补体系统的检测与临床诊疗应用价值

作者:李笑湲 谭颖 于峰
作者单位:北京大学第一医院肾内科 2022-01-13

李笑北京大学第一医院肾内科临床型博士研究生在读。研究方向为狼疮性肾炎、血栓性微血管病的基础与临床研究。


谭颖北京大学第一医院肾内科,副教授,肾内科临检室负责人。主要从事狼疮性肾炎、血栓性微血管病的基础与临床研究。承担国家自然科学基金面上项目、北京市自然科学基金面上项目,近年来发表SCI收录文章40余篇,第一作者/责任作者发表SCI收录论文20余篇。


于峰,医学博士,博士生导师,北京大学第一医院肾内科,北京大学国际医院科研教育部主任,北京大学国际医院大内科副主任,北京大学国际医院肾内科部主任,中国老年学和老年医学学会泌尿和肾病分会副主任委员,中国免疫学会临床免疫分会常务委员,中华预防医学会肾脏病预防与控制专业委员会常务委员,中国医师协会循证医学专业委员会肾科学组委员。目前以第一作者/通讯作者发表SCI收录论著50篇(包括Nat Rev Nephrol. J Am Soc Nephrol. Kidney Int.)。





一、补体系统基本概述


补体系统是固有免疫系统的重要组成部分,是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统,由30多种蛋白质组成[1],广泛存在于血清、组织液和细胞表面,补体系统在机体抵御病原微生物入侵及维持自身稳态方面起着重要作用[2, 3]。补体系统的主要生物学功能有:抵御病原微生物入侵[4],清除循环中的免疫复合物[5],同时也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁[6, 7]


补体系统作为一个复杂而又精密调控的蛋白网络系统,其主要构成组分按照生物功能可分为三类:补体固有成分、补体调节蛋白及补体受体。补体固有成分是指存在于血浆及体液中,参与补体激活的蛋白质,包括:经典途径的C1q、C1r、C1s、C2、C4;旁路途径的B因子、D因子等;凝集素途径的甘露聚糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)等;补体活化的共同组分C3、C5、C6、C7、C8、C9。补体调节蛋白是指参与调节补体活化和效应的一类蛋白分子,主要包括H因子(complement factor H,CFH)、H因子样蛋白1(factor H-like protein 1,FHL1)、H因子相关蛋白(complement factor H-related protein,CFHR)、I因子(complement factor I,CFI)、C4b结合蛋白(C4b binding protein,C4BP)、备解素(properdin)、膜辅蛋白(membrane cofactor protein,MCP)、衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF)、CD59、C1抑制物、及S蛋白等。补体受体指的是存在于不同细胞膜表面,能与补体激活后的活性片段相结合、介导多种生物效应的受体分子,主要包括:C1q受体、C3a受体、C5a受体、CR1、CR2、CR3、CR4和CR5等。


补体固有成分以非活化形式存在于体液中,其活化过程是一个级联放大的酶促反应过程,主要通过以下三条通路完成:经典途径(classical pathway,CP)、旁路途经(alternative pathway,AP)和凝集素途径(lectin pathway,LP)[1]。这三条独立又交叉的途径激活补体产生的活性物质引起调理吞噬、杀伤细胞、介导炎症、调节免疫应答和溶解清除免疫复合物等一系列重要的生物学效应[8]。补体的遗传缺陷、功能障碍或是过度活化与多种疾病的发生和发展过程密切相关[7]。补体成分的检测,对于多种疾病的诊断、治疗、疾病活动度的监测及预后的评估具有重大意义[9]


二、补体成分的检测与与临床意义


补体是由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生,其化学组成均为多糖蛋白。血清中补体蛋白含量约占总球蛋白总量的10%,不同补体成分在血清中的含量差异较大,其中C3含量最高,D因子含量最低。补体的热稳定性较差,56℃、30min即可被灭活,在0~10℃条件下活性只能保持3~4天。多种理化因素如射线、机械因素、酒精等均可对补体的活性产生影响。目前临床上最常用的补体检测方法是测定补体固有成分、补体调节蛋白的浓度、活性,特殊的补体检测还包括对补体自身抗体、补体活化片段或分裂产物的检测以及补体相关的基因检测[10]。临床上常用的检测补体浓度和活性的方法是免疫比浊法、绵羊红细胞溶血实验等[11, 12],而检测补体因子自身抗体的方法主要是包括酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[13]


1. 不同补体途径补体功能或活性检测:补体功能或活性的检测可以评估不同补体途径的激活水平,可以对不同补体途径的总补体活性或单一成分的功能活性进行测定,一般采用溶血实验或ELISA测定。溶血功能实验的基本原理是补体激活形成膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)后导致细胞溶解。CH50检测的是补体经典途径的溶血活性,主要反映经典途径补体的综合水平[14],一般以50%溶血作为检测终点(CH50)[15],正常参考值为50~100U/L。也可应用ELISA法进行经典途径活性的检测更有利于实现实验的自动化,可在固相载体上包被IgM启动CP活性,应用碱性磷酸酶结合的抗体检测C5b-9复合物作为CP功能的测量[16]。脂质体-免疫分析法(LIA)检测CH50利用包裹了葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)并标记对氨基苯酚(DNP)作为抗原的脂质体与相应抗体结合代替致敏绵羊红细胞,在与人血清一起孵育时,血清中的补体通过经典途径激活,破坏脂质体,释放出G6PD,再加入底物NAD和G6P,通过测定340nm处光密度的变化来计算[17]。此方法克服了传统方法操作繁琐、重复性差等缺点,并有相应的标准品和质控物,准确性及敏感性高。有文献报道与传统方法相比有94.6%的符合率、93.2%的敏感性、95.0%的特异性,可在自动生化分析仪上检测,检测方便、重复性好[17]。CH50增高见于急性炎症状态,组织损伤和某些恶性肿瘤[18]。CH50减低见于各种免疫复合物性疾病(如肾小球肾炎)、自身免疫性疾病活动期(如系统性红斑狼疮)[19]、感染性心内膜炎、病毒性肝炎、慢性肝病、肝硬化、重症营养不良和遗传性补体成分缺乏症等。AH50试验用于评估补体旁路途径的激活,溶血实验可用于测定AH50,因为绵羊的红细胞不能激活AP,所以AH50的溶血功能试验应用兔子或豚鼠的红细胞。也可应用ELISA法自动化定量测定AP功能。AH50值降低可由B因子、D因子、CFH或I因子等功能异常激活AP途径导致。凝集素途径的功能检测目前没有公认的检测手段,用于评估由甘露糖结合凝集素(MBL)启动的LP功能的ELISA试剂盒,目前仅限于科研使用[10]


2. 补体成分浓度与自身抗体及基因的检测:有许多不同的方法可以测量补体途径成分和调节因子的浓度,目前临床上常用的检测方法包括免疫比浊法和ELISA法。临床上常用免疫比浊法自动化检测补体C3和C4的浓度。补体C3是血清中含量最高的补体成分,主要由巨噬细胞和肝脏合成,由α和β两条多肽链组成的β2球蛋白。在C3转化酶的作用下,裂解成C3a和C3b两个片段,在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用[20]。补体C3正常值为0.80~1.50g/L。C3增多与减少与总补体活性基本相符,但更为敏感。补体C4是存在于血浆中的一种多功能β1球蛋白,在补体经典途径活化中,C4被C1s水解为C4a、C4b,它们在补体活化、促进吞噬、防止免疫复合物沉着和中和病毒等方面发挥作用[2]。补体C4正常值为0.2~0.6g/L。补体C3、C4的临床意义相似,增高常见于某些急性炎症或者传染病早期,如风湿热急性期、关节炎、心肌炎、心肌梗死、心血管代谢性疾病[21]等;降低常见于:补体合成能力下降,如慢性活动性肝炎、肝硬化、肝坏死等;补体消耗或者丢失过多,如活动性红斑狼疮[22]、急性肾小球肾炎早期及晚期、冷球蛋白血症、严重类风湿关节炎、大面积烧伤等;补体合成原料不足,如儿童营养不良性疾病;先天性补体缺乏。除了血清学补体检测外,流式细胞术可用于检测补体受体或膜型补体调节蛋白,比如CR1、CD46等[23, 24]


针对补体系统不同成分的多种自身抗体可被检测来帮助进行疾病的诊断,包括补体固有成分、调节蛋白、蛋白质复合物和转化酶,常见于一些自身免疫性疾病如SLE、aHUS、C3肾小球病等。Clq作为补体经典途径的起始分子,是构成补体C1的重要组分[25]。C1q参考值:0.18~0.19g/L(ELISA法),0.025~0.05g/L(免疫比浊法)。C1q增高见于一些疾病的急性期如骨髓炎、类风湿关节炎、痛风、过敏性紫癜等。C1q降低可见于SLE、混合型结缔组织疾病、重度营养不良、肾小球肾炎、重症联合免疫缺陷等。临床上可以通过ELISA法检测抗C1q抗体,抗C1q抗体主要出现在SLE患者的血清中,对于疾病的诊断、评估及预后具有重要意义[26, 27]。进一步研究表明,抗C1qA08抗体与狼疮性肾炎(LN)患者疾病活动度、预后及预测复发等方面有更为密切的关系[27]


CFH是补体旁路途径的主要调节蛋白,主要由肝脏产生[28],是分子量为150KDa的丝氨酸蛋白酶,由20个短一致重复片段(short consensus repeats,SCRs)组成,每个SCR包含60个氨基酸。H因子通过以下作用机制抑制补体活化:与C3b结合,抑制旁路途经C3转化酶的形成;促进旁路途经C3转化酶的分解,缩短其半衰期;作为I因子的辅助因子使C3b降解为iC3b[29, 30]。正常人体内CFH的血浆含量约为300-800μg/mL[29]。可用溶血实验和配体结合实验对其进行功能测定,还可以检测CFH抗体、CFH不同结构域抗体(N端SCR1~4、C端SCR19~20)。近年来发现其与多种自身免疫性疾病相关,如SLE/LN、不典型性溶血性尿毒综合征(aHUS)、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎(AAV)、C3肾小球病(C3G)、IgA肾病(IgAN)等。CFH基因突变、基因多态性或抗CFH抗体的产生等引起CFH功能障碍可能参与了以上疾病的发生发展。在上述疾病中检测血浆中CFH的浓度和抗体有助于疾病的发病机制、临床及病理评估、疾病活动性及预后的判断。


C3片段C3b被激活后会发生构象变化,暴露出对补体进一步激活和与激活表面结合重要的结合位点,以及潜在自身抗体的新表位,抗体附着于C3b阻断了与膜结合补体受体和循环调节因子如FH和补体因子I的相互作用[10]。可在SLE、LN、C3G等疾病中检测出抗C3b抗体阳性,抗C3b抗体阳性与LN的疾病活动度相关,可以预测复发[31]。B因子为C3激活剂前体,是补体旁路活化途径中的一个重要因子,可被D因子裂解为Ba、Bb两个片段,Bb与C3b结合构成旁路途径的C3转化酶,常用单向免疫扩散法进行检测,其参考值为0.1~0.4g/L。补体因子I呈双球状结构,是一种异源二聚体血清蛋白,其主要生物学活性是在C4bp、MCP、CFH和CR1等辅助因子的协同下,将C4b裂解为C4d和C4c,使C3b裂解出C3f形成iC3b,后者再进一步裂解为C3dg和C3c,由此而控制补体系统的活化。可用商品化的CFI试剂盒进行浓度检测。此外,针对补体激活或降解产物的测定也具有临床价值。测定C3a或C3d可区分补体消耗与补体缺陷。C4d有较长的半衰期,SLE和类风湿关节炎患者血清中可检测到其升高。补体C5a是补系统中的一种过敏毒素,可以反应机体的炎症状态。补体系统终末产物sC5b-9水平的测定也可作为判断补体系统激活与否及激活程度的一个指标。这些补体激活或降解产物的测定也是一些临床研究有潜力的靶目标,目前可以应用商品化的ELISA试剂盒进行检测,但其临床应用价值有待于进一步验证。


C3肾炎因子(C3 nephritic factor,C3Nef)是补体旁路途径C3转化酶(C3bBb)的一种IgG类自身抗体,它可以延长C3bBb的半衰期,进一步激活补体旁路途径的活化,从而导致C3被持续活化并裂解。目前检测C3Nef的方法有[32]:C3转化酶稳定ELISA,C3转化酶加备解素ELISA(COS-P),C3Nef免疫球蛋白G结合ELISA(COIg),溶血试验(HA),液相C3裂解试验(FPC)。常规实验室检测C3Nef的方法较少,方法多变且技术复杂,采用联合检测的方法可以提高C3Nef的阳性率,但目前尚缺乏标准化和适当的质量控制。C4肾炎因子(C4 nephritic factor,C4Nef)是补体经典途径C3转化酶(C4bC2a)和凝集素途径C5转化酶(C4bC2aC3b)的自身抗体,可利用经典转化酶纯化组分包被的绵羊红细胞进行多步溶血测定,或通过ELISA夹心法检测稳定相中C4b2a复合物沉淀,也可用间接免疫固定电泳法测定[12]。C5肾炎因子(C5 nephritic factor,C5Nef)是补体旁路途经C5转化酶(C3bBbc3b)的自身抗体,也可通过溶血实验或间接免疫电泳法进行测定,然而对于肾炎因子的检测目前尚未建立常规的检测方法,但不同实验室间存在差异[10]


遗传变异可能通过多种机制导致补体系统的失调,包括表达水平异常或功能障碍。补体基因变异是可导致单基因疾病,但大多补体基因变异造成了疾病易感性增加,如IgAN、SLE、APS等[10]。Sanger测序法是补体基因变异分析的金标准,也可应用下一代基因测序计数(next-generation sequencing,NGS)来进行筛选[33]


三、补体系统检测的应用与展望


补体是一个复杂的系统,越来越多的研究表明,补体系统的活化参与了多种疾病的发生发展[9],补体系统不同成分的检测成为了疾病诊断、活动度及治疗效果评价监测、评估预后的新靶点。


1. 补体检测与疾病诊断:对于免疫相关性疾病以及与补体有关的遗传性疾病中,补体检测可以协助明确疾病诊断。系统性红斑狼疮患者血清中可存在多种自身抗体,形成的大量循环免疫复合物激活补体后,消耗大量的补体C3、C4从而使其水平降低。2019年EULAR/ACR系统性红斑狼疮分类标准中[34],补体C3和/或C4减低是SLE诊断的一项免疫学标准,补体C3、C4的检测也在临床广泛开展及应用。在早期SLE患者血清中补体C3、C4大多数会降低,C4相比较于其他补体成分更早降低,且较其他成分回升缓慢,因此可以辅助SLE的早期诊断。C3G是以补体C3在肾小球沉积为主的一组疾病,目前认为,遗传性或获得性因素引起补体旁路途径过度活化,产生多种补体裂解片段沉积于肾小球不同部位是其主要发病机制[13]。通过基因检测是否存在补体调节因子(如MCP、CFH)及补体活化因子突变,以及通过检测针对补体活化成分的自身抗体(C3NeF、抗CFH抗体等)可以进一步协助明确C3肾小球病的诊断及病因。aHUS的主要发病机制为补体过度激活造成的内皮细胞的损伤,其中旁路途径的过度激活在aHUS发病机制中的重要地位已得到广泛关注。CFH基因突变是aHUS中最常见的基因变异,约占所有突变类型的20%-30%。在合并CFH基因突变的aHUS患者中,仅有约30%的患者出现CFH血浆浓度的下降。对补体CFH浓度、抗CFH抗体、补体基因检测更有助于明确aHUS的诊断。同时,随着补体检测技术的不断发展与进步,我们对于疾病的发病机制有了更进一步的认识。为进一步探索抗CFH抗体的功能与特性,北京大学第一医院肾内科对36例抗CFH抗体阳性的aHUS患者进行研究,同时用ELISA法检测抗CFH-IgG亚类和抗体同型。利用重组CFH片段(SCRs1-4、SCR7、SCRs11-14和SCRs19-20)进行表位定位。结果发现抗CFH自身抗体主要与CFH的SCR19-20结构域结合[35]


2. 补体检测与疾病活动度监测及预后评估:补体检测不仅可以协助明确疾病诊断,而且可以应用于疾病活动度监测及预后评估。众所周知,补体C3、C4水平监测是SLE患者评价疾病活动度的一项重要指标,随着研究的不断进展,北京大学第一医院肾内科研究提示补体旁路途径的活化可能在LN的发病机制中扮演重要角色[36],且更能准确的反映疾病活动度。同时CFH与SLE易感性相关,CFH基因多态性与LN临床表现、肾脏病理类型、临床活动指标具有相关性[37]。北京大学第一医院肾内科前期研究发现活动期LN患者血浆中CFH水平显著下降,且与患者临床活动指标和肾脏病理指标存在相关性[38]。抗补体因子H(CFH)自身抗体相关HUS亦是HUS的一个严重亚型,北京大学第一医院对33例抗CFH抗体阳性相关HUS患者进行补体水平检测以及跟踪随访,发现与缓解期和正常对照组相比,急性病患者血浆CFH水平显著降低,血浆补体3a(C3a)、C5a和终末补体复合物(SC5b-9)水平显著升高[39]。IgAN是最常见的原发性肾小球疾病,研究表明IgAN患者尿液和肾脏局部C3a、C5a及C3aR、C5aR表达与肾损伤的活动性及严重程度显著相关[40]。这一观察结果为进一步研究C3a、C5a及其受体在IgA肾病发病机制中的作用以及作为潜在的治疗靶点提供了依据。越来越多的研究表明补体系统的激活在AAV的发病机制中起着至关重要的作用。北京大学第一医院肾内科既往研究发现,MPO-AAV患者血浆CFH水平与其初始血清肌酐、伯明翰血管炎活动评分(BVAS)、肾组织总新月体和细胞新月体的比例、循环C3a、C5a和sC5b-9呈负相关,同时与估计的肾小球滤过率(eGFR)、血红蛋白水平和循环C3水平呈正相关[41],表明血浆CFH水平与AAV疾病活动性相关,在一定程度上与MPO-ANCA相关性血管炎患者的综合预后相关。对于C3肾小球病患者,全面的补体检测有助于判断患者的预后,如患者存在CFHR5的基因变异,那么相比较女性患者而言,男性患者更容易出现肾功能不全[42]。对于补体相关的疾病,全面的补体检测更有助于进行治疗方案的抉择及病情的评估。


3. 补体检测与靶向治疗:鉴于补体系统在多种疾病的发病机制中起到了重要作用,因此,针对补体系统相关的靶向治疗也成为了一些疾病的研究热点。靶向C5的单克隆抗体可与C5结合,阻止C5裂解,抑制补体活化后产生的C5a促炎及C5b-9促血栓形成的作用,阻断膜攻击复合物的形成,进而阻止内皮损伤[43],是最经典的补体靶向治疗药物。C5单抗可应用于阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、aHUS、C3G、AAV、SLE/LN等与补体途径关系密切的疾病。在aHUS患者中,应用依库珠单抗(eculizumab)治疗后,有效的补体抑制通过显著降低CH50、APH50、C3d和sC5b-9水平得到证明,而C5a水平仅在治疗6个月后显著降低[44]。另有8例接受eculizumab治疗的aHUS患者,C3/SC5b-9循环水平在eculizumab治疗后没有改变,而血清诱导的内皮细胞C5b-9沉积在治疗后恢复正常,并可提前于疾病缓解时恢复正常,提示体外血清诱导的内皮细胞C5b-9沉积是监测aHUS中补体激活和eculizumab有效性的敏感工具,并指导药物的剂量和用药时间[45]。C3G患者使用eculizumab治疗后,C3d水平增加,C3水平持续偏低,这反映了补体在C3水平持续激活和消耗[44]。除了在C5水平进行治疗靶点研究,在C3G治疗领域,针对补体的治疗也集中在了C3水平,如Compstatin(CP40),它是由14个氨基酸组成的环状肽,与C3及C3b结合后抑制C3bBb的形成,进而影响补体旁路途经的活化[46],是补体C3的有效抑制,目前这些药物尚未广泛应用,在治疗中应用补体检测进行疗效评估的价值需要更进一步的实践与研究,前景值得期待。


补体是一个复杂的系统,目前补体成分C3、C4、C1q的检测已经得到广泛应用,但对于抗C1q抗体、CFH、CFH抗体等尚未得到广泛普及,然而这些补体成分及相关抗体的检测具有重要临床意义。同时随着对疾病研究的不断深入,临床上需要更进一步进行补体成分某个片段或是亚型的检测,大多时候为了疾病的综合诊断需要进行多个补体成分的检测来对补体缺陷、激活或抑制状态的综合分析,多重检测有明显的潜力来帮助解决这一需求[47]。这对于补体系统的检测方法提出了更高的要求,希望在未来,我们可以有更全面、方便、快捷、准确的联合检测补体成分的检测方法出现,以便于更好的服务临床。