临床生化检测系统特殊分析参数的设置要点与临床实践
作者：覃俊龙 张秀明
自动生化分析仪的分析参数也称为实验参数或反应参数，就像手工操作的“操作规程”一样，是仪器的执行程序。配套检测系统的分析参数已经厂商充分验证并以最优组合存储在生化分析仪的计算机中，用户不能更改称之为“封闭系统”。而自建检测系统（或称开放系统）的分析参数未经厂商验证或验证不充分，用户可以重新编制或修改，其分析性能有很大的不确定性。合理设置生化检测系统的分析参数是检验人员的基本技能之一，也是检验结果准确可靠的基本保证。本文通过具体案例重点介绍自建检测系统特殊分析参数的设置要点。
一、空白（吸光度）检查
1. 杯空白检查：在反应杯中加水后测得的吸光度，主要用于检查比色杯状态。
2. 样本空白检查：仅用于双试剂，在加入样本和R1之后测得的吸光度，主要用于消除标本因素对检测的影响。
3. 试剂空白监测：试剂空白监测是检查试剂质量的一个指标。在校准时以生理盐水作为S1，经过与校准液相同的反应后测得的吸光度，主要用于判断试剂是否合格。每种试剂的试剂空白都有一定的吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质。如Trinder反应的试剂会随时间延长而变红（酚被氧化为醌）；ALP、GGT、AMY试剂会随时间延长而变黄（基质分解出硝基酚或硝基苯胺）；NADH氧化为NAD+吸光度会随时间延长而下降；有些试剂久置后变混浊使空白吸光度升高等。通常试剂空白吸光度波动在很窄的范围内。将该波动范围输入仪器，如经核查发现试剂空白超限，则会报警或“拒绝”。试剂空白范围的设置一般以试剂说明书为准。
试剂空白吸光度只是核查试剂质量较为方便实用的指标之一，并不能反映试剂质量的全部。特别是酶法分析中，工具酶的来源、性质和用量，并不能从试剂空白吸光度的高低反映出来。另外，“表观”吸光度也不一定完全反映出试剂原料纯度的实质。典型的例子是还原型辅酶Ⅰ（或Ⅱ），劣质的原料可通过加大用量使“表观”A340nm上去，而造成整个试剂盒质量的低劣，其后果是灵敏度、准确性、重复性和分析测量范围都会下降。这些后果会在与优质试剂盒对比实验、定值质控血清测定或室间质评中显露出来。
图1. 空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰
4. 试剂空白速率监测：试剂空白速率监测一般在连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率，如图1所示。通常酶试剂在反应条件下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化主要与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同，这种情况一般使测定结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在计算结果时会自动减去试剂空白变化速率。如酶偶联法测定尿素（Urea），其中的NADH由于存在杂酶或干扰物而氧化为NAD+；又如用色素原为底物的酶类测定项目ALP、GGT、AMY，其色素原在37℃的反应温度下会自发分解产生黄色色素（最大吸收峰405nm）。校正系数K值越大，试剂空白速率造成的影响越大。
二、校准核查
校准核查是指每次校准时仪器给出的校准报告提示的信息。校准核查包括双份重复性核查、敏感度检查、离散度检查、校准因子检查等，如图2所示。
C1，第1个校准品浓度；C2第2个校准品浓度；CN，第N个校准品浓度
图2. 校准核查示意图
1. 双份重复性核查：双份标准空白或双份标准测定的吸光度之间的差值应有一允许范围，这可作为参数“重复界限”输入。双份测定所用试剂、标准或校准品相同，如出现超出“重复界限”情况，可使质控问题分析集中到样品、试剂的定量吸注、反应温度的控制及光电检测系统的稳定性等方面。
2. 敏感度核查：在一个分析系统稳定的条件下，一定浓度的校准物的吸光度测定值与试剂空白吸光度之间的差值应保持相对恒定，这个差值同样有一定的经验范围，也可作为参数输入仪器，用作敏感度检查。差值越大，敏感度越好，如果差值变小，低于敏感度检查下限，可能因为试剂空白吸光度过高，也可能是校准物降解而致吸光度下降。如果是试剂出了问题，则会在上述空白水平核查中发现；如果试剂、校准物没问题，敏感度下降可能因仪器信号转换、放大系统故障所致。
3. 离散度核查：在多点校准或非线性多点校准中，浓度与吸光度都有一定的数学关系，如Logit-log 3P、Logit-log 4P，仪器可以比较吸光度实测值与计算值，二者之差SD应在允许范围内。SD值如大于应用（校准）画面中“偏差允许吸光度”的输入值，则出现偏移允许吸光度超限报警，打印出“SD”的报警信号。SD的大小表明各实测值与计算值的离散度，将设定的SD限作为参数输入仪器，进行偏移允许吸光度核查。
4. 校准因子核查：在自动分析中，当已知浓度的校准物吸光度测出后，会自动计算出校准常数K，存储于计算机中，供样品测定时计算用。正常情况下，每次校准测得的K值应在较小范围波动，有的仪器已设定为±20%，如果当前校准与上次校准相比偏差＞20%则报警为校准错误。有些仪器得出的校准K值，要求操作者确认后才存储于计算机中。
三、线性核查
线性核查主要用于连续监测法，根据设定的非线性程度对监测期进行线性判断。一般是将连续监测到的读数点进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否处于线性期。如果在监测时间内发现非线性结果，即刻报警。应及时调出实时反应曲线检查。实时反应曲线是指空白、样品、校准物品、质控的时间进程曲线，即所有测光点与吸光度变化曲线。可以观察终点法是否达到终点、是否有明显的基质效应等。对速率法而言，主要观察读数时间段是否成线性，并分析非线性的原因，读数时间错误或样品浓度过高是最常见的原因。现在有些仪器在线性检查的基础上增加了“线性范围扩展” 功能（也称自动线性延伸），是指仪器对读数区内的各个测光点进行自动搜寻，剔除不符合线性的读数点，寻找符合线性度的读数时间段来计算结果，减少高浓度样品的重复或稀释后检测。
得注意的是某些线性核查时，测光点应该在3个点以上。如罗氏生化检测系统根据检测点的多少，分三种情况：测光点≤3个点，不执行线性检查；测光点在4-8个，前后各3个点执行线性检查；测光点≥9个，前后各6个点执行线性检查。图3是速率A法的反应曲线，加入R2/R3后为线性反应部分，线性反应过程中很多的测光点，Vx为测光区的平均速率，Vi为前6个（3个）测光点的平均速率，Vf为后6个（3个）平均速率。图4为线性检查的判断条件。C和D需同时大于相应的数值才会启动线性检查，否则不需要启动。启动后，当测光点≥9时，速率变化率＞10%则报警；当测光点4-8个时，前后速率变化率＞30%则报警。如罗氏速率A法测定AST，首次测光点为24，终测光点为38，在此区间内AST测光点为15个（≥9），如图4所示，首先C和D要同时大于60（即平均速率和前后速率差值）启动线性核查，连续15个点前后速率变化率＞10%触发报警。如果在AST的酶促反应平台期，监测到跳点的情况，如大批量标本出现＞Lin报警，则提示光路不稳定，需要检查光路的零部件，尤其是灯泡是否已到使用寿命。
图3. 罗氏线性核查示意图
图4. 罗氏线性核查参数设置
四、反应限和底物耗尽核查
反应限核查（Abs.Limit）可以避免因底物耗尽出现报告低浓度结果的假象。“底物耗尽”是指高活性浓度的样品在反应开始的早期或主要读数区间之前就将反应底物用尽，反应的吸光度表现为相对稳定的现象，在速率法中可以看到曲线由陡峭突然变得平缓。反应限核查是临床生化分析中特别重要的功能，不正确设置或是无视仪器反应限核查报警，会直接将极高浓度结果（如淀粉酶、肌酸激酶等）报为正常结果，大大延误患者的诊疗，甚至影响患者的急救。
底物耗尽常见的几种情况：① 样本中酶的活性远超线性范围，底物几乎瞬间被耗尽，零级反应期极短，设定的常规吸光度读数点完全不在零级反应期内，即反应界限内的吸光度点数零，可能会测出负值，报告审核时容易发现；② 样本中酶的活性超过线性范围较多，底物在较短时间内是被耗尽，零级反应期较短，设定的常规吸光度读数点大部分不在零级反应期内，此时会造成结果严重偏低，这种情况在报告审核时不易发现，有可能导致严重后果；③ 样本中酶的活性稍超出线性范围，底物耗尽需要相当的时间，零级反应期相对上述两种情况要长，设定的常规吸光度读数点仅有小部分不在零级反应期内，此时依然会造成结果偏低，这种情况在报告审核时不易发现。
图5所示为罗氏生化检测系统正常AST反应曲线，仪器在测光点19加入试剂2，吸光度突然增高后呈现为稳定下降的趋势。仪器参数设置在Abs.Limit（吸光度限）中设置反应限检查参数。实际用于反应限检查的限值需通过仪器计算得出，计算公式如下：Reaction Limit = Abs.Limit+d（Lsample-Lcalib）。Abs.Limito为生化分析仪参数设置界面中设置的参数，Lsample为样本反应曲线第一个点的主波长吸光度值，Lcalib为校准时的STD1校准品反应曲线第一个点的主波长吸光度值。
图5. 正常AST反应曲线
如图6所示，AST的吸光度限设置为7500，大于此值则触发反应限报警；反应类型为降反应（Decrease），即加入试剂2后反应过程为吸光度下降。测光区内4个或4个以上的检测点大于Abs.Limit限值7500，不触发数据报警，结果正常，直接报告结果；只有3个或3个以下的检测点大于Abs.Limit限值，触发＞React数据报警。反应限值检查与吸光度值（升反应）的关系如图7，仪器针对每次检测都会计算Reaction Limit值，如果在监测区间内有3个及以上的测量点数值大于Reaction Limit值，则不触发报警，反之则启动报警，需稀释复查样本。
图6. 反应限核查参数设置
图7. 反应限核查与吸光度值的关系
图8为速率法测定AST的反应曲线，仪器计算的Reaction Limit值为9183，图中AST的测光区域第24点到第38点内，仅有2个测光点大于Abs.Limit即7500，所以触发了＞React数据报警。样本稀释后重测，AST的测光区域第24点到第38点内，所有15个测光点都大于Abs.Limit值7500，所以不触发>React数据报警，如图9。吸光度检查同时可以在升反应中监测底物耗尽现象。设置吸光度限值为20000。与降反应相同，≥4个点在20000以下则正常报告结果，否则触发报警，需要稀释之后检测。
图8. 反应限核查报警
图9. 样本稀释后AST反应曲线
五、前带现象检查
1. 钩状效应的概念：如图10所示，典型的抗原抗体反应的校准曲线呈S形，反应初始阶段（0-A段），抗原（Ag）量很少，抗体（Ab）过量，称为前带（prezone）。随着Ag增加免疫复合物形成增加，反应液浊度逐渐升高，接着进入相对的线性期（A-B段），随着Ag增加免疫复合物形成也增加，反应液浊度按比例升高直至反应平衡区（A-C段）；若进一步增加抗原将导致沉淀增加，反应液浊度反而下降（C-D段），即抗原过剩区，称为后带（postzone）。当抗原抗体比例由抗体过剩到抗原过剩时，免疫复合物的生成量由上升到下降，剂量反应曲线呈钩状的现象，即为钩状（Hook）效应。高剂量钩状效应使强阳性标本误测为弱阳性，以至假阴性结果，因此，高剂量钩状效应是免疫比浊测定中必须重视的问题。
如图10所示Ag过剩情况，Ag浓度悬殊的两个样品（B和D）的吸光度却可以相同，造成严重错误的结果，这是免疫透射比浊方法固有的缺陷。针对这一潜在的问题，大多仪器都设计有前带核查功能。
图10. 钩状效应示意图
图11. 定标曲线和钩状效应示意图
结合定标曲线我们再来看一下在测量程序中如何去区分Hook效应。如图11所示，绿色的线为校准曲线，红色为实际检测物质的反应曲线。蓝色的柱状部分为分析测量范围，其中包含了参考区间（范围）。超过分析测量范围（线性范围），仪器会有线性报警，因为存在Hook效应，所以对于高值可能会报告假性降低结果或假阴性结果。
2. 钩状效应的核查解决方法：（1）试剂配方优化。通过试剂配方优化，直接使临床可见浓度范围内，不会发生抗原过剩，或者至少使临床可见浓度范围在安全范围内。这种方案会直接导致试剂成本的增加，对于样本浓度分布不是特别宽的项目较为适用。（2）样本预稀释。通过样本预稀释，使直接参与到抗原抗体反应体系中的抗原浓度降低，可以有效扩大测量范围和安全范围。有些厂家的生化分析系统上有部分项目采用了这种方案。这种方案由于默认所有样本都直接进行特定稀释倍数的测试，会降低测试效率，同时对试剂的灵敏度也提出了一定挑战。（3）仪器软件算法功能，对反应过程进行数据分析，自动识别抗原过剩并给出报警信息。常见的有抗原再添加法和反应速度比法。
3. 钩状效应解决方法举例：以上几种解决方法，不同的检测系统，针对不同的项目特点，采用的方法不尽相同。前两种都是生化分析仪结合试剂特点提供的功能和系统性解决方法。这里着重对仪器算法识别抗原过剩的两种方案分别进行举例说明。
（1）抗原再添加法：抗原再添加法是判断抗原过剩最直接有效的方法。在抗体过量前提下，待测抗原在反应介质中与抗体快速反应形成稳定的小复合物颗粒，产生散射光信号，该信号随复合物的增加和时间的延长（抗体过量阶段）而动态性增强，在规定时间内如果抗体保持过量，再次加入抗原后会继续反应，反应幅度会继续上升，如果抗原已过量，则反应下降。也就是说，抗原再添加是在反应结束后，再添加特定浓度抗原，根据加入后的反应度变化幅度判断是否发生抗原过剩的。这种方法在检测前带现象中是准确有效的，但试剂的成本由于抗原组分的增加而直接增加，并且需要额外的抗原再添加步骤，也会影响到测试效率。同时，抗原组分试剂的增加，也需要额外占试剂存贮空间。因此，抗原再添加法在产品中实际应用的项目并不多。
以IgG在Hitachi 7170A仪的反应过程为例（图12），对自动生化分析仪识别免疫比浊分析中的钩状效应加以说明。根据抗原抗体反应曲线的双相应答反应的特点，当抗原抗体浓度大致相等时，反应在等当量区进行，此时位于剂量反应曲线拐点附近，如果此时向反应体系中加入一定量的抗原，反应体系的抗原抗体浓度的比例将发生改变，剂量反应曲线将向抗原过剩区变化，这时其时间反应曲线也将发生相应改变。图12所示在16点抗原二次加入后的时间反应曲线，当IgG浓度≤30.9g/L时，二次加入抗原后，过剩的抗体会与二次加入的抗原反应，使反应曲线迅速向上延伸，而当IgG浓度≥61.8g/L时，在等价区或后带区二次加入抗原后，使抗原抗体反应减弱，反应曲线迅速向下进行，因此，抗原过量的检查限额为（抗原二次加入法）：
ΔA = （A12 - A20）＞0
图12. 抗原二次加入时间反应曲线
图13为罗氏检测系统抗原添加法核查钩状效应示意图，仪器可以通过添加稀释的抗原作为R3试剂来检查前带现象。此图为正常的反应曲线，添加R2后开始反应，R3为抗原过量试剂。若加入R3也就是人为添加抗原后，反应能够朝相同方向继续进行，则没有发生抗原过量；如果加入R3后，反应朝相反方向进行，则说明抗原过量，发生前带现象，仪器报警＞Prozone。
注：Pmp1，前带测光点1；Pmp2，前带测光点2；Apmp1，前带测光点1吸光度；Apmp2，前带测光点2吸光度
图13. 罗氏钩状效应核查示意图
图14为仪器中设置的参数，A、B为设置的前带检测上下限，C和D为相应的测光点，抗原添加方法E和F设置为0，G为判断条件，IN：在A和B范围内报警，OUT：在A和B范围外报警。图15为仪器中的尿微量白蛋白（ALBU2）的反应曲线，26-18测光点＝-49，在-32000-700内，所以触发了前带报警＞Proz。图16为样本稀释后的反应曲线，相同的检测条件，通过稀释复查后Apmp26-Apmp18=3860，在-32000-700限值范围外，不触发＞Proz报警，可报告结果。
注：A，Prozone Limit下限；B，Prozone Limit上限；C，选取的第1个读点MP1；D，选取的第2个读点MP2；E，选取的第3个读点MP3（抗原添加法为0）；F，选取的第4个读点MP4（抗原添加法为0）；G，若设置Out，MP2-MP1的吸光度值超出Prozone Limit限值范围时触发报警；若设置In，MP2-MP1的吸光度值处在Prozone Limit限值范围时触发报警
图14. 罗氏尿微量白蛋白核查钩状效应参数设置
图15. 原高值样本ALBU2反应曲线（＞Proz报警）
图16. 稀释后样本ALBU2反应曲线（无＞Proz报警）
（2）反应速率比法：反应速率比法是一种动力学方法，通过分析样本测量过程中获得的动力学数据，验证前带现象是否发生。图17为反应速率比法检查前带现象示意图，加入试剂R2/R3后开始反应，测光点有四个，需要检测后面两个测光点吸光度变化率和前面两个测光点吸光度变化率的比值是否会触发报警。图18为罗氏生化系统测量甘油三酯的参数设置，测量方法为酶一点终点法，仪器参数设置中通过反应速率比法进行前带检查。图19为正常甘油三酯反应曲线，仪器在加入样本后即加入检测试剂，反应吸光度在短时间内上升，逐渐达到稳定状态。在38号测量点检测吸光度值计算甘油三酯浓度。触发前带检查条件及报警阈值计算方法如下：当4号测量点与2号测量点吸光度差值的绝对值大于1000或14号测量点与10号测量点吸光度差值大于0则触发前带检查。|pmp2-pmp1|＞1000或|pmp4-pmp3|＞0，此时如果pmp3、pmp4两个测量点间的斜率与pmp1、pmp2两个测量点的斜率之比小于-3或大于100，则判断前带检查错误，样本需稀释复查。
如图20所示，两段反应斜率之比为-40，超出了带检查范围，样本甘油三酯浓度过高，前带检查错误，报警＞Kin，需稀释复测。
注：R1/R2/R3，加试剂时间点；pmp1/pmp2，前带测光点1和2；pmp3/pmp4，前带测光点3和4；ΔA（pmp2，pmp1），前带测光点2和1的吸光度差；ΔA（pmp4，pmp3），前带测光点4和3的吸光度差；V（pmp1，pmp2），前带测光点1和2的吸光度变化率；V（pmp3，pmp4），前带测光点4和3的吸光度变化率
图17. 反应速率比法检查前带示意图
注：A/B，带检查下限和上限，当Prozone Check=[V（pmp10，pmp14）/V（pmp2，pmp4）]×100的值超出-3至100的限制范围时，触发＞Kin报警（kinetics unstable）；C/D/E/F，前带测光点1/2/3/4；G，超出带检查下限和上限报警；H，I
图18. 反应速率比法检查前带参数设置
图21为迈瑞BS-2000生化检测系统测量尿微量白蛋白的参数设置。以迈瑞BS-2000的设置为例，对反应速率比法的判断公式介绍如下。其中PC通常用于表示前带计算值，公式中的Aq1至Aq4分别表示设置的4个测光点的吸光度值；公式中q1-q4指设置的测光点。通常由厂家提供PC值的报警阈值参数，软件根据计算PC值与设定报警阈值参数的对比，判断是否发生抗原过剩。
图19. 甘油三酯正常反应曲线
图20. 甘油三酯浓度过高时的带检查方法
图21. 前带检查参数设置界面（BS-2000）
不同厂家的计算公式不尽相同，但基本原理都是一致的。有些厂家的计算公式中，简化为如下所示，也就是计算PC值时，不把不同测光点的时间间隔考虑在内。这虽然会导致计算出来的PC值有差异，但报警参数也同样是根据对应的公式给出的，因此并无实质性差异。甚至有些情况下，只用到3个测光点进行反应速率比计算。但其本质上都是在计算不同测光点之间的反应速率变化。不同厂家的报警原理虽然类似，但在实际使用中，需要结合厂家提供的资料，根据其参数在公式中的具体应用，进行合理的设置。
六、其它反应曲线异常检查功能
测试极高浓度的样本、试剂过期或变质、交叉污染，可能导致实际的反应曲线与理想的曲线存在明显的偏差。进而导致测试结果存在偏离。使用反应曲线检查将针对设置好的检查区间对测试样本反应曲线进行检查，当超过设置值时将给出反应曲线异常标记。
该功能并非所有厂家都提供，需要用户结合产品说明书使用。不同厂家的反应曲线检查功能设计，都是为了同样的目标，通过对反应过程数据的监测和算法处理，判断反应曲线是否正常，对于可能存在异常的曲线给出提示，尽可能避免错误结果对临床诊断的负面影响。以下分别给出不同厂家的方案举例说明。
图22. 特殊分析参数设置界面（BS-2000）
图22所示为BS-2000的反应曲线检查参数设置界面，提供了4个可设置条件，可以针对不同项目、不同异常情况，进行灵活多样的过程数据检查和判断设置。其中P1和P2是指反应曲线上测光点顺序编号，软件自动计算P2-P1的值，M和N是指判断阈值的下限和上限，P2-P1的值与设定的判断阈值比较，判断是否反应过程数据存在异常。
以TG项目为例，该项目属于Trinder反应原理，终点法项目。图23所示为TG的极高浓度样本反应曲线，从反应曲线可以看出，该曲线已经出现异常，因此测试结果可能会出现假性偏低。通过应用反应曲线检查参数和算法功能，实现自动识别并判断异常曲线，给出“RE”结果标识，表示系统自动识别反应曲线异常。通过自动稀释重测后，反应曲线正常，得出正确的测试结果（图24）。重测前后的结果对比如图25。
图23. 高浓度样本异常反应曲线
图24. 高浓度样本稀释重测后正常反应曲线
图25. 高浓度样本重测前后结果界面
七、交叉污染参数
临床生化检测中，交叉污染一直是影响结果偏差的主要因素之一，如何有效识别交叉污染，预先采取有效措施避免其影响，是全自动生化分析仪检测系统构建的主要挑战之一。全自动生化分析仪上可能有多于一百种不同的试剂，每一种试剂包含很多不同的组分。这些组分具有不同的物理和化学性质，例如无机物、有机物、亲水、亲油、酸性、碱性、黏度等。不同试剂组分对不同材料表面（如不同材质的金属试剂针、塑料和玻璃反应杯等）的吸附力不同，被清洗干净的难易程度也不同。另一方面，全自动生化分析仪的工作模式是以固定的周期进行的，因此在一个工作周期内的清洗时间是固定且有限的，在一定的时间内，清洗干净具备不同物理和化学性质的物质，对仪器的清洗能力设计非常有挑战。
仪器基本清洗能力是降低交叉污染的基本保障。由于交叉污染的机理较为多样化，污染物质的化学特性不同，基本清洗流程并不能彻底避免所有的交叉污染。因此生化分析仪通常都需要设计防止交叉污染的流程和对应的参数设置功能，对已经预先识别的交叉污染对进行设置，在测试过程中，遇到已知的污染对时，通过调整测试顺序，或者插入预定次数和预定类型的清洗，达到避免交叉污染的目的。
对于厂家提供的封闭检测系统，交叉污染参数和程序通常已经过完整的建立和验证，但对于使用了第三方试剂的系统来说，第三方试剂项目之间，以及第三方试剂与封闭试剂之间是否可能存在潜在的污染，如何有效识别并避免交叉污染带来的结果不可靠，是非封闭检测系统面临的一大挑战。
八、小 结
合理设置生化检测系统分析参数至关重要。配套检测系统的分析参数经厂商反复验证确认已固化于生化分析仪的计算机中，通过基本分析参数能对分析测量范围内标本给出正确的检验结果，通过特殊分析参数能对分析测量范围以外的标本、异常和特殊的标本给出正确的检验结果。而仅生产试剂的厂商虽然在其试剂盒说明书给出了基本分析参数，但缺乏特殊分析参数或参数验证不充分，没有固化对计算机中，实验室限于时间和技术能力很难对各种反应参数进行反复验证和全性能确认，对特殊或异常的标本很难给出正确的检验结果。因此，选用配套检测系统或固定组合的检测系统是临床实验室的首选，保持检测系统的完整性和有效性是检验结果质量保证的基础。
