抗磷脂抗体谱检测诊断标准与新型检测技术在临床诊疗中的应用
张蜀澜，北京协和医院副研究员，硕士研究生导师。北京医学会检验医学分会青年委员会委员，中国中西医结合学会检验医学专业委员会青年委员，中国医疗保健国际交流促进会风湿免疫病学分会委员。主要从事自身免疫性疾病的临床实验诊断、检测技术的标准化以及自身免疫性疾病发病机制研究。
徐洪琳，北京协和医院研究生，主要从事自身免疫性疾病发病机制和相关生物标志物的研究。
抗磷脂抗体（antiphospholipid antibodies，aPLs）是一组以磷脂和/或磷脂结合蛋白为靶抗原的自身抗体总称，诊断标准aPLs包括狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）、IgG或IgM型抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibodies，aCL）、IgG或IgM型抗β2糖蛋白Ⅰ抗体（anti-β2 glycoprotein Ⅰ antibodies，aβ2GPI），是抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrom，APS）的重要生物标志物，用于临床诊断、风险评估和指导治疗。目前，抗aβ2GPI结构域1和抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原抗体等非诊断标准抗体诊断是应用前景较好的潜在生物标志物。但是aPLs实验室检测仍面临许多挑战：血清阴性但临床高度怀疑的APS患者缺少有效的生物标志物，低滴度或短暂aPLs阳性的疑似APS患者因不符合实验室诊断标准可能会漏诊，此外，由于APS疾病谱复杂多样，aPLs缺少统一的检测方法和cut-off值，研究结果间一致性较差，限制了新型自身抗体的临床应用。因此，需要更多更完善的临床研究确定抗磷脂抗体与血栓形成和病理妊娠的关系，同时寻找新型生物标志物和检测技术，提高aPLs的诊断性能，促进APS诊断。
一、诊断标准抗体的临床应用
1. APS诊断标准和专家共识：依据2006年悉尼修订分类标准，APS诊断至少满足一项临床标准和一项实验室标准。临床指标包括血栓形成和病理妊娠，实验室标准规定至少在血清中检测一种中至高滴度aPLs，包括LA、IgG/IgM型aCL、IgG/IgM型aβ2GPI，抗体滴度需大于40GPL或MPL或者大于第99百分位数，必须间隔12周且有两次或两次以上的阳性结果[1]。
aPLs还可以应用于血栓和病理妊娠的风险评估。现有APS风险评估标准包含抗磷脂抗体评分（aPLS）和调整后国际抗磷脂综合征评分（aGAPSS）[2，3]。aPLS得分越高，提示血栓发生风险越高。但是评估标准中规定中高水平抗体滴度的cut-off值，没有考虑到各实验室应该结合本实验室的试剂和仪器，建立合适的cut-off值。此外，aPLS评分表只包括诊断标准抗磷脂抗体和抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体（anti phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT），纳入的危险因素不全面，因而临床应用范围受限。aGAPSS评分标准包括高脂血症、高血压和诊断标准抗磷脂抗体，可以识别有复发性血栓形成风险和心血管疾病发生风险的APS患者，但是未区分IgG和/或IgM型aPLs，未纳入静脉血栓等危险因素。因此，第16届国际抗磷脂抗体大会工作组认为以上风险评估标准有助于辅助临床决策，推进APS诊断标准化，同时也需考虑个体之间的差异，结合不同患者的具体情况，使用合理恰当的治疗方案[4]。
2019年欧洲抗风湿病联盟提出APS临床管理的3个首要原则[5]：（1）aPLs阳性个体的风险评估应包括高风险的aPLs，血栓和病理妊娠史，伴发其它自身免疫性疾病和传统心血管危险因素。（2）应该筛查和严格控制aPLs阳性患者的心血管危险因素，特别是高风险aPLs阳性的手术、住院、长期卧床和围产期患者，还需注意预防静脉血栓，使用低分子量肝素。（3）询问患者的治疗依从性对APS临床管理十分重要。
产科APS的临床表现复杂，临床诊断很大程度上依赖于实验室检测结果。近期一项meta分析验证LA是APS患者晚期流产危险因素（OR5.02，95%CI 2.14-7.89），但缺少足够的证据证明aβ2GPI和aCL（OR2.27，95%CI 1.20-3.44）与晚期流产相关[6]。另一项研究显示，孕早期aCL IgG＞40UI/ml （OR4.4，95%CI 1.3,14.4）、LA阳性（OR6.5，95%CI 1.3,3.33）和＜34周子痫前期病史（OR32.4，95%CI 6.5,161）是孕早期重症母体血管灌注不良的独立危险因素[7]。第16届抗磷脂抗体大会中，专家认为基于目前循证医学证据，不能确定aPLs与复发性早期流产、不明原因的胎儿死亡的联系。临床研究中存在产科APS临床表现异质性强、实验室检测方法缺乏统一标准以及不同实验室定量结果不可比等局限性，所以需要更完善严谨的临床研究设计，更好地确定aPLs与非特异性病理妊娠表现的关系[8]。
2. aPLs与新冠肺炎：Zhang等[9]首先在3例重症新冠肺炎患者血清中发现高滴度的IgA型aCL和IgG/IgM型aβ2GPI，临床表现出明显凝血异常及多发栓塞事件，提示aPLs出现可能与病毒诱发的免疫紊乱有关，并发血栓事件提示免疫紊乱与凝血异常存在密切联系。一项纳入66例新冠肺炎重症患者和13例轻症患者的研究显示aPLs仅出现在新冠肺炎重症患者血清中，发病后大约35-39天可见，IgA型aβ2GPI是最常见的类型，阳性率为28.8%（19/66），其次为IgA aCL（25.8%）和IgG型aβ2GPI（18.2%）[10]。一项系统综述总结新冠肺炎患者血清中aPLs阳性率和变化情况：不同研究中aPLs的阳性率差异较大，35%-92%的重症患者血清LA阳性，1%-12%患者三种抗体均为阳性，IgA亚型aPLs阳性率更高。aPLs阳性率和类型随着患者病程改变，3-6个月后42名LA阳性患者抗体全部转阴，而aβ2GPI和aCL持续时间较长[11]。长期随访aPL阳性的感染者有助于理解新冠肺炎的发病机制。
aPLs在COVID-19相关血栓事件中的作用有待研究。部分研究提示aPLs与血栓发生和炎症反应程度有关，Ferrari等发现重症和非重症患者血清中aPL各亚型阳性率无明显差异[12]。小鼠模型中，COVID-19患者来源的aPL可结合细胞膜表面的溶血磷脂酸，通过EPCR受体刺激单核细胞和内皮细胞，发挥炎症和促进血栓形成的作用[13]。考虑到炎症急性期和口服抗凝剂可能会干扰LA检测结果，慢性基础疾病的老年人群中血清aPL阳性率更高，同时也是新冠病毒易感人群，所以，仍需要更多的研究为合理解释重症病人的阳性结果提供依据。
二、非诊断标准抗体
1．IgA型抗磷脂抗体谱：IgG/M亚型的识别aβ2GPI结构域1（domain 1，D1）的精氨酸39-甘氨酸43表位，IgA型aβ2GPI更倾向结合D3、D4和D5[14]。使用IgA型aPLs是否可以增加aPLs的诊断准确性存在一定争议。在一项纳入1068例患者的临床多中心研究中，IgA型aCL和aβ2GPI与血栓形成和病理妊娠相关，但是单独IgA型aPL在APS患者的阳性率仅有0.3%-5%，与临床表现无相关性。纳入IgA型aCL和/或aβ2GPI抗体后，aPLs与APS的关联强度没有明显改变（纳入前：OR=2.9，95%CI：2.2-3.9；纳入后OR=2.8，95%CI：2.1-3.7）[15]。Charis等用ELISA检测aPL，结果显示IgG-aβ2GPI诊断价值最好（LR=14.8），其次是IgA-aβ2GPI（LR=14.4），IgM-aβ2GPI的LR为13.3[16]。目前研究结果不足以支持将IgA型aPLs纳入常规临床检测。
2．抗β2GPI结构域1和结构域4/5抗体：β2糖蛋白是由5个结构域组成的阴离子糖蛋白，与磷脂结合后构象发生改变，暴露出D1，诱发机体产生aβ2GPI-D1。动物实验证明注射aD1的小鼠Russell蝰蛇毒稀释时间延长，但是抗D2-5抗体则不表现出促凝活性[17]。纯化的抗D5抗体不识别与心磷脂结合的β2糖蛋白，竞争结合游离β2糖蛋白，表现出保护效应[18]。临床研究发现与APS患者相比，无症状aPLs携带者血清中IgG型抗D4/5抗体阳性率和滴度更高，相反，aD1在三种抗体全部阳性组和高滴度组的阳性率更高，aD1和aD4/5比值≥1.5是自身免疫性疾病的危险因素（OR3.25 95%CI：1.45-7.49，P=0.005）[19]。但是该研究未发现aD4/5与APS的临床表现相关，所以需要更多研究寻找aD4/5的临床价值。
aD1是具有良好临床应用前景的APS非诊断标准抗体，与血栓形成相关，诊断特异性较高。由于不同研究设计的检测方法和人群存在差异，aD1和病理妊娠的相关性仍有争议。Zhang等[20]发现原发性APS患者aD1阳性率为48.6%，非APS相关血栓和病理妊娠的患者中aD1均为阴性，提示aD1可以区分血栓型APS和其它原因的血栓形成。aD1是血栓形成的危险因素（OR3.27 95%CI：1.59-6.71），aPLs三阳性组的aD1滴度更高，明显高于双阳性和单阳性组，但是未发现与病理妊娠有关。此外，单独使用aD1可能会漏诊，大约20% aβ2GPI阳性患者中aD1为阴性，所以建议将aD1作为确证实验，以提高诊断特异性[21]。
3. 抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原抗体（antibodiesto phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT）：aPS/PT是临床应用前景较好的非诊断标准抗体。第16届国际抗磷脂抗体大会工作组建议临床高度怀疑为APS的患者检测aPS/PT抗体，IgG/IgM型aPS/PT也被用于APS风险评估[22]。Zhang等研究发现aPS/PT在血清阴性的原发性APS患者中的阳性率为13.3%，继发性APS患者的阳性率为31.3%，IgG aPS/PT诊断灵敏度和特异性分别为36.9%和95.7%，阳性似然比为8.49，优于IgM型aPLs，提示aPS/PT可以提高APS诊断性能。IgG aPS/PT阳性患者发生血栓的风险比抗体阴性患者高2.55倍（95%CI 1.57-4.14），aPS/PT辅助诊断血清学阴性但临床高度怀疑的APS患者，可以避免漏诊，并预估血栓发生风险[23]。aPS/PT也与妊娠异常相关。一项meta分析汇总2012-2019年间7项有关aPS/PT和病理妊娠的研究，共纳入457名APS患者和931名临床怀疑为APS的患者。IgG/IgM aPS/PT与病理妊娠显著相关（OR10.6，95%CI 3.54-35.38，p＜0.05）[24]。
LA的检测受口服抗凝剂或维生素K拮抗剂的干扰，因此指南建议在抗凝治疗结束后检测LA，但是这给评估治疗效果带来困难。Sciascia等人比较四家实验室重复检测抗磷脂抗体的一致性，结果显示aPS/PT检测一致性优于LA（83%和55%），接受维生素K拮抗剂治疗的患者LA检测一致性只有25%，而aPS/PT为90%[25]。因此，当缺乏可信的LA结果时，aPS/PT是一种很好的补充实验。目前，aPS/PT未纳入常规检测，不同研究之间aPS/PT结果一致性差异较大。
4．抗膜联蛋白A5抗体：膜联蛋白5（Annexins 5）是与磷脂结合的钙离子依赖性蛋白，覆盖在胎盘滋养层细胞和血管内皮细胞表面，发挥抗凝血活性。膜联蛋白A5抵抗（AnxA5R）是APS发病机制之一，抗A5抗体通过破坏细胞膜表面的抗凝血屏障，暴露膜表面磷脂层，从而加速血小板促凝活性，导致血栓形成。A5R（含膜联蛋白A5的血浆凝血时间与不含A5凝血时间的比值）越小，表示抗体浓度越高，膜联蛋白A5抵抗越严重。与对照组相比，高滴度aPLs组和多重aPLs阳性组的A5R明显降低，说明aPLs阳性与A5抵抗相关，提示A5R可用于识别有血栓发生风险的患者，区分aPLs携带者[26]。目前针对A5抗体的临床研究结果间存在一定差异，A5抗体的临床价值仍存在争议。一项meta分析显示AnxA5R在APS患者中阳性率为53.3%，高于疾病对照组（21.1%）[27]。另一项纳入170例APS患者、104例疾病对照者和39例健康对照者的研究中，IgG和IgM型抗A5抗体的灵敏度和特异性分别为33.5%和15.3%，99.0%和99.0%，IgG型抗A5抗体与动静脉血栓相关，但未发现该抗体与病理妊娠存在相关性[28]。考虑到A5与APS发病机制相关，诊断特异性较好，联合使用该抗体与诊断标准aPLs可提高APS诊断灵敏度和特异性，因此抗膜联蛋白A5抗体是辅助APS诊断的潜在标志物。
5. 抗波形蛋白/心磷脂复合物抗体（anti vimentin/cardiolipin antibody，aVim/CL）：波形蛋白是细胞骨架中最丰富的三型中间纤维，定位于凋亡的中性粒细胞和T细胞表面以及活化的巨噬细胞、血小板和血管内皮细胞表面。aVim/CL介导TLR4/IRAK/Nf-kB信号通路，促进内皮细胞表达促炎因子和促凝因子，可能在血栓形成中发挥作用[29]。目前aVim/CL抗体与APS关联性研究较少。Capozzi等[30]在APS和血清阴性APS患者中发现IgA型aVim/CL，阳性率分别为40%（12/30）和26.7%的（16/60）。IgA型aVim/CL阳性的血清阴性APS 患者更易发动脉血栓（p=0.017，LR+=5.7），IgG型aVim/CL诊断产科APS准确性较好（p=0.039，LR+=4.24），推测aVim/CL是诊断血清阴性APS的潜在生物标志物。还需要更多研究确定aVim/CL抗体临床应用价值。降低产科APS患者的复发性流产率，需要多学科互助，而高灵敏度的检测方法有利于及时发现aPLs，对临床医生准确评估病情，调整治疗方案至关重要[31]。
6．抗蛋白C和蛋白S抗体：蛋白C和蛋白S是体内抗凝系统成分之一。凝血酶-血栓调节蛋白复合物激活蛋白C，活化的蛋白C在辅助因子蛋白S和FⅤ的作用下，通过蛋白水解作用失活FⅤa和FⅧa，从而发挥抗凝作用。aPLs由于可干扰蛋白C系统而被认为可能是导致获得性活化蛋白C抵抗（APCR）的因素。APCR与高亲和力的蛋白C抗体与血栓型APS相关。Efthmiou等[32]研究发现抗组织因子途径抑制物抗体和抗蛋白C抗体与APS患者严重血栓事件的发生相关（OR：20.2，95%CI 2.0-47.0，p＜0.0001）。尽管研究证实遗传性APCR，如FⅤ雷登突变和蛋白S缺陷与复发性流产相关[33]，但是获得性APCR与产科APS的相关性研究较少，抗蛋白C和蛋白S抗体与妊娠异常的关系还需进一步研究。
7．其它：aPL是一组异质性抗体，依据靶抗原性质分类如下：1、抗阴性磷脂抗体，包括抗心磷脂抗体（aCL），抗磷脂酰丝氨酸抗体（aPS），抗磷脂酸抗体（aPA），抗磷脂酰肌醇抗体（aPI）；2、抗中性磷脂抗体，如抗磷脂酰胆碱抗体（aPC）；3、抗两性磷脂抗体，如抗磷脂酰乙醇胺抗体（aPE）和抗磷脂结合蛋白抗体。PE是细胞膜磷脂的主要成分，具有抗凝作用。1705名伴复发性流产史的患者血清中IgG和IgM aPE阳性率分别为6.87%和13.6%，12周后复查，31.5%和37.6%IgG和IgM aPE转阴。aPE持续阳性患者的流产率明显高于aPE暂时阳性组，当不考虑抗体持续时间时，aPE阳性和阴性患者的流产率无明显差异，所以，aPE抗体持续阳性可能与复发性流产相关[34]。
ELISA法检测229例受试人群中非诊断标准aPLs，包括aPE、aPS、aPI、aPC和抗鞘磷脂抗体（aSM）。86名APS患者血清中aPI阳性率最高为50%，aPE阳性率最低为8.1%。IgG-aPC阳性似然比最高为24.94，其次为IgM-aSM（LR=14.97）。IgG aPS、IgM aPS、IgG aPI和IgG aPC是动脉血栓发生的危险因素，尚未发现抗体与病理妊娠存在相关性[35]。目前，以上抗体与APS的相关性存在极大不确定性，缺少统一标准化的检测方法。从检测原理来看，包被在固相介质上的阴性磷脂和β2GPI结合，为待测抗体提供阴离子抗原表位，因此可检测的aPS、aPI和aPA均为β2GPI依赖性抗体，联合使用这些抗体是否可以增加IgG/IgM aβ2GPI的诊断效能还需进一步研究[21]。
三、抗磷脂抗体谱检测的新型检测技术
抗磷脂抗体检测的传统方法是ELISA，狼疮抗凝物检测包括筛选、混合和确证实验，如稀释的凝血酶原时间，活化部分凝血活酶时间，以及Russell蝰蛇毒稀释时间。实验室检测面临着缺乏国际通用检测指南、不同实验室间存在方法学的差异、实验室间检测结果缺乏可比性、易出现假阴性和假阳性等问题。受aPL检测的局限性的影响，大量非诊断标准的aPLs的临床研究结果存在较大差异，影响新型生物标志物在临床上广泛应用，因此，了解和应用新型检测技术，进一步提高抗体检测能力，对于aPLs的临床应用十分重要。
1. 化学发光法（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）：CLIA是一种定量检测技术，基于抗原抗体特异性结合原理，将待测抗原包被在磁微粒上，与待测血浆中自身抗体反应。CLIA检测灵敏度高，特异性较好，可自动化，目前在临床上广泛使用。应用CLIA和ELISA对227例入组样本检测IgA/IgG/IgM型aCL和aβ2GPI。结果显示CLIA和ELISA检测IgA/IgG/IgM型aCL和IgM/IgA型aβ2GPI的一致性较好，kappa值0.52-0.77，IgG型aβ2GPI一致性较差（kappa=0.2），CLIA检测结果高于ELISA。两种方法的定量检测结果相关，rho值为0.51到0.87，P＜0.001。CLIA法IgG型aβ2GPI诊断APS灵敏度最高，为63.1%，其次是IgG型aCL（48.8%），说明CLIA可以满足临床对于aPLs定量检测的需要[36]。Nafai等[37]发现CLIA检测IgG型aCL的灵敏度最好，IgG型aCL和aβ2GPI双阳性可用于评估血栓风险，R=3.394，95% CI：1.631-6.974。不同的是，CLIA和两种ELISA试剂盒检测IgG型aCL符合率较好，kappa值分别为0.859和0.726。
2. 多重流式荧光免疫分析（Multiplex flow Fluorescence Immunoassay，MFFIA）：MFFIA是一项在流式细胞术的基础上发展起来的新技术，可用于检测多种自身抗体。荧光染料将聚苯乙烯微球染成不同颜色，微球上包被不同抗原，与待测血清中自身抗体特异性结合，利用荧光二抗显色。检测系统中，微球成列通过两束激光，一束激光依据微球颜色判断自身抗体种类，另一束激光依据荧光强度计算抗体含量。研究人员纳入134例自身免疫病患者，评估MFFIA和CLIA检测一致性。两种方法检测IgG型aCL和aβ2GPI的总体符合率分别为88.1%和97.8%，kappa值分别为0.57和0.91，一致性较好[38]。但是该研究仅包括定性研究数据，还需要研究评价MFFIA的诊断准确性。
3. 线性免疫印迹法（Line Immunoassay，LIA）：线性免疫印迹法是一种多重检测技术。LIA的多孔疏水性膜结合磷脂的疏水端，另一侧的亲水端与自身β2GPI结合，使得β2GPI构象发生改变，被抗β2GPI结构域1抗体识别。与传统ELISA相比，LIA可同时检测10种抗体，大大减少工作量和试剂成本，便于实现高通量检测。LIA和ELISA检测IgG型aCL和aβ2GPI一致性较好，kappa分别为0.69和0.68，LIA法检测抗磷脂酰甘油抗体可以区分APS患者和无症状的aPL携带者，AUC=0.72[39]。研究人员使用CLIA、ELISA和LIA检测53例APS和34例健康对照的aPLs，LIA检测诊断标准aPLs的灵敏度和特异性与其它方法无明显差异，部分非诊断标准aPLs的敏感性明显高于其他方法，如aPA、aPI、IgG aPS和IgM aPA[40]。因此，LIA是ELISA检测aPLs的潜在替代方法。
4. 薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，TLC）：TLC是一种吸附薄层色谱分离方法，利用各组分对同一吸附剂吸附能力的不同，达到分离目的。TLC检测抗体基于以下三个步骤：抗原分离，待测抗体免疫染色，化学发光免疫法检测免疫原性，是一种定性检测方法。与ELISA相比，TLC固相载体为铝板，可能会增加磷脂与抗体结合位点[41]。TLC可用于血清学阴性APS患者抗体二次筛查，研究发现在血清学阴性的产科APS患者中TLC检测aCL的阳性率为76%，aCL/Vim阳性率为54%，aPS/PT阳性率为12%，说明TLC较ELISA更灵敏，有利于及时发现血清学阴性的产科APS患者[31]。
5.荧光酶免疫法（Fluorescence Enzyme Immunoassay，FEIA）：荧光酶免疫法是基于ELISA检测原理，通过测定酶催化荧光底物发出的荧光强度而建立的一种定量检测技术，较ELISA更灵敏，检测方法更易于标准化。研究人员用FEIA和ELISA检测IgG/IgM型aCL和aβ2GPI，两种方法的符合率较好，kappa值0.44-0.79，但是FEIA检测IgM型aCL灵敏度低于传统ELISA，分别为18.1%和33%，P=0.02，特异性与无明显差异，均大于90%。65例血清学阴性的APS患者与165例对照人群相比，FEIA没有明显提高aPLs检出率，说明FEIA与ELISA性能相似，能否增加APS诊断准确性尚需进一步研究[42]。Mattia等[43]人使用FEIA检测IgA型aCL和aβ2GPI，84例原发性APS患者中抗体阳性率分别为19%和50%，66例血清学阴性的APS患者中抗体阳性率分别为4.5%和10.6%，血栓型APS患者IgA型aβ2GPI阳性率明显高于产科型APS，P=0.008，然而，研究中没有提供ELISA检测IgA型aPLs的结果，无法比较在血清学阴性APS人群中FEIA检测性能，因此需进一步研究比较FEIA和ELISA检测IgA型aPLs的价值，发现IgA型aPLs的临床应用新方向。
综上，本文从抗磷脂综合征的诊断标准和专家共识出发，着重探讨近年来新型抗磷脂抗体和检测技术的临床应用进展。一些临床应用前景较好的非诊断标准抗体如抗β2GPI结构域1抗体和aPS/PT，可以辅助APS临床诊断，特别是血清学阴性但临床高度怀疑的APS患者。新型检测技术在提高抗磷脂抗体诊断性能中发挥重要作用，如多重流式荧光免疫分析和线性免疫印迹分析可以弥补ELISA通量低，标准化程度低等缺陷，薄层色谱分析可以提高检测灵敏度，有利于检出血清学阴性的APS患者，避免漏诊。但是关于抗磷脂抗体临床应用的研究存在一定争议，实验室检测仍面临许多问题，因此，需要更多更严谨的研究进一步探索新型抗磷脂抗体在APS发病机制、临床诊断、风险评估中的作用。
