肾脏自身免疫病实验室诊断技术与临床应用意义

罗静，医学博士，硕士研究生导师，主任技师/医师。风湿免疫研究省级重点培育实验室主任，山西省学术技术带头人，山西省三晋英才拔尖骨干人才，山西省卫生计划生育委员会百千万卫生人才培养工程骨干精英人才，美国佛罗里达大学和西北大学访问学者。兼任中国医师协会风湿免疫科医师分会第一届青年委员、世界华人检验与病理医师协会委员、中国中西医结合学会检验医学专业委员会委员、中国研究型医院学会检验医学专业委员会临床免疫学组委员、山西省免疫学会常务理事、山西省临床免疫学会副主任委员、山西省医师协会检验医师分会常委兼任副总干事、《中华临床免疫和变态反应杂志》青年编委。近年来负责国家级、卫生部及省院级研究课题10余项，获山西省科技进步奖6项，发表中英文论文60余篇，其中SCI第一作者或通讯作者19篇，主译人卫出版社《Autoantibodies》中文版第3版，参与编写《免疫微生态学》，获国家发明专利2项。

秦艳，山西医科大学临床检验诊断学硕士，师从罗静教授，在读期间获国家奖学金，以第一作者发表SCI 3篇，参与编写《免疫微生态学》。

肾脏疾病是全世界最重要的非传染性疾病之一，大约10%的人口患有慢性肾病[1]。中国成人肾病患病率为10.8%，中部地区更甚，达14.2%[2]。与自身免疫反应有关的肾脏疾病包括肾脏特异性的自身免疫性疾病和全身自身免疫反应性疾病在肾脏的表现，如狼疮肾炎（Lupus nephritis，LN）、系统性血管炎、膜性肾病（Membranous nephropathy，MN）及IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）[3-6]。近年的研究从细胞水平、分子水平及基因水平揭示了免疫反应在此类疾病中的作用。LN是系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者最严重的肾脏合并症，是最常见的继发性肾小球肾炎，主要临床表现有肉眼血尿、蛋白尿、肾病综合征、严重高血压、水肿和急性肾损伤等[3, 7]。由ANCAs引起的肾小球肾炎合并血管炎是50岁以上患者肾小球肾炎的最常见形式[4]。MN常见于成人，IgAN在年轻人中更为普遍，是最常见的原发性肾小球肾炎[8]。

目前，临床医生主要根据患者临床表现、肾活检及实验室检测的一种或多种特异性或标志性自身抗体来诊断肾脏自身免疫病。自身抗体的产生是肾脏自身免疫病的一个标志性特征。自身抗体的水平不仅有助于疾病的诊断，还可反映疾病的严重程度，在病情评估中发挥重要作用。目前，自身抗体检测已在国内外实验室普遍开展，其检测方法、试剂质量、仪器设备和操作人员等因素，直接关系检测结果的可靠性，可能影响临床医师对结果的判读。大多数应用于临床的自身抗体都可通过间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence，IIF），酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），免疫印迹（Line immunoassay，LIA）或化学发光分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）进行检测。近年来，随着自身抗体在自身免疫病诊断中的应用日益广泛，新颖的抗体检测方法也逐渐被发展和商业化，其中，流式荧光发光法（multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay，MBFFI）和磁条码免疫荧光发光法（magnetic bar code immunofluorescence assay，MBC-IF）等分析技术因具有自动化、高通量、可定量等特点在检测自身抗体中显现出一定优势。

一、狼疮肾炎

1. 抗dsDNA抗体与狼疮肾炎：（1）抗dsDNA抗体与LN：抗dsDNA抗体是诊断狼疮的重要指标，也是SLE和LN的重要分类标准，在LN发病、诊断中发挥重要作用[9]。大量的研究表明，抗dsDNA可以结合肾脏的不同成分，如可以直接靶向作用于系膜细胞和近端肾小管上皮细胞表达的膜联蛋白II、α-肌动蛋白和层粘连蛋白等，也可间接与GBM结合，诱导促炎细胞因子的分泌，介导肾脏的免疫损伤[10]。研究表明，活动性肾炎患者的肾小球组织中可检测到抗dsDNA抗体，且抗dsDNA抗体滴度与LN的活动性相关[11]。一项针对202人的研究发现，抗dsDNA的IgG/IgM比值可能是区分LN患者和SLE患者的有用工具，非LN患者比值小于0.1，比值大于0.8与LN和患者预后不良相关[12]。综上所述，这些证据表明抗dsDNA抗体在LN病理生理学中发挥重要作用，抗dsDNA抗体可作为血清生物标志物广泛应用于LN的诊断。（2）抗dsDNA抗体的检测：用于抗dsDNA抗体检测的技术主要包括IIF，ELISA和放射免疫[13]。用绿蝇短膜虫作为抗原基质进行IIF检测，是目前国内外临床常规检测抗dsDNA抗体最常用的方法，也是最特异和最敏感的方法。CLIA是近10年来发展迅速的微量测定技术，具有灵敏度高，标记物稳定，自动化等优点，在多数临床实验室已被用于抗dsDNA抗体的检测。此外，MBFFI和MBC-IF分析技术蓬勃发展，也被应用于抗dsDNA抗体的检测。MBFFI是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型高通量发光检测技术，该技术有机整合了荧光编码微球、激光检测、应用流体学、高速数字信号处理等多项技术，又称悬浮阵列、液态芯片、液芯以及xMAP技术等。MBC-IF技术将不同抗原分别包被于具有不同编码的磁条码表面，具有多指标联合检测、通量高、速度快、标本用量少等多种优点。

2. 抗C1q抗体：（1）抗C1q抗体与LN：抗C1q在肾损害的发病机制中起着关键作用，是肾纤维化的辅助佐剂，促进肾脏疾病的发展。研究证实约1/3的SLE患者和超过90%的增殖性LN患者中，可以检测到抗C1q，且抗C1q水平在SLE和LN中显著升高，尤其是活动性LN患者，表明抗C1q抗体与疾病活动性密切相关[14, 15]。在无抗C1q的情况下，发生严重LN的可能性很小，阴性预测值高达100%，抗C1q似乎是增殖性LN发展的一个必要但不充分的因素[16]。进一步，研究发现抗C1q抗体与抗dsDNA和SLE疾病活性指数均呈正相关，与C3、C4呈显著负相关[17, 18]。Orbai等人发现抗C1q、抗dsDNA和低补体血症的联合与肾脏受累有关[19]。抗C1q抗体反映LN活性，其升高被发现是LN突变的可靠预测因子，敏感性可达80.5%，特异性为71%[20]。Yin等人的一项meta分析纳入2502例SLE患者和1317例LN患者定量评估抗C1q的诊断性能，证实抗C1q在增生性LN发展中的作用，并强调了其作为LN和疾病活动预测因子的潜力[21]。抗C1q不仅与LN的疾病活动度相关，而且与治疗的有效性相关。一旦患者接受正确的治疗，抗C1q呈下降趋势[22]。在最近的一项针对SLE中出现的抗C1q的表位定位的研究中，Vanhecke等人确定了一个主要的C1q线性表位，即A08，是LN抗C1q抗体的半隐型表位，对补体经典通路的激活很重要[23]。研究进一步表明中国LN患者血清A08 C1q抗体与疾病活动性和预后相关[24]。（2）抗C1q抗体的检测：抗C1q抗体的检测主要依赖于ELISA，但影响ELISA的因素很多，包被抗原、待检样品、酶标抗体及底物的浓度等都直接关系到ELISA方法的特异性和灵敏度。ELISA包被的C1q抗原不仅可以与血清中的抗C1q抗体结合，还可以与血清中的免疫复合物非特异性结合，这种非特异性结合可以被高盐缓冲液抑制，但高盐缓冲液在减少这种非特异结合的同时，对特异性结合亦有一定的影响[25]。为了规避这一影响，ELISA试剂包被的C1q经过修饰，去掉了与免疫复合物的结合位点，阻止了免疫复合物与C1q的非特异性结合，从而减少了假阳性和假阴性的产生，能够保证较高的敏感性和特异性。此外，MBFFI等技术亦可用于抗C1q抗体的检测。

3. 抗核小体抗体（ANuAs）：（1）ANuAs与LN：ANuAs是诊断SLE的标志抗体之一，与疾病活动性相关，多见于活动性狼疮特别是LN。一项小鼠狼疮模型研究证实，ANuAs比其他抗体更早沉积在GBM上，而且在其他自身抗体出现之前就可被检测到[26]。一项纳入4239例SLE患者和6667例对照的回顾性研究表明ANuA诊断SLE的敏感性和特异性分别为61%和94%[27]。抗dsDNA、ANuAs和组蛋白抗体的同时阳性可能提示SLE患者合并严重肾病，进一步，ANuAs可增加非活动性SLE患者肾脏复发的风险[28, 29]。此外，3191例SLE患者和5529例对照组的回顾性分析显示ANuAs比抗dsDNA更敏感，二者敏感性分别为59.9%和52.4%，且特异性相当，分别为94.9%和94.2%[27]。（2）抗核小体抗体的检测：核小体是构成染色质的基本结构单位，由约146bp的DNA分子缠绕组蛋白八聚体形成，可参与从SLE到LN的致病过程[30]。ANuAs被定义为与组织蛋白暴露在染色质的部分发生反应的抗体，目前，我国《自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见》建议选择ELISA或CLIA对ANuAs进行检测[31]。

二、系统性血管炎

系统性血管炎是一组以血管壁或血管周围组织炎症和坏死为基本特征的临床异质性综合征，包括大动脉炎、中等血管血管炎、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）和抗肾小球基底膜（GBM）抗体病等。目前只有少数自身抗体被常规应用于小血管炎患者的诊断、预后和监测，如ANCA在AAV，抗GBM抗体在抗GBM抗体病，和抗C1q抗体在免疫复合物相关性小血管炎中的作用。

1. ANCA相关性血管炎：（1）ANCA与AAV：AAV是一组以毛细血管、微动脉及微静脉受累为主的系统性血管炎，常累及肾脏，包括肉芽肿性多血管炎（GPA）、显微镜下多血管炎（MPA）和嗜酸性GPA（EGPA）。ANCA是一组以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的抗体的总称，是AAV的敏感和特异性血清学标志物，分为胞浆型ANCA（c-ANCA）和环核型ANCA（p-ANCA）。此外，还有一种不典型xANCA，靶抗原主要为杀菌/渗透性增强蛋白。c-ANCA靶抗原主要为蛋白酶3（PR3），与GPA相关；p-ANCA靶抗原主要为髓过氧化物酶（MPO），通常与MPA和EGPA相关[32]。研究表明，ANCA监测疾病活动可能有助于预测肾小血管炎复发。在肾血管炎的患者中，完全缓解期间PR3-ANCA水平的升高表明复发风险增加，危险比为7.94[33]。Kemna等人发现，在有肾脏受累的AAV患者中，ANCA升高亦与复发相关，危险比达11.9，但非肾脏受累患者中，复发的危险比仅为2.79[34]。此外，研究表明PR3-ANCA可能用于指导AAV的免疫抑制治疗[35]。（2）ANCA的检测：目前，ANCA的实验室检测主要依赖于IIF和ELISA。传统上，乙醇固定中性粒细胞IIF被认为是检测ANCA的参考方法[36]。IIF可产生三种荧光形态的ANCA，中性粒细胞胞质呈粗大颗粒，不均匀分布的荧光则称为c-ANCA阳性；荧光沿中性粒细胞的细胞核周围线状分布，则为p-ANCA；胞浆内细颗粒，均匀分布为xANCA。IIF灵敏度高，但无法判定ANCA的特异靶抗原，且具有一定的主观性。IIF阳性应使用PR3-和MPO-ANCA特异性ELISA检测。ELISA可区分不同靶抗原，特异性好，灵敏度高，是ANCA检测主要手段[37]。在临床应用中，大多数实验室首选IIF进行筛查，再使用ELISA确认靶抗原。但是，2017年修订国际共识建议，对于怀疑GPA和MPA的患者，高质量抗原特异性ELISA或CLIA检测可作为一种初级筛查方法，而不需要IIF[38]。近年来，许多新的抗原特异性免疫检测方法对IIF在ANCA血管炎检测中的地位提出了挑战，如荧光酶免疫检测和多重流式免疫检测ANCA已成为可能[39, 40]。

2. 抗GBM抗体病：（1）抗GBM抗体病与抗GBM抗体：抗GBM抗体病是一种主要累及肾脏和/或肺实质并伴有免疫球蛋白线性沉积及器官功能障碍的少见病，包括肺-肾综合征、急进型肾小球肾炎等[41]。抗GBM抗体是抗GBM抗体病非常特异的生物标志物[42]。研究证实抗GBM抗体可诱发肾小球肾炎，大约三分之一的肺-肾综合征患者抗GBM抗体呈阳性[43]。近年来发现肾小球基底膜IV型胶原的α-3链的非胶原结构域1是其主要的靶抗原，在动物模型中，针对该表位的自身抗体与迅速进展的肾小球肾炎密切相关，但与肺出血的关系不太明显[44]。抗GBM抗体与MPO-ANCA是在相似的环境中发现的，并且在20%-30%抗GBM抗体病患者中，抗GBM抗体与MPO-ANCA同时阳性。（2）抗GBM抗体的检测：检测抗GBM抗体的方法有多种，如IIF、放射免疫法、免疫印迹法及ELISA。目前，建议使用ELISA或以灵长类肾、肺为标准基质的IIF检测[41]。冷冻肾组织IIF检测沉积的抗GBM抗体呈典型荧光线条沿GBM沉积，特异性高，但IIF要求正常人新鲜冰冻肾组织切片为底物，具有来源困难等缺陷[45]。在常规的临床实践中，应用纯化或重组人或牛GBM可溶性蛋白为抗原的ELISA法检测抗GMB抗体是国内外通用和公认的方法，其敏感性和特异性最高，简便易行，并可进行定量检测，对疾病的诊断和疗效判定有重大意义[37, 46]。大约10%的抗GBM抗体病患者没有检测到循环抗体，这可能是由于纯化或重组人或动物GBM制剂在优化后主要检测IgG抗体，对罕见的IgA或IgM介导的抗GBM抗体病可能无法识别[47]。

三、膜性肾病

1. 抗磷脂酶A2受体抗体与膜性肾病：膜性肾病是一组以肾小球基底膜下免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为特点的疾病，约占成人原发性肾病综合征的30%[5]。Beck于2009年在约70%的成年初发MN患者的肾小球蛋白提取物中分离出185kD的蛋白，即M型磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R），并确认了PLA2R作为靶抗原存在于沉积的免疫复合物中，可识别主要为IgG4亚型的抗PLA2R抗体的自身抗体[48]。抗PLA2R抗体是诊断MN高度特异的血清学标记物，抗体滴度可用来监测疾病活动度和治疗效果，高滴度抗体预示肾功能减退的风险增加。一项meta分析显示抗PLA2R抗体诊断MN的敏感度为78%，特异度为99%，阳性预测值几乎与肾活检相当[49]。此外，血清抗PLA2R抗体水平与疾病缓解相关，研究证实疾病缓解患者的抗PLA2R抗体显著低于未缓解患者，且抗PLA2R抗体水平下降常先于尿蛋白减少[50, 51]。一项前瞻性研究发现，血清中总抗PLA2R抗体水平与MN患者预后相关[52]。Bech等的生存分析表明治疗后的血清抗PLA2R抗体水平与5年内MN疾病缓解、复发或死亡结局相关[53]。综上所述，抗PLA2R抗体可用于MN的诊断、治疗评估以及预后随访观察。

2. 抗磷脂酶A2受体抗体的检测：检测抗PLA2R抗体的方法多种多样，如蛋白质印迹、IIF及ELISA等。蛋白质印迹检测抗PLA2R抗体，操作复杂、耗时、不适用于大样本量的临床实验室。目前，建议使用ELISA和以重组细胞为基质的IIF检测抗PLA2R抗体[54]。最常用的检测方法是Euroimmun商业化的ELISA，其特异性为99.6%，可定量检测抗PLA2R抗体水平。IIF比ELISA更为敏感，具有100%的特异性，但不能定量评估[55]。近年来，定位激光小珠免疫测定分析被应用于抗PLA2R抗体的检测，该方法基于免疫荧光技术使用承载着完整重组蛋白质的可定位激光小珠进行检测，具有多指标联合检测、标本用量少等优点[53]。

四、IgA肾病

IgAN是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主，伴或不伴其他类型免疫球蛋白及补体在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球疾病，临床上主要表现为反复发作的肉眼血尿或无症状血尿、蛋白尿，可伴有不同程度的水肿、高血压及肾功能损害[56]。IgAN的发病率在年轻人中最高，并有40%的患者在确诊后的20年内逐步发展至终末期肾病[57]。肾活检病理诊断是诊断IgA肾病的金标准。此外，IgAN的诊断主要是基于系膜IgA的沉积，因此，有大量关于IgA潜在分子机制的研究，研究证实大约50%的IgAN患者血清总IgA升高，但敏感性和特异性均较差[58]。一些新的生物标志物，如半乳糖缺乏的IgA1（Gd-IgA1）、Gd-IgA1抗体、IgA-IgG免疫复合物、CD89、CD71等被证明与IgAN相关，但这些指标尚不能用于预测IgAN发生和指导临床诊断[59, 60]。尽管近年来的临床和实验研究强调Gd-IgA1和Gd-IgA1特异性自身抗体是IgAN诊断和疾病活动性评估的前瞻性生物标志物，但目前尚未转化为标准的临床指标[61]。此外，蛋白尿，血肌酐，补体水平等虽不具特异性，但由于其无创、便捷可反映肾小球功能的一般状态而被广泛用于肾功能的评估。

五、总结与展望

近年来，肾脏自身免疫病的发病率呈上升趋势，尽管发病机制尚不明确，但自身抗体的产生是肾脏自身免疫病患者的重要致病机制。自身抗体的发现有助于肾脏自身免疫病的诊断、疾病分期、预后判断及疗效监测，且相关自身抗体的测定也逐渐广泛的应用到了临床。值得一提的是，尽管大多数自身免疫性疾病的特征抗体已经确定，但在一些自身免疫性疾病中，如IgA肾病，还没有发现针对特定蛋白的自身抗体。因此，还需对自身抗体进行进一步的研究，阐明自身抗体作用于肾脏细胞的靶抗原以及这些抗原与自身抗体结合后的下游反应，更好地了解其致病机制，进一步开发疾病活动监测和治疗的新方法。此外，与肾组织活检的特异性相比，目前发现的自身抗体对肾脏自身免疫病的特异性诊断仍有差距，提高抗体检测的特异性和敏感性至关重要。未来的研究可通过多种自身抗体的联合检测或结合多组学不同标志物，提高肾脏自身免疫病的检出率，更好地评估患者疾病状态，扩大疾病诊断和监测工具，以期帮助选择合适的治疗策略。