急性髓系白血病患者异基因造血干细胞移植后监测DEK-NUP214 融合基因的预后意义

作者:高梦鸽
2021-12-16

作者:高梦鸽 付强

【摘要】目的 探讨移植前后DEK-NUP214融合基因的动态变化及其对AML患者 移植前后的临床意义。方法分别采用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和流式 细胞仪(FCM)检测2012年9月至2017年9月于北京大学人民医院接受异基因造 血干细胞移植(allo-HSCT)的15例初诊DEK-NUP214基因阳性的AML患者移 植前后的DEK-NUP214基因表达和白血病相关免疫表型(LAIP)。结果 中位随 访时间为657天(62-2212天)。初诊DEK-NUP214的中位表达水平为488.2% (273.6-1692.1%)。13名患者在进行allo-HSCT前已完全缓解。在allo-HSCT 前15例患者中有13例(86.7%)的DEK-NUP214表达阳性,中位值为0.32% (0.029-738.9%)。allo-HSCT后9名患者(69.2%)的DEK-NUP214基因 保持阳性。但其表达水平在移植后一个月内降低了约500倍(5.7倍-5663倍)。 移植后死亡5例(33.3%),复发2例(13.3%)。移植前DEK-NUP214阳性患 者的3年累计复发率是17.5±11.3%,3年总生存率 是60.5±13.8%。allo-HSCT后,DEK-NUP214 阴性的患者比DEK-NUP214阳性的患者有更好的预 后。结论 RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基因可 能是一种有效且更敏感的评估allo-HSCT后MRD状 态的指标。

【关键词】异基因造血干细胞移植,DEK-NUP214 融合基因,微小残留病,急性髓系白血病 伴t(6; 9)(p23; q34)染色体异常的急性髓性 白血病(AML)约占AML的1%,其6号染色体上的DEK 基因与9号染色体上的NUP214基因之间产生融合基因[1]。Slovak等研究显示t(6; 9)(p23; q34)的AML 患者的完全缓解率(CR)在儿童患者中约为71%, 在成年患者中为58%,而5年生存率儿童和成人分别 约为28%和9%[2]。先前研究显示仅接受化疗的伴DEKNUP214融合基因的AML患者预后较差,异基因造血干 细胞移植(allo-HSCT)可能比单纯化疗具有更好的 总体生存率(OS)[2,3]。微小残留病(MRD)是可以 确定高复发风险的重要预后因素,而MRD指导的干预 措施可以降低复发率[4,5]。白血病特异性融合基因的 检测通过实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)获得的 转录水平可以准确灵敏地反映MRD状态。AML的DEKNUP214融合基因有可能成为评估MRD状态的良好标 记。然而,由于伴DEK-NUP214融合基因的AML患者数 量有限,该融合基因的表达水平如何随疾病进展而变 化以及是否可以用作移植前后MRD的可靠标志物仍然 未知。本研究旨在探讨DEK-NUP214融合基因的动态 变化及其对AML患者移植前后的预后意义。

一、研究对象与方法

1. 病例:本研究纳入2012年9月至2017年9月在北 京大学血液病研究所接受allo-HSCT治疗的15例AML患 者的临床资料。使用当前广泛使用的WHO标准对患者 进行诊断[6]。使用先前描述的常见形态学标准定义白 血病复发[7]。

2. 移植预处理方案及移植物抗宿主病 (GVHD)的预防:HLA同胞全合患者应用改良白消 安/环磷酰胺(Bu/Cy)方案,HLA配型不合患者在改良 Bu/Cy基础上加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)[7]。所有 患者均接受环孢素A+吗替麦考酚酯+短程甲氨蝶呤来 预防GVHD。

3. 标本采集:分别于初诊、移植前、+30d、 +60d、+90d、+180d、+270d、+360d采集骨髓标 本,移植1年后根据患者临床情况每3~6个月进行 骨髓检查。EDTA抗凝,分离骨髓单个核细胞,采用 TRIzol法提取细胞总RNA,逆转录为cDNA。

4. FCM监测和DEK-NUP214融合基因的定 量检测:FCM监测参照文献方法[7]。采用8色流式细 胞术,FCM阳性定义为FCM检测骨髓异常髓系幼稚细 胞≥0.01%。在ABI Prism7500 RQ-PCR仪(美国ABI公 司产品)上进行。反应体系10ul:上、下游引物各 0.3umol/L、TaqMan探针0.2umol/L、2xTaqMan通用PCR 公共体系5ul、cDNA1ul(相当于100ng RNA)。PCR条 件:50℃ 2min,1个循环;95℃ 10min,1个循环; 95℃ 15S,62℃ 1min,40个循环。内参基因为ABL。 DEK-NUP214融合基因的表达水平=DEK-NUP214融合基 因拷贝数/ABL基因拷贝数×100%。

5. 定义:主要研究终点是白血病的累积复发率 (CIR)。次要终点是无治疗生存期(TRM),总生 存率(OS)和无病生存期(DFS)。复发,OS,DFS和 MRD的定义如前所述[8]。一旦检测FCM阳性或RQ-PCR 检测DEK-NUP214表达水平>0,就将患者定义为MRD 阳性。对移植后MRD阳性患者进行的干预措施包括化疗,应用干扰素,减停免疫抑制剂和(或)供者淋巴 细胞输注(DLI)等。

6. 随访:所有病例通过病例复查或电话进行 随访,随访截至2019年5月31日,中位随访时间657 (62-2212)d。观察患者移植后MRD、复发及干预措 施、生存情况等。 7. 统计学分析:使用SPSS 23.0软件进行统计分 析。使用Kaplan-Meier生存曲线分析了CIR,移植相 关死亡率(TRM),DFS和OS。使用logrank检验比较组 间的预后差异。P值≥0.05被认为具有统计学意义。

二、临床研究结果 

1. 患者的临床特征:15名AML患者男8例,女7例, 中位年龄33(4-57)岁。初诊DEK-NUP214的中位表达 水平为488.2%(273.6-1692.1%)。移植前13名患者通 过化疗达到CR。15例AML患者分别接受同胞全合移植 (n=4)或单倍体移植(n=11)。所有患者均获得稳定 的中性粒细胞植入。两名患者(13.3%)分别在移植后 +102d和+270d复发,最终死于白血病复发。另外,有3 例是治疗相关死亡(表1)。

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2. 移植前DEK-NUP214融合基因的表达:移 植前有13例患者DEK-NUP214阳性,其中位表达水平为 0.38%(0.029-738.9%)。移植后13例中有9例仍DEKNUP214阳性。另两名移植前DEK-NUP214阴性的患者 在移植后未复发或死亡。Kaplan-Meier显示,DEKNUP214阳性患者预后较差,但无统计学差异。移植前 阳性患者的3年CIR为17.5±11.3%(P=0.545,图1A)。 此外,移植前阳性患者的3年TRM,3年DFS和3年OS分别 为24.5±12.3%,61.5±13.5%和60.5±13.8%(P=0.464, 图1B;P=0.336,图1C;P=0.329,图1D)。

3. 移植后DEK-NUP214融合基因的表达:移 植后有9(60.0%)例仍保持DEK-NUP214阳性表达。但 其表达水平在移植后一个月内降低了约500(5.7- 5663)倍。这9例中有2例患者存在持续DEK-NUP214 阳性表达,并最终在随访期间复发。移植后2个月, 1例患者死于严重的急性移植物抗宿主病,其余6例患 者的DEK-NUP214基因在移植后6个月内均转为阴性。 DEK-NUP214阳性组的3年CIR较高,为27.1±16.5%, DEK-NUP214阴性组中无患者复发(P=0.187,图 2A)。与DEK-NUP214阴性组相比,DEK-NUP214阳 性组的3年TRM趋于更高(分别为23.8±14.8%和 16.7±15.2%,P=0.674,图2B)。两组之间的3年DFS 和3年OS分别为55.6±16.6%和83.3±15.2%(P=0.229, 图2C)和53.3±17.3% vs. 83.3±15.2%(P=0.245,图 2D)。

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4. 移植后MRD阳性患者的干预治疗及其预后: 我们分析了移植后9例MRD阳性患者的干预治疗效果。 当MRD呈阳性时,患者及时接受干扰素或DLI治疗。表 2总结了移植后MRD阳性患者的干预治疗和预后。患者 1在移植后的前3个月为DEK-NUP214阳性,但有其他 严重并发症并在没有干预的情况下死亡。患者2和7的 DEK-NUP214基因表达水平较低,未干预,最终MRD自 身转为阴性。患者3在MRD阳性时放弃干预治疗,导致 DEK-NUP214基因持续高表达,最终复发并死亡。患者 4在移植后首次出现DEK-NUP214阳性(27.7%)时,直 接进行化疗加DLI,然后MRD变为阴性。患者5在移植后 的早期死于感染。患者6和8接受了干扰素治疗,MRD 变为阴性。移植后DEK-NUP214融合基因持续高表达的 患者9被给予DLI+干扰素治疗,但最终复发并死亡。


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三、讨论与分析

由于DEK-NUP214阳性AML患者数量有限,很少研 究关注该基因的表达水平随疾病进程的变化以及是 否可用作移植前后MRD的可靠标志物。带DEK-NUP214 融合基因的AML是高危型白血病,患者应在首次CR后 尽快接受HSCT治疗[2],因此,本研究中的大多数患者 在移植前仍处于低水平DEK-NUP214表达(<0.1%)。 此外,移植后基因表达并无即刻转阴性,而是缓慢 下降,至移植后3至6个月内转为阴性。表2显示,移 植后DEK-NUP214表达水平低于0.1%的患者中,基因水 平逐渐降低至自身转为阴性,而在复发患者中,基因 表达水平持续升高直至复发或死亡。这种动态变化基 本上与临床表现,肿瘤负荷和其他MRD监测指标(如 LAIP)一致。表达水平高于0.1%暗示移植后高复发风 险。0.1%的DEK-NUP214表达水平可能是一个阈值,但 是需要更多病例进行验证。

此外,我们结果显示DEK-NUP214可在复发前监测 出阳性,且先于FCM阳性结果。Ommen HB等人的研究 发现,DEK-NUP214基因可在血液学复发前约65d监测 到[9]。表2和表3显示,一名复发患者的DEK-NUP214基 因在白血病复发前72d转阳性,而FCM在复发前12d转 阳性。另一位复发患者在白血病复发前240d检测DEKNUP214基因和FCM均为阳性。我们的分析表明,在 allo-HSCT后,通过RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基因 可能是比FCM更敏感的评估MRD状态的方法。移植后早期对MRD进行及时监测有助于指导早期临床 干预以改善患者的预后。这些结果表明DEK-NUP214融合基因是灵敏且可靠的MRD检测标记。

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先前的研究表明,移植前MRD阳性可预测移植后的 不良预后[10]。然而,如图1所示,移植前DEK-NUP214 表达对预后的影响并不显着。这是因为,大多数患者 (n=12,80.0%)在首次CR但DEK-NUP214表达尚未转阴 时即进行allo-HSCT。结合我们的发现(表2),DEKNUP214表达水平低于0.1%对预后的影响并不显著。这 可能是由于DEK-NUP214融合基因在移植物抗白血病 (GVL)或移植后免疫重建的作用下转阴。此外,alloHSCT能够克服该类型AML患者移植前MRD阳性的不良反 应。先前的研究表明,在首次CR时进行HSCT可能改善 预后[3,11,12]。Sandahl JD等研究显示与单独化疗相比, 首次CR进行HSCT改善伴DEK-NU214阳性儿童患者的5年 无事件生存率(68%比18%)和总生存率(68%比54%)[11]。我们的研究发现,伴DEK-NUP214的HSCT患者的 CIR,OS和DFS分别达到17.5%、60.5%和61.5%。在我院, 标危AML患者的总体CIR和OS分别约为15%-20%和60%- 70%[7,10]。因此,这表明我院的移植体系在提高DEKNUP214阳性AML的生存率上,具有一定的优势,也可克 服移植前MRD阳性对预后的不利影响。

AML预后与染色体和分子变化的多样性有关。我们 先前的研究表明,根据MRD状况对AML患者进行移植后的 抢先干预可以进一步降低复发率[14]。这种抢先干预取决 于MRD监测情况,通常是通过RQ-PCR或FCM来完成[9]。因 此,我们观察了DEK-NUP214移植后的动态变化是否可 以指导复发干预。正如我们研究显示,在allo-HSCT后 的3至6个月内,DEK-NUP214融合基因的表达缓慢转为阴 性,故患者基因表达处于低水平(<0.1)时,我们没 有立即进行干预。相反,我们观察移植后3到6个月的基 因动态变化。如果移植后6个月内基因表达呈上升趋势 或自身未转为阴性,将采取干预措施。我们研究中移植 后DEK-NUP214阳性最终可转阴性的患者预后更好。

总之,我们研究了DEK-NUP214融合基因作为进行 allo-HSCT的AML患者的敏感且特异的MRD指标的可靠 性。移植前后DEK-NUP214融合基因的动态变化与肿瘤负荷有关,融合基因表达水平高于0.1%暗示移植后高 复发风险。此外,allo-HSCT能够克服t(6; 9)对AML患者的不利影响。通过RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基 因可能是一种更敏感的评估allo-HSCT后MRD状态的方法。当然,在我们的研究中患有DEK-NUP214融合基因 AML的患者数量是有限的。仍然需不断积累更多样本进行连续研究,以更清楚地证明移植前后DEK-NUP214表达的动态变化。 


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