急性戊型肝炎快速诊断试验的评估

一、背景

戊型肝炎（HEV）是卫生状况恶劣的国家爆发水型肝炎，以及地方流行和工业国家出现散发性急性病毒肝炎病例的主要原因。在过去的十年中，西欧地区的本土案例数量不断增加，表明戊型肝炎是发达国家的新兴疾病。在意大利，大多数急性感染病例是从地方流行区域引入的并且由基因型1引起，同时也有基因型3引起的本土案例的报告。

在西方国家，HEV诊断仍存在困难。通常，血清样品会被送到anti-HEV IgM检测和HEV RNA试验参考中心。这整个过程延迟了诊断反应，用途有限，尤其是对于可能受益于早期病毒唑治疗的慢性肝病患者。此外，在某些情况下，难以获得恰当的诊断，因为anti-HEV IgM阳性可能不被不同的商业试验证实，而且HEV RNA试验的灵敏度在不同的实验室之间具有差异。

在过去的几年中，若干用于快速诊断流感、HIV和HCV感染的床旁（POC）检测已被应用。近期，检测anti-HEV IgM的快速试验也被开发出来。HEV快速试验似乎有用，尤其是作为初级保健机构的一线试验，这些机构一般不做HEV诊断。快速试验在不到1小时内给出结果，加速了诊断确认的整个过程。通过这种方式，患者能够尽快获得治疗效果。然而，快速试验仍需要对照目前市售戊型肝炎诊断试剂盒进行分析确认。另外，HEV快速试验基于基因型1和2抗原，应该评估其对于所有HEV基因型的普遍用途。因而，需要这些试验在不同地理区域的性能信息，尤其是在发生基因型1和3混合传播的非地方流行区域。

二、目的

本文的目的在于评估两个快速试验检测anti-HEV IgM抗体的性能，采用在意大利从急性病毒性非A-C肝炎住院患者获得的59份血清，比较快速试验与三种商用anti-HEV IgM试验及一种实时PCR试验的结果。

三、研究设计

3.1 患者样品

在2004年至2013年期间，从意大利20个区其中12个区的24家传染病单位的59位临床疑似急性病毒性非A-C肝炎住院患者收集血清样品。这些血清样品被送到意大利国立卫生研究院的病毒性肝炎单位进行HEV感染诊断。急性病毒性非A-C肝炎的诊断基于血清学和病毒学试验。来自于确诊急性甲肝（n=20）、急性乙肝（n=20）的患者和从可用收集中选定的捐献者的血清，用于检测anti-HEV IgM快速试验的特异性。根据2001年意大利法令第70条第2项，所有生物材料和临床数据均从标准病毒性诊断获得。用一个匿名数据库分析数据。

3.2 anti-HEV ELISA试验和实时PCR试验

用Bioelisa HEV IgM和Bioelisa HEV IgG（Biokit），HEV IgM Elisa 3.0（MP diagnostics），HEV IgM Elisa（WantaiBiopharm），和内部实时PCR试验检测所有血清是否存在HEV基因组RNA（灵敏度范围100–250 copies/mL）。根据指示，用anti-EBV VCA IgM ELISA（Bio-Rad Medical Diagnostics）和Bioelisa CMV IgM（Biokit）检测选定的血清（n=34）。

3.3 anti-HEV快速试验

用两个商业试剂盒Assure HEVIgM Rapid test（MP diagnostics）和HEV IgM Rapid test（WantaiBiopharm）检测所有样品。所有试验均按照厂商说明操作。如果内部对照线和测试带都被染色，则认为结果为阳性；如果只有内部对照线可见，则结果为阴性；如果对照线不可见，则结果无效。

3.4 统计学分析

用Clopper-Pearson方法计算精确的置信区间（CIs）。

四、结果

4.1 anti-HEV IgM快速试验的灵敏度和特异性

用一种实时PCR试验分析来自非A-C肝炎病例的59份血清样品，检测HEV RNA。25份样品显示HEV RNA阳性结果，并用于Wantai和 Assure快速试验评估anti-HEV IgM抗体的存在。另外，用三个anti-HEV IgM ELISA试验和一个anti-HEV IgG试验分析25份HEV RNA阳性样品。

Wantai和Assure快速试验分别检测到25份样品中有24份和23份存在anti-HEV IgM抗体（表1）。两份样品显示明显不同的血清学模式。在一份样品中，Wantai快速试验检测到IgM抗体并且经过另外2个IgM商业试验确认。这份样品也显示IgG抗体阳性（表1，见患者33）。在另一份样品中，所有试验都未检测到IgM和IgG抗体（表1，见患者63）。

用25份HEV RNA阳性样品和50份HEV RNA阴性样品评估Wantai和 Assure快速试验的灵敏度和特异性。这些样品包括20份来自甲型肝炎病毒（HAV）急性感染患者的血清，20份来自乙型肝炎病毒（HBV）急性感染患者的血清，和10份来自献血者的血清。

整体来说，Wantai和Assure快速试验的灵敏度分别是96.1%（95%CI=79.6–99.9%）和92.6%（95%CI=74–99%）。两个快速试验的灵敏度没有显著差异（p>0.05）。Wantai和Assure快速试验的特异性都是100%（95% CI=92.9–100%）。

Wantai和Assure快速试验的阳性预测值（PPV）都是100%（95%CI =85.8–100%和85.2–100%）。阴性预测值（NPV）分别是98.04%（95%CI=89.6–100%）和96.1%（95% CI=86.8–99.5%）。

13份HEV RNA阳性样品的基因分型显示11位患者感染了基因型1a，2位患者感染了基因型3。两个快速试验都检测到所有13份样品均含有anti-HEV抗体（表1）。

整体来说，Bioelisa HEV IgM（Biokit），HEV IgMElisa 3.0（MP diagnostics）和HEV IgM Elisa（Wantai Biopharm）试验的灵敏度分别是92.0%（95% CI=74–99%），96.0%（95% CI=79.6–99.9%）和96.0%（95% CI=79.6–99.9%）。这3个试验的灵敏度没有显著差异（p>0.05）。Bioelisa HEV IgG（Biokit）检测出96.0%（95% CI=79.6–99.9%）的HEV RNA阳性急性病例存在anti- HEV IgG抗体。

4.2 快速试验对于显示试验间差异的样品的性能

在59份来自非A-C肝炎病例的血清样品中，34份样品是HEV RNA阴性。用Wantai和Assure快速试验，三个anti-HEV IgM Elisa试验和一个anti-HEV IgG试验分析这些样品是否存在anti-HEV抗体。结果显示25份样品经所有试验检测均为IgM和IgG抗体阴性，9份样品显示不一致结果（表2）。尤其是，3份样品经HEV IgM Elisa 3.0（MP diagnostics）检测显示IgM抗体阳性，4份样品经Bioelisa HEV IgM（Biokit）检测显示IgM抗体阳性。这些数据没有经过另一个anti-HEV IgM试验证实，表明很可能是假阳性结果（表2，患者76、77、41、20、30、50和67）。这一假设在两例样品中得到证实，一份是anti-EBV IgM阳性，另一份是anti-CMV IgM阳性（表2，患者76和30）。最后，有一份样品仅显示IgG抗体，表明既往感染（表2，患者32）。快速试验分析显示8例样品为阴性结果，进一步支持了前7份样品假阳性IgM结果的假设，以及1份样品既往感染（表2）。两个快速试验都检测到1份样品存在anti-HEV IgM抗体。三个anti-HEV IgM ELISA试验及anti-EBV IgM和anti-CMV IgM试验对这份血清的分析结果是阴性（表2，患者74）。

4.3 快速试验与anti-HEV IgM ELISA试验和实时PCR试验的一致率

实验还评估了快速试验与其他IgM试验和实时试验的一致率。Wantai快速试验显示与Bioelisa HEV IgM（Biokit），HEV IgM ELISA 3.0（MP diagnostics）和HEV IgM Elisa（Wantai Biopharm）试验的一致率分别是53/59，89.8%，55/59，93.2% 58/59，98.3%（κ统计值分别为0.79，0.86和0.96）。Assure快速试验显示与Bioelisa HEV IgM（Biokit），HEV IgM ELISA 3.0（MP diagnostics）和HEV IgM Elisa（Wantai Biopharm）试验的一致率分别是54/59，91.5%，54/59，91.5%和57/59，96.6%（κ统计值分别为0.82，0.82和0.93）。这两个快速试验之间的一致率是98.3%（58/59）（κ统计值0.96）。Wantai Biopharm HEV IgM快速试验和Assure快速试验与实时PCR试验的一致率分别是57/59，96.6%和56/59，94.9%（κ统计值分别为0.93和0.89）。

五、讨论

本文评估了HEV快速试验对在意大利收集的急性非A-C肝炎散发病例的灵敏度和特异性。对照用于诊断戊型肝炎的RNA实时RT-PCR试验和目前市售IgM试验，确认了快速试验的性能。

实时PCR对42.4%的患者做出急性HEV感染诊断。快速试验对HEV急性病例的分析显示灵敏度水平非常好，而且与实时PCR试验具有极好的一致性。尤其是，Wantai试验成功鉴别了24个急性病例，只有一例没有检测出抗体（患者），而Assure快速试验鉴别了23例急性患者，有2例显示阴性结果（患者63和33）。

在一例患者中（患者63），两个快速试验都没有检测出IgM抗体。经过多个IgM试验和一个IgG试验证实这位患者既没有IgM抗体也没有IgG抗体。很可能这位患者出于急性期的窗口期，在这个时期anti-HEV抗体尚且检测不到并且基因组试验对于急性感染的鉴别必不可少。

在另一例患者中（患者33），Assure快速试验的假阴性结果假设可能与抗体水平有关。为证明这一观点，一个anti-HEV IgM ELISA试验也显示该样品为阴性结果。然而，用两个另外的商业试验进行附加测试发现IgM抗体，虽然报告的光密度（OD）值接近两个试验的阈值限。

Assure快速试验在基因型1流传的地方流行区域具有卓越的灵敏度（93%），对感染了基因型3的患者样品也有很好的灵敏度（82%）。根据这些数据，我们报告这个试验的灵敏度是92.6%，代表了期望值，因为这项筛查是对意大利住院患者做的，其中大部分病例（约70%）是引入的并且由基因型1导致，某些本土病例由基因型3导致。

HEV IgM快速试验（Wantai Biopharm）利用了一种重组衣壳抗原（E2），表达于HEV基因组开放阅读框2（ORF2）的高度保守区域。似乎是这种抗原使这个快速试验获得了高灵敏度，其灵敏度可与ELISA试验相比较甚至在某些情况下高于ELISA试验。可以想象到两个快速试验对在意大利流传的HEV基因型引起的感染具有较好的灵敏度。我们评估了13位患者的病毒基因型：6位是意大利人，7位是近期去过自己出生地的外地人（主要是孟加拉国和印度，地方流行基因型1a）。按照报告的风险因素，所有外地患者都感染了基因型1a。在6位意大利患者中，2位表示没有去过地方流行区域但被基因型3感染。另外4位报告去过地方流行区域且被基因型1a感染。

虽然获得的HEV急性感染数量有限，但是我们的数据表明Wantai和 Assure快速试验与标准的酶免疫分析法比如Wantai ELISA（分别是96.6和 98.3%）和实时PCR试验（分别是94.9%和96.6%）具有极好的一致性。此外，似乎这些试验也可以检测基因型3抗体，据报道这一基因型是发达国家流传的新现病毒。重要的是，需要用非地方流行区域的大量HEV急性样品来确认这些试验，以证实诊断准确度。但是，这些菌株的数量有限。

IgM测试假阳性结果的问题是HEV诊断的关键点。在我们的研究中，7位患者在首次分析时经ELISA试验检测显示IgM抗体是单一血清学标志物。4位患者使用Biokit试验，3位患者使用MP诊断试验。这些结果没有经过其他4个IgM试验（2个ELISA试验和2个快速试验）证实。在此基础上，我们确定这些样品“假阳性”。在2例血清中（患者76和30），anti-EBV和anti-CMV抗体检测证实了这个假设。对于剩余的样品，IgM阳性很可能是非特异性反应的结果。的确，以前有研究报道Biokit试验使56%的EBV急性感染和11%的CMV急性感染获得假阳性结果。另外，特异性样品组（98例HEV阴性样品）测试表明MP诊断试验可能使16%的样品产生假阳性结果，Wantai试验没有检测到假阳性样品。

虽然我们的数据表明anti-HEV快速试验具有非常好的准确度，但是在临床上应用仍需要完成重要步骤。第一，对照适当的金标方法（传统认可的，应该是非常灵敏的IgM试验或实时PCR试验），用大量HEV样品对这些试验进行分析确认。第二，应该用特征明确的样品和样品组，评估对多个基因型的灵敏度。第三，像其他传染病一样，在实验室以外的适当机构分析临床有效性和临床效用。这一点特别重要，因为据报告如果不对非实验室人员进行定期培训和能力验证，在临床上应用流感快速试验出现了判断和性能误差。

总之，我们的数据表明anti-HEV IgM快速试验作为初级保健机构的一线试验具有潜在价值，特别是对于慢性肝病或急需抗病毒治疗的孕妇具有帮助。

（摘自Viruses，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：王小茜