保存温度和保存时间及溶血对丙型肝炎病毒RNA定量检测的影响

作者：刘爱霞   徐军

【摘要】目的 结合ISO 15189，探讨保存温度、保存时间及溶血对丙型肝炎病毒RNA定量测定的影响。方法 将HCV RNA阳性患者血清，与高溶血血浆及正常人阴性血清按不同比例混合，得到高、中、低及无溶血四种样本，2ml样本管分装之后，分别置于室温（25℃）、4℃、-20℃保存6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d、21d、28d后，进行HCV RNA定量测定，均值取对数后进行相应统计学分析。结果 当保存温度为-20℃，保存时间自第14天开始，丙肝定量对数均值与初始值相比差异出现统计学显著性（P值＜0.05）；当保存温度为4℃，保存时间自第5天开始，丙肝定量对数均值与初始值相比差异出现统计学显著性（P值＜0.05）；当保存温度为室温25℃，保存时间自第14天开始，结果差异出现统计学意义（P值＜0.05）。当保存温度为-20℃、4℃及25℃时，低、中度溶血样本与无溶血样本相比，丙肝定量对数均值的差异均无统计学意义（P值＞0.05），高度溶血样本与无溶血样本相比，差异均有统计学意义（P值＜0.05）。结论 对于有待进行HCV RNA定量检测的性状正常血清样本，-20℃保存，不宜超过两周；4℃保存，不宜超过3d；室温下放置或者运输，不宜超过48h。对于溶血样本，应当考虑到溶血造成的影响：轻微溶血情况下（Hb 3g/L、Hb 12g/L）短时间储存影响较小，但如果溶血情况严重，血红蛋白浓度大于12g/L，HCV RNA定量结果降低明显。

【关键词】聚合酶链反应；溶血；保存条件；肝炎病毒；核酸

结合ISO 15189，探讨保存温度、保存时间及溶血对丙型肝炎病毒RNA定量测定的影响。

一、材料与方法

1. 材料：HCV RNA模板提取采用湖南圣湘全自动Natch S磁珠法核酸提取仪；PCR扩增及检测采用湖南圣湘HCV RNA荧光定量PCR检测试剂盒，扩增仪采用Roche480。

2. 方法：（1）溶血制备：选取HCV RNA、抗-HCV、抗-HIV及HBsAg均为阴性的正常人EDTA-K2抗凝全血，洗涤3遍后，置于-80℃下反复冻融使红细胞全部破裂，经3500rpm，离心10min，取上层液体作为高溶血样本。（2）样本准备：选取HCV RNA阳性患者（HCV RNA浓度10E5左右），采用分离胶采血管采血，3500rpm，10min立即分离血清并分装10.0ml离心管多管，作为阳性样本。选取HCV RNA，抗-HCV、抗-HIV及HBsAg均为阴性的血清作为阴性样本。（3）实验步骤：将阳性样本，阴性样本和已制备的高溶血样本按不同比例混合，配制成高（Hb约43g/L）、中（Hb约12g/L）、低（Hb约3g/L）及无溶血四种溶血程度的样本，分置于室温（25℃）、4℃、-20℃保存6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d、21d、28d后进行HCV RNA测定^[3]。所有时间点样本设置双管，取对数后求均值，每批次实验均设置阴阳对照^[4]。

3. 统计学方法：运用SPSS17.0软件对数据进行二因素方差分析。

二、研究结果

1. 不同保存温度下保存时间对HCV RNA定量的影响：如表1所示，当保存温度为-20℃，保存时间自第14天开始，丙肝定量对数均值与初始值相比差异出现统计学显著性（P值＜0.05），而从ISO 15189质控标准看，直到第21天才出现失控。当保存温度为4℃，保存时间自第5天开始，丙肝定量对数均值与初始值相比差异出现统计学显著性（P值＜0.05），同时按照ISO 15189质控标准也提示失控。当保存温度为室温25℃，保存时间自第14天开始，结果差异出现统计学意义（P值＜0.05），而按照ISO 15189质控标准在第3天已出现失控^[5]。

2. 不同保存温度下溶血对HCV RNA定量的影响：如表2所示，当保存温度为-20℃、4℃及25℃时，低、中度溶血样本与无溶血样本相比，丙肝定量对数均值的差异均无统计学意义（P值＞0.05），高度溶血样本与无溶血样本相比，差异均有统计学意义（P值＜0.05）^[6]。

3. 不同温度下保存时间和溶血对HCV RNA定量的主效应关系：如表3所示，保存温度为-20℃及4℃时，保存时间和溶血程度对HCV RNA定量对数均值有显著作用（P值＜0.05）。保存温度为25℃时，保存时间对HCV RNA定量对数均值有显著作用（P值＜0.05）,而溶血程度未见统计学显著性（P值＞0.05），提示样本室温放置时，放置时间对HCV RNA定量结果的影响相较于溶血而言更为重要^[7]。

4. 不同溶血情况下丙肝定量对数均值随时间变化关系：如图1-4所示，在无溶血以及低、中度溶血的情况下，丙肝定量对数均值随时间下降的趋势基本一致，保存温度-20℃和4℃的变化趋势基本吻合，保存温度为25℃则在5d后下降非常明显^[8]。而在高度溶血情况下，丙肝定量对数均值随时间变化的趋势有显著改变。由此我们可以看出，将样本置于室温保存，相较与冷藏及冷冻保存而言，将会严重影响HCV RNA的定量测定，两日后降低明显，5日后HCV RNA定量值直线下滑。另外，实验发现，在高度溶血情况下，丙肝定量对数均值的波动较大，核酸提取效率稳定性差。

三、讨论与分析

1. 保存温度和保存时间对结果的影响：目前用于HCV RNA定量检测的部分商用试剂盒在样本前处理方面，建议不能及时进行HCV RNA测定的应当在离心分离血清后6小时内吸取血清至小管并于-20℃冷冻保存备用，此举在样本量大的情况下无疑给实验室增加了劳动量，并因开盖操作引入了交叉污染的可能，那么真的有这个必要吗？本次实验结果得出如下结论：-20℃保存血清样本，不宜超过1周；在4℃保存，不宜超过3d；在室温下放置（包括运输），不宜超过48h。此结果与庄养林等的研究结果，在4℃和25℃条件下保存时间一致，仅仅在-20℃结论不同，庄养林等认为可保存4周，而我们要求更为严格，仅能稳定一周，这可能取决于各自的核酸提取方法及实验条件的不同。

通常来说，保存时间影响HCV RNA病毒定量的主要原因为RNA病毒核酸受到内源性及外源性RNase的影响。外源性RNase主要来自于空气、皮肤、毛发和被污染的实验台。由于RNA酶的活性受到温度的影响，酶的活性影响酶的反应效率，从而导致了RNA降解速度的改变，低温有助于抑制RNase活性^[9]。

在实际的临床实验室检测过程中，ISO 15189最新版CNAS-CL36（医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明）的附录A.2规定：“自建检测系统不精密度要求：以能力验证/室间质评评价界限（靶值±0.4对数值）作为允许总误差（TEa），重复性精密度＜3/5TEa；中间精密度＜4/5Tea”的相关要求，本次实验以4/5Tea （即“靶值±0.32对数值”）作为可接受定量范围，与统计学显著性相结合，综合两方面的考虑，得出上述最终的实验结论，较单纯使用统计学结论更符合实际需求^[10]。

2. 溶血对结果的影响：关于溶血对HCV RNA定量的影响，有文献指出是通过血红蛋白的卟啉环与Taq酶发生不可逆结合从而抑制了Taq酶活性，影响了RNA的定量测定。本实验研究显示，当保存温度为-20℃、4℃及25℃时，样本中高浓度的血红蛋白（Hb 43g/L）会对HCV RNA定量结果造成一定干扰，但在中、低浓度血红蛋白（Hb≤12g/L）对结果的影响则无统计学意义^[11]。有文献认为，血红蛋白浓度大于8g/L时会影响HCV RNA的检测，而在陈晓华等的研究则认为，溶血组与对照组的检测结果相比差异无统计学意义。对于上述不同的研究结论，我们认为可能原因主要为核酸的提取方法不相同。例如在陈晓华的研究中，选用的核酸提取方法为柱提法，而本次实验我们选用的是磁珠法。另外，刘长利等的采用Roche核酸提取柱提取核酸的研究中，指出柱提法可有效去除血红素分子，避免溶血对结果的影响^[12]。

在此实验中，我们还发现，高浓度血红蛋白组有少量样本未得到有效结果，甚至内标也出现了被抑制而无法检出的情况。猜测可能的原因是当血红蛋白的浓度过高时，血清粘度大，采用磁珠法提取核酸的情况下，血清中的血红蛋白可能会与磁珠粘附，从而影响核酸的提取效率，并且如果提取残液中未清洗干净的血红蛋白混入PCR反应体系可能造成Taq酶受抑制，另外，血红蛋白为碱性物质，残留量过大的话也有可能会影响反应液的PH值，从而导致整个反应体系被抑制，样本及内标均无法检出。因此，选择合适的核酸提取方法及设备并正确维护对于降低溶血等因素对于HCV RNA定量检测的干扰至为重要^[13]。

3. 综合因素的影响：通过对保存温度和血红蛋白浓度的主效应进行统计分析，我们发现一个现象，当保存温度为-20℃和4℃时，溶血对定量结果的影响差异有显著性，但当保存温度为室温时，溶血的影响却不再具有显著性差异。对于这一现象，目前在其他研究中暂未发现。我们怀疑可能的原因是，室温下血红蛋白的活性随保存时间的延长有极大的降低，可能是内、外源性酶的影响或者微生物的影响，也不排除操作不当及误差造成影响的可能，对于相关问题，有待于我们进一步研究^[14]。此外，本次研究还发现，当保存温度为4℃和25℃，在第24h时HCV RNA定量结果均出现轻微反弹，而非如预期般随着时间而一直持续下降的趋势。对此我们考虑是否是实验过程中操作不当造成的误差^[15]。但在其他文献中也曾出现过与此相似的报道，如在Gessoni等的研究中，4/6的丙肝定量标本在24h后结果出现上升，而在之后又逐渐下降；在姚凤兰等的研究中也出现了类似的情况^[16]。但目前对于这种现象发生的原因还不清楚^[17]。

总而言之，标本的前处理在HCV RNA定量检测中有重要意义，标本的接收和保存是整个质量控制体系中第一环。在临床检验实践工作中，我们应将本次实验研究结果与ISO 15189质控规定相结合，制订合理可行的标本接收及保存规范，从前处理开始，做好质量控制的第一步，从而提高HCV RNA定量检测的准确性。    

四、结论

1. 保存温度和保存时间对HCV RNA定量的影响：对于HCV RNA定量检测而言，温度越低越有利于标本保存，保存时间越长标本中核酸降解的越多，定量值越偏离真实值。具体规定：在-20℃保存的血清样本，不宜超过1周；在4℃保存，不宜超过3d；在室温下放置，不宜超过48h；更长时间的保存建议放在-80℃下。

2. 溶血对HCV RNA定量的影响：实验室在接收样本做HCV RNA定量检测时，如果发现溶血样本，重度溶血可考虑让临床重新抽血送检。轻微溶血情况下（Hb 3g/L、Hb 12g/L）应及时检测，结果影响不大，不能及时检测的应当低温保存，并于规定时间内检测。

参考文献

1. 陈暖, 张俏忻, 程碧珍. 标本预处理对HCV-RNA检测结果的影响[J]. 中国校医, 2015, 29(05):386+388. 

2. 刘晓, 许琳婧, 孙丽萍. 标本保存对实时荧光定量HCV-RNA检测的影响[J]. 中国医疗前沿, 2013, 8(22):73-74.

3. 熊玉娟, 周华友. 不同保存条件对丙型肝炎病毒核酸稳定性的影响[J]. 中国输血杂志, 2012, 25(06):549-552.

4. 陈晓华, 赵田. 影响FQ-PCR检测HCV RNA结果的标本因素[J]. 中国误诊学杂志, 2010, 10(04):798-799.

5. 高会广. 标本因素对实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒RNA的影响[A]. 中华医学会、中华医学会检验分会.中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C]. 中华医学会、中华医学会检验分会, 2008:1.

6. 陆应玉, 李京培, 王明丽, 史百芬, 陈禹保. 逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析[J]. 安徽医科大学学报, 2000, (03):202-204. 

7. 徐皖苏, 杨公炜, 王丽, 谢玮. 不同保存条件下血清荧光定量检测HCV RNA的研究[J]. 预防医学文献信息, 2004, (01):60-62.

8. 庄养林, 熊丽红, 张鹏飞, 王芳, 陈丹, 施桥发. 标本因素及保存条件对HCV RNA检测的影响[J]. 实验与检验医学, 2017, 35(02):228-230+238.

9. 李金明, 王露楠, 邓巍. 标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响[J]. 中华检验医学杂志, 2000(06):16-18.

10. 龚晓燕. 溶血标本不同游离Hb浓度对抗-HCV检测结果的影响[A]. 中国输血协会. 中国输血协会第四届输血大会论文集[C]. 中国输血协会, 2006:1.

11. 罗祖军, 邹德学, 王强, 蔡仲仁, 薛燕芬, 林棋荣. 标本溶血对生化检验结果的干扰和影响及对策研究[J]. 重庆医学, 2014, 43(22):2879-2880+2883.

12. 姚凤兰, 陈瑜, 汪德海, 冷婵, 查祎, 张莉, 王中梅, 杨海平, 郑静, 葛红卫. 标本保存温度、时间和不同采血管对核酸检测结果的影响[J]. 中国输血杂志, 2012, 25(06):530-533.

13. 刘长利, 任芙蓉, 吕秋霜, 龚晓燕, 王卓妍. 对丙型肝炎病毒核酸稳定性的研究[J]. 临床输血与检验, 2007(03):217-221.

14. Neumaier,M,Braun,A,Wagener,C.Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. International Federation of Clinical Chemistry Scientific Division Committee on Molecular Biology Techniques.[J].Clinical Chemistry, 1998, 44(1):12-26.

15. Schulze TJ , Weiss C , Luhm J , Brockmann C , Görg S , Hennig H .Preanalytical stability of HIV-1 and HCV RNA: impact of storage and plasma separation from cells on blood donation testing by NAT.[J] Transfusion Medicine, 2011, 21, 99-106

16. KenanSener, Mehmet Yapar,OrhanBedir, CemGul¨O¨merCoskun, AyhanKubar.Stability of Hepatitis C Virus RNA in Blood Samples by TaqManReal-Time PCR[J]Journal of Clinical Laboratory Analysis 24:134-138 (2010)

17. G. Gessoni, P. Barin, A. Frigato, M. Fezzi, G. de Fusco,N. Arreghini, P. Galli.G. Marchiori.The stability of hepatitis C virus RNA after storage at +4℃[J] Journal of Viral Hepatitis, 2000, 7, 283-286