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。

三、mNGS研究进展

mNGS诊断感染性疾病的敏感性和特异性高于传统检测方法，国外多篇文献探讨了该技术在在脓毒症、中枢神经系统和呼吸系统感染方面的应用。

文献一，感染性疾病游离DNA测序试验的分析与临床验证的文章在《Nature Microbiology》发表。该研究[3]检测了350例脓毒性休克患者，评估了mNGS在血流感染方面的临床应用效能。

文献二，病原宏基因组学脑炎/脑膜炎临床应用多中心研究的文章在《The New England Journal of Medicine》发表。该文章[4]通过一项临床多中心研究，纳入8家医院共204例患者，评估了mNGS在中枢神经系统感染方面的临床应用效能。

文献三，结合宿主反应和无偏微生物检测诊断成人重症下呼吸道感染的文章在《PNAS》上发表。该文章[5]用mNGS检测了92例下呼吸道感染、急性呼吸衰竭成人的气管抽吸液样本，检出率大大超过传统方法。

四、mNGS检测范围及适应症

新一代测序技术是一个开放的分析和诊断系统，目前已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。

根据目前的临床经验、研究结果和mNGS技术的优势，推荐mNGS在急危重症感染患者中应用的主要适应症：

1）病情危重需要尽快明确病原体；

2）特殊病人如免疫抑制宿主，合并基础疾病，反复住院的重症感染患者需要尽快明确病原体；

3）传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳；

4）疑似新发病原体，临床上提示可能有一定的传染性；

5）疑似特殊病原体感染；

6）长期发热和/或伴有其他临床症状，病因不明的感染。

五、mNGS检测的基本流程和质量控制

mNGS检测的基本流程包含实验流程（包含样本采集、样本处理、核酸提取、文库制备及上机测序），生物信息分析与报告解读。

 实验室质量控制—每次mNGS实验都应包括内参、阴性和阳性对照。内参可以帮助识别分析失败或异常的样本，达到质控作用。阴性对照对于识别样本间交叉污染以及试剂污染至关重要[6]。需要注意的是，阴性对照需要模拟与患者样本相同的基质，通常具有低背景，且能最大化的检测到实验过程的污染物。

测序数据质量控制—在对测序结果进行具体的生物信息学分析之前，要先对下机数据进行质量评估，以保证测序结果的可用性。同时，由于病原样本中大多核酸来自人源背景本身，测序有效数据中一般90%以上为人源序列，故测序数据量也要作为质控标准。 

六、mNGS在急危重症感染性疾病应用中存在的局限性及发展方向

与传统病原微生物检测相比，mNGS敏感性高，信息量大，但也存在一定的局限性。

1. 污染和致病菌的判定基于测序结果判断污染菌或致病菌缺乏公认的判读标准。

2. 胞内菌/真菌检出率低对于胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低，比如结核分枝杆菌、军团菌、布鲁菌等，以及对具有较厚细胞壁的病原微生物如真菌感染，其核酸提取效率较低，导致临床检出率和敏感性较低。

3. RNA病原体的检测由于人体RNA转录本身具有比基因组更高的丰度和复杂度，另外RNA容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难，尚需要不断优化RNA病毒的送检流程。

4. 耐药检测目前使用mNGS进行药敏检测还存在一定的困难，一是目前报道的耐药基因型与耐药表型的关联程度还存在一些差距；二是目前细菌、真菌的覆盖度仍较低，不能有效覆盖耐药基因的检测。

mNGS在急危重症感染性疾病应用中尚面临诸多挑战，未来发展将会集中在如下几大层面：

1. 优化实验流程，提高胞内菌/真菌检出率；

2. 生信分析流程标准化；

3. 探索二代测序定量分析的价值；

4. 检测耐药基因及毒力因子；

mNGS的快速、无偏的特性较好地弥补了传统病原微生物检测方法的不足，与传统方法联合使用可以提高病原体诊断的敏感性和特异性，但目前在应用方面还存在一些需要改进的地方，不能完全取代常规的检测技术，未来随着测序技术的发展，mNGS技术在临床应用逐渐普及，会进一步助力精准医学的进步。 

参考文献

Rhodes A, Evans LE, Alhazzani W, et al. Surviving Sepsis Campaign: International Guidelines for Management of Sepsis and Septic Shock: 2016 [J]. Intensive Care Med, 2017, 43(3): 304-377DOI: 10.1007/s00134-017-4683-6.

Goldberg B, Sichtig H, Geyer C, et al. Making the leap from research laboratory to clinic: challenges and opportunities for next-generation sequencing in infectious disease diagnostics [J]. Mbio, 2015,6(6): e01888-15.DOI: 10.1128/mBio.01888-15.

Blauwkamp TA1, Thair S2, Rosen MJ3, et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease [J].Nat Microbiol. 2019 Apr; 4(4): 663-674. doi: 10.1038/s41564-018-0349-6.

Wilson M, Sample H, Zorn K, et al. Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis[J]. N Engl J Med. 2019 Jun 13; 380(24): 2327-2340. 

Charles Langelier，Katrina L Kalantar，Farzad Moazed,et al. Integrating host response and unbiased microbe detection for lower respiratory tract infection diagnosis in critically ill adults[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Dec 26; 115(52): E12353-E12362.

Lusk RW. Diverse and widespread contamination evident in the unmapped depths of high throughput sequencing data [J]. PLoS One, 2014, 9(10): e110808.