数字PCR技术在肿瘤标志物检测中的临床应用价值
作者：陈芊如 祝令香 连灏 梁素娴 班贵宏 杨文军 刘毅 郭永
单位：清华大学生物医学工程系、解放军总医院第五医学中心（原307医院）全军肿瘤中心
一、数字PCR检测技术优势
1. 数字PCR的起源和原理
数字PCR是一种核酸定量检测技术，此技术起源于20世纪末期，通过对模板的有限稀释和PCR反应体系的分配实现模板拷贝数的绝对定量分析[1]。最初的有限稀释是利用384孔板来实现的，后来逐渐发展成为成百上千个微孔，继而是上万个“油包水”的乳液状微滴[2]，实现了基于微液滴的数字PCR，即微液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[3]。
数字PCR的工作流程主要包括以下6个步骤（图1）：（1）将PCR反应体系分配到多个独立的反应单元中；（2）模板在分配过程中进入反应单元；（3）对反应单元中的PCR反应体系进行PCR扩增；（4）在完成PCR扩增后，读取各个反应单元整体的荧光强度分布；（5）对荧光强度波形进行信号处理，获得每个反应单元的荧光强度；（6）根据每个反应单元的荧光强度，界定这些反应单元的阴阳性，并计算阴阳性反应单元的数量。通过统计学模型的分析，即可得到模板拷贝数的绝对数值。
图1. 数字PCR技术的流程（以ddPCR为例）
实现模板拷贝数绝对定量的统计学原理和计算方法就是泊松分布。以ddPCR为例，设PCR反应体系中含有K个拷贝的模板，总共被分割为N个尺寸均一的微液滴，N'为被检测的微液滴的数量，M'为其中被界定为阳性微液滴的数量，根据泊松分布模型进行推导，可以得到初始模板拷贝数的计算方法，如式（1）。
2. 数字PCR的优势和应用领域
数字PCR被称为第三代PCR技术，相比于传统的PCR技术和荧光定量PCR技术，其具有诸多优势：（1）绝对定量，不依赖标准品和参考曲线，定量结果更加准确可靠；（2）高灵敏度，可实现单分子级检测；（3）高分辨率，适合在大量背景模板的干扰下对罕见的目标分子进行检测；（4）高稳定性，对抑制剂的耐受程度大大增强。凭借这些优势，数字PCR被广泛应用于多个不同的领域[4]，特别是生物医学领域，包括稀有突变检测、基因拷贝数变异检测、基因表达研究、甲基化水平检测、肿瘤液体活检、无创产前检测、微生物（病毒、细菌等）检测、移植排斥监控和二代测序辅助建库等。此外，此技术也被用于农业、食品安全和环境科学等诸多领域。本文将重点介绍数字PCR在肿瘤中的应用。
3. 数字PCR技术平台
随着数字PCR市场需求的增长，国内外相继推出数字PCR商业化平台，具有代表性的欧美数字PCR系统包括QX200™ Droplet Digital PCR系统（Bio-Rad）、QuantStudio™ 3D Digital PCR 系统（Thermofisher）和Naica™ Crystal Digital PCR系统（Stilla Technologies）。目前国内的企业也积极开发国产数字PCR系统，通过技术创新提高系统性能，同时利用国内的产业制造优势降低成本，如新羿生物开发的TD-1微液滴数字PCR系统[5]。表1为各个数字PCR系统的反应体系体积、运行通量、单样品反应单元数、运行时间和多重能力的比较。
二、数字PCR在肿瘤诊断中的应用
数字PCR具有高敏感度、绝对定量、高特异性、使用标本用量少等特点，可以为临床提供更客观、自动化程度更高的定量检测结果，而且较好的克服了肿瘤组织包埋标本DNA质量差、标本量有限等问题，目前已经被应用于多个研究领域，有望成为恶性肿瘤的诊断和监测的可靠工具。
1. 肺癌的EGFR突变检测
EGFR突变目前已成为非小细胞肺癌（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）患者常规的伴随诊断，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的使用具有重要的指导作用。然而，由于多数NSCLC都处于晚期，很难取到足够的肿瘤组织完成该检测，不方便对患者的疗效和耐药情况进行动态监测。相反，血液、胸水以及脑脊液之类的体液标本中会含有肿瘤来源的DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），它们更容易获取，被认为是组织标本的有效替代品。由于体液标本中ctDNA的含量非常低，因此对检测方法提出了很高的要求。近年来，有研究者证实，数字PCR的检测敏感性可以低至0.04%，EGFR突变的血浆检测与组织学检测能够有很好的吻合性，相比于传统的检测方法，数字PCR可以显著提高血浆中EGFR突变的检出率[6]。此外，利用数字PCR绝对定量的优势，可以对血浆中EGFR突变的丰度进行动态监测，这种动态变化与患者使用TKI的疗效密切相关，可以更好的指导患者的治疗[7]。随着越来越多循证医学证据的出现，NSCLC的血液EGFR突变检测正在成为ddPCR最具前景的应用方向。
2. 肺癌的ALK融合基因检测
ALK融合基因是NSCLC患者另外一个常规的伴随诊断，可以指导ALK-TKI药物的使用，目前已发现20种以上EML4-ALK的融合形式，多个报道证实它们中大部分能促进肿瘤生成。另外ALK还可能与TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因发生融合，因此ALK融合突变的诊断具有一定难度。目前临床常规使用的检测手段包括免疫组化（Immunohistochemistry，IHC），荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）以及RT-PCR等三种。这三种方法各具优缺点：IHC相对简单，价格低廉，但是容易受到主观判断的影响；FISH可以检测各种融合类型，但是操作繁琐，价格昂贵；RT-PCR方法的特异性较好，结果客观，但是只能针对已知类型。近期有研究者采用数字PCR，利用ALK基因3’端的过表达来鉴定ALK的融合，该方法既具有PCR方法特异性好、结果客观的优势，同时又不受融合类型的限制，可以检测所有融合型，在与三种传统方法的对比过程中展现出了更好的临床符合率，未来有望成为一种新的常规检测手段[8]。
3. 乳腺癌的分型
ER，PR和HER2是乳腺癌最常用的分子标志物，在患者在开始治疗之前必须要明确这几个分子标志物的具体状态。传统的检测方法是通过IHC来确定蛋白的表达情况，而HER2检测也还可以通过FISH来判断染色体的扩增情况。尽管相应的检测都有明确的指南来加以规范，但是在临床实践过程之中，有些检测结果不可避免的还是会受到人为操作和判读的主观影响，从而导致同一样本的结果偏差，为临床的治疗带来了极大的困惑。有研究者尝试采用四重数字PCR方法，对这几个标志物同时进行定量检测。95例石蜡标本的对比分析结果显示，HER2，ER和PR与IHC的一致性分别为96.8%，91.5%和85.1%，而ROC曲线下面积则分别为0.991，0.977和0.920，说明该方法与IHC方法有较好的一致性。此外，相比于IHC方法，数字PCR方法还具有操作和判读标准化、结果重复性好、检测周期短、标本使用量少等优势，未来在临床将会有很好的应用前景[9]。
4. 甲基化分析
DNA甲基化是哺乳动物DNA的一种常见表观遗传修饰，它通过调节细胞中的基因表达从而在发育和疾病过程中发挥了重要的作用。异常的DNA甲基化涉及整个基因组的整体低甲基化和位于基因启动子区域和基因间DNA的CpG岛的局部超甲基化，这是人类恶性肿瘤中一个常见的表观遗传改变。基于PCR的方法已经被广泛的应用于DNA甲基化的评估，其原理是先采用亚硫酸氢盐来处理DNA，这会通过脱氨基作用将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，然后设计与这些DNA进行特异结合的引物和探针进行扩增检测。然而，传统的PCR检测容易受到PCR抑制剂的影响，在非甲基化等位基因的背景下进行稀有甲基化等位基因检测的敏感性有限。而数字PCR是在无数个独立的分隔之中进行反应，因此彼此之间较少受到抑制剂的影响，能够对传统方法检测不到的罕见甲基化等位基因进行精准的检测，未来有望将DNA甲基化作为一个具有区域性癌变的预测指标或者癌症风险生物标志物来使用[10]。
5. 单细胞的基因表达分析
基因表达分析有助于了解细胞和组织的特征及其如何应对发育和环境信号的改变。检测已知和未知基因转录水平的方法在过去的四十多年来发生了翻天覆地的变化，变得更加有效，更加敏感，定量更加精准，能够一次性对大量的基因转录本进行分析。但是，在组成复杂的细胞混合物中，尽管显著表达的基因可以被识别出来，但来自于少数细胞群体（例如干细胞）的转录本却很可能会被掩盖掉，尤其是在每个细胞中以低丰度形式出现的转录本。为了解决这个问题，单细胞检测技术应运而生，而且逐渐受到了越来越多的重视。ddPCR在单细胞分析中的优势在于它不需要标准曲线就能进行绝对定量。而且，由于能够以非常高的敏感性区分至少五种不同的基因转录本，因此无需进行其他方法所要求的单细胞cDNA预扩增，这可以消除预扩增和NGS文库准备中潜在的转录本定量失真，能够更加真实的反映单细胞群体中关键基因的特征[11]。
6. 外周血MicroRNA的绝对定量
人体体液中稳定可检测的miRNA的发现为其作为疾病生物标志物提供了新的可能性，但是它们的含量可能极低，在体液中也缺乏已知的内源性参考基因，这为每一项可靠的转化应用都提出了真正的挑战。利用数字PCR的绝对定量优势，可以解决缺乏内源性参考基因的问题。有研究者证实，基于EvaGreen的ddPCR技术可以给出溶液之中miRNA分子的精确数量，并且在低丰度的miRNA定量中有更好的准确度，在四个数量级的浓度范围内都有很好的重复性，能够在低至1拷贝/μl的水平上检测到一个拷贝的miRNA，这种性能完全超过了传统定量PCR的表现。由于ddPCR能够提供更好的重复性，实验室内部和实验室之间的结果具有直接可比性，这使得ddPCR成为microRNA研究中非常有潜力的一个技术[12]。
7. 微小残留病变（minimal residual disease，MRD）
随着化疗、靶向治疗、造血干细胞移植等治疗方式的改进，血液肿瘤的治疗效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液肿瘤治疗的一大难题。动态监测MRD对于评价治疗疗效、预测疾病复发、实施个体化治疗具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前最常见的是流式细胞学（flow cytometry, FCM）和PCR两大类, 但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高[13]。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例[14]。数字PCR作为目前灵敏度和准确性最高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。
三、数字PCR检测技术发展方向
数字PCR的发展方向包括[15]：（1）提高检测通量，可对多个靶标多个标本并行检测；（2）开发多靶点检测的多重数字PCR检测，可以通过多种荧光染料或标记技术来实现；（3）提高检测自动化程度，实现一键式检测的自动化检测流程；（4）提高检测速度，进一步降低检测时间；（5）提高检测动态范围；（6）降低检测成本。
数字PCR仪的技术先进性已经有共识，作为一种全新的思路和手段，临床一直对其抱有很大的期待，是未来临床分子诊断的关键平台。要做到这一点，需要更好的满足临床需求，比如多指标、通量高、自动化、稳定性好、防污染、成本低。好的产品都是在使用中成长起来的，优秀的产品稳定性带来愉快的使用体验，这还需要时间的历练。同时，我们看到数字PCR作为高端科学仪器和医疗器械，国产技术研发、合作的进步非常快，有望更快的推动数字PCR在临床中深入应用。
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