类风湿关节炎实验诊断技术与临床诊疗意义

詹明华，北京大学医学部第二临床医学院硕士研究生在读。

刘昱东，博士、副研究员、硕士研究生导师。现任北京医院北京老年医学研究所副所长。美国阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）免疫学博士、美国国立卫生研究院（NIH）NIAMS所风湿免疫学博士后。近十年来在国家自然科学基金面上项目、美国国立卫生研究院研究基金等资助下，在自身免疫/炎症性疾病的发病机制及诊断新技术方面取得了一系列重要成绩。其在《Science Immunology》《BLOOD》《Ann Rheum Dis》《PNAS》《JCI Insight》《Clinical Reviews in Allergy and Immunology》《Rheumatology》《Frontiers in Immunology》《Journal of Immunology》等国际主流期刊上发表相关研究成果50余篇。近3年来，主持与自身免疫疾病，尤其是系统性红斑狼疮和类风湿关节炎的发病机制以及诊断新技术方面的国家自然科学基金（面上项目）两项。担任中华医学会检验医学分会第十届委员会临床免疫组委员、中国老年保健医学研究会风湿免疫分会委员、北京免疫学会第八届理事、北京医学会第十三届检验医学分会自免学组委员、第二届中国中西医结合学会检验医学专业委员会免疫性疾病实验诊断专家委员会委员、中华临床免疫和变态反应杂志青年编委、Frontiers in Immunology编委、中华检验医学杂志审稿专家。

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的慢性系统性自身免疫病。全球RA患病率为0.46%[1]。目前临床常用的RA实验室诊断指标包括：红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP），类风湿因子（RF）以及抗瓜氨酸肽抗体（ACPAs）等。随着对于RA发病机制认识的不断深入，越来越多新型的生物学标志物被发现，并逐步应用到临床，在RA的早期诊断，特别是血清阴性RA的诊断中发挥重要的作用。本文就国内外类风湿关节炎实验诊断技术临床应用进展进行综述。

一、RA临床常规实验室检测指标

1. ESR和CRP：ESR和CRP是临床常用的全身炎症标志物，用于评价RA的疾病活动性，但在病程较短的早期RA（Early RA, ERA）患者中变化不明显。ESR和CRP的异常也包含在2010年ACR/EULAR发布的RA分类标准中[2]。RA疾病活动度评分DAS28标准中，ESR或CRP也是不可或缺的一部分[3]。DAS-28（ESR）与DAS-28（CRP）虽均与疾病活动度相关，但二者对于同一个体的评分结果不具有一致性，在临床研究中要注意评分标准的一致性[3]。

2. RF：RF是一类靶向IgG Fc段的自身抗体，其对RA诊断的敏感性为60-75%，特异性为40-85%，约1/3的ERA患者血清中RF水平正常[4]。高滴度的RF可以预测RA患者关节放射学损伤程度[5]。此外，RF升高还见于其他全身性自身免疫病，如干燥综合征、系统性红斑狼疮、混合型冷球蛋白血症、混合结缔组织病和原发性胆汁性胆管炎等，还可见于丙型肝炎和巨细胞病毒感染等各种感染性疾病[4]。

3. ACPAs：ACPAs是存在于RA血清中另一类重要的自身抗体[6]。临床最常用的是抗环瓜氨酸肽（cycliccitrullinated peptide，CCP）抗体，其次还有抗瓜氨酸化α-烯醇化酶肽1（α-CEP1）抗体、抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体等。ACPAs阳性RA患者比ACPAs阴性RA患者的关节损伤更严重[7]。（1）抗CCP抗体：抗CCP抗体是一类总的ACPA复合型抗体，诊断RA的灵敏度为67%，特异性为95%[8]，是国际多个RA诊疗指南中早期诊断RA及判断关节侵蚀的特异和灵敏的指标[2, 9-11]，可以预测临床前期关节炎进展的风险（风险比HR值为8.5）[12]。瑞典在2012年和2021年发布的指南中建议对所有未分化关节炎患者（即临床前期关节炎患者，临床证据不足以诊断RA或任何其他已确定的风湿性疾病患者）进行抗CCP抗体检测[12]。在ERA患者和RA患者的临床药物实验中发现，抗CCP抗体阳性的RA患者对阿巴西普的疗效更好，且与抗体滴度呈正相关[13-15]，因此抗CCP抗体可以用于药物选择和疗效监测[16]。（2）抗MCV抗体：抗MCV抗体对于RA诊断的敏感性和特异性并不比抗CCP抗体高，但是其有助于血清阴性RA的诊断[17]。有研究显示，11.8%抗CCP阴性的RA患者抗MCV抗体阳性[18]，而且在英夫利昔单抗治疗期间，抗MCV抗体滴度比抗CCP抗体下降得更快，且与DAS28反应密切相关[18]，提示抗MCV抗体在RA治疗过程中的疗效监测和预后诊断作用。（3）抗瓜氨酸化α-烯醇化酶肽1抗体（α-CEP1）：α-烯醇化酶是一种糖酵解酶，而瓜氨酸化α-烯醇化酶是一种特定的瓜氨酸自身抗原，它将吸烟与类风湿关节炎发生中的遗传危险因素联系起来，触发机体产生自身抗体，促进RA的发展[19]。瑞典的一项研究显示在43%的RA患者血清中检测到α-CEP1，而且诊断特异性为97%[20]，而且α-CEP1与吸烟、HLA-DRB1共享表位有显著的基因-环境交互作用[19]。（4）抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体：抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体（ACF）是常用于RA诊断的抗瓜氨酸化蛋白抗体之一。Nielen等在一项对ERA的随访研究中发现ACF对于RA的诊断敏感性和特异性分别为55.8%和92.6%，与抗CCP抗体在ERA的诊断中有较高的一致性[21]。ACF在约30%的RF阴性RA患者血清中存在，提示ACF可以作为RF诊断RA的抗体的补充，同时是ACF早期关节炎影像学进展的良好预测指标[21]。

4. 抗丝聚蛋白抗体（AFA）：AFA由抗角蛋白抗体（AKA）和抗核周因子（APF）组成，可识别人表皮丝聚蛋白和各种上皮组织的其他丝聚蛋白原相关蛋白。Wang等在一项荟萃分析中指出AKA诊断RA的敏感性和特异性分别为46%和94%[22]，O VITTECOQ等在应用瓜氨酸重组大鼠丝聚蛋白在对极早期RA的诊断研究中发现，尽管AKA、APF和抗CCP抗体之间存在很强的正相关，但联合应用几个指标可以大大提高诊断效能[23]。

二、新型生物学指标

1. 抗核内不均一性核糖核蛋白（hnRNP）抗体：（1）抗RA33抗体：抗RA33抗体是一种靶向hnRNP A2/B1的自身抗体，可在7-25%的RA患者中检测到，且与RF阳性无关[4]。2017年的一份荟萃分析指出，抗RA33抗体诊断RA的特异性较高，但敏感性不足，适用于评估疑似RA患者，特别是RF阴性或需要鉴别除系统性红斑狼疮和混合性结缔组织病以外的其他结缔组织疾病的患者[24, 25]。（2）抗hnRNP-DL抗体：hnRNP-D类蛋白质（hnRNP D-like protein）又名JKTBP，与自身抗原hnRNP-D（AUF1）相关，在RA瓜氨酸化的应激颗粒中高表达，并在不同发展阶段的RA患者亚群中作为天然蛋白形态或瓜氨酸化蛋白形态刺激机体产生自身抗体[26]。Bianka Marklein等在最新的一项研究中提出一个新的参数CNDL指数（CNDL-Index），即抗瓜氨酸化hnRNP-DL自身抗体与抗hnRNP-DL自身抗体的OD差值。CNDL指数阴性的RA患者对甲氨蝶呤治疗倾向于阳性反应，而且随着RA的进展，CNDL指数随之升高。CNDL指数可与抗瓜氨酸化hnRNP-DL自身抗体与抗hnRNP-DL自身抗体联合用于检测RA高风险人群，可以提高对血清阴性RA患者的血清诊断敏感性，对RA的鉴别诊断和预后有一定的临床应用价值[26]。

2. 抗修饰蛋白自身抗体（AMPAs）：RA患者血清中除了抗瓜氨酸化修饰蛋白抗体，还有一系列其他AMPAs对翻译后修饰（PTMs）的反应抗体谱，如抗氨甲酰化蛋白（aCarP）抗体、抗乙酰化蛋白（anti-acetylated protein）抗体和抗丙二醛（malondialdehyde，MDA）修饰蛋白[27]等。（1）抗氨甲酰化蛋白（aCarP）抗体：氨基甲酰化是一种非酶促的翻译后修饰，翻译后修饰的蛋白可能会破坏免疫耐受和诱导自身抗体反应[28]。Jing Shi等发现在39%的RA血清中发现了抗CarP抗体，与RA发生的高风险相关，而且在关节痛症状出现之前就可被检测到[29]。既往研究中常用氨基甲酰化波形蛋白和氨基甲酰化纤维蛋白原来测定血清中的抗CarP抗体[30]。有研究显示，在68.7%的抗CCP阳性的RA患者中检测到抗氨基甲酰化波形蛋白，在3%的抗CCP阴性的患者血清中也能检测到该抗体[31]，病程小于2年的ERA患者血清中也有37%的ACPA阳性患者和16%的ACPA阴性患者血清中检测到抗CarP抗体，而且与RA更高程度的疾病活动性和更严重的疾病进程相关[32, 33]，抗CarP抗体可能是识别血清阴性ERA患者和需要早期积极临床干预的RA新诊断标志物[7, 32]。（2）抗乙酰化抗体：赖氨酸乙酰化也是主要的蛋白质翻译后修饰的作用方式之一是一个需要乙酰化酶和去乙酰化酶紧密平衡的动态过程[34, 35]。Maria Juarez等在一项对早期关节炎患者血清中三种不同抗翻译后修饰的波形蛋白抗体的研究中发现抗乙酰化抗体与RA发病率之间有关联（OR值为10.6）[31]，但还需要进一步的研究探索乙酰化蛋白及抗乙酰化抗体在RA发病机制中的作用。（3）抗MDA修饰蛋白抗体和抗MAA修饰蛋白抗体：丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一种天然存在的高活性醛，在氧化应激状态下，过量活性氧（ROS）催化生成活性MDA，共价修饰蛋白质产生结构变化和新表位[36]。在局部炎症条件下，可被MDA修饰的自身蛋白有波形蛋白、纤维蛋白原、α-烯醇化酶和白蛋白等[36]。MDA修饰与瓜氨酸化修饰并不相关，ACPA阴性的患者也能检测到MDA修饰[36]。Vay等[37]在对25-63岁区间的健康人群的研究中发现抗MDA修饰蛋白抗体与年龄无关。已有研究证实，抗MDA修饰蛋白自身抗体与心血管疾病强相关[38]，Cvetkovic等在研究中发现RA患者中抗MDA-LDL自身抗体水平和患病率增加，并且还与RA心血管并发症有关[39]。分析RA中的这些抗体可能用于预测疾病的严重程度以及心血管并发症。

游离的MDA可与乙醛进一步形成免疫原性的丙二醛-乙醛（malondiadehyde-acetaldehyde，MAA），具有强大的促炎活性，还可诱导特异性抗体应答[40]。在RA患者滑膜组织中存在MAA，并且伴有ACPA共定位，提示抗MAA修饰蛋白抗体与RA患者ACPA相关[40]。Ted R Mikuls等在一项长时间随访对照研究中发现IgG和IgA抗MAA抗体在RA诊断之前出现升高，在临床前过程中稍晚于出现抗CCP抗体或RF，表明MAA的形成和抗MAA免疫反应可能在从亚临床自身免疫到临床明显关节炎的转变中发挥作用[41]。在非RA人群中，抗MAA抗体与心血管疾病进展相关，RA患者的高滴度抗MAA抗体是否能预测未来的心血管事件有待进一步研究[40]。

3. 14-3-3η蛋白和抗14-3-3η抗体：14-3-3η蛋白是真核细胞内广泛表达的细胞内伴侣蛋白家族—14-3-3蛋白的一个亚型，在滑膜液中的浓度比在血清中高约5倍[42]，而且RA患者血清中14-3-3η蛋白水平明显高于对照组[43]。14-3-3η蛋白诊断RA的敏感性和特异性分别为65%和95%[43]。14-3-3η蛋白在约67%的血清阴性RA患者血清中可被检测到[44]，在RF和ACPA等传统血清学标志物阴性的情况下，可以帮助诊断RA[44, 45]。

14-3-3η蛋白在炎性状态下出现在胞外之后，机体免疫系统会特异性识别并产生靶向抗体。抗14-3-3η抗体诊断RA的敏感度和特异性分别为73%和79%，而且与RF、ACPA、14-3-3η蛋白之间均无相关性，联合诊断这四个指标可以识别90%的ERA患者和95%的RA患者[46]。

4.基质金属蛋白酶3（Matrix metalloproteinase 3，MMP3）：MMP3又称为基质裂解素（Stromelysin-1）是一种钙依赖的含锌内肽酶，能够降解细胞外基质中II、IV和IX型胶原蛋白，蛋白聚糖，纤维连接蛋白，层粘连蛋白和弹性蛋白[47]。MMP3通过激活滑膜基质和促进巨噬细胞和中性粒细胞浸润滑膜内层，参与RA滑膜炎性病理进程[48]。临床研究表明，血清MMP-3水平可用作RA患者早期关节侵蚀及损伤程度评估，并可用于监测疾病活动[49, 50]。Ma等研究发现，MMP3是一种可以替代有创滑膜活检的生物学标志物，适合用于评估滑膜炎严重程度[48]。临床研究显示，单独MMP3诊断RA的敏感度为58.9%，特异度为88.79%[51]；MMP3与CRP联合诊断RA的敏感度为97.2%，特异度为97.9%[52]。

5. 抗正五聚蛋白-3（PTX3）抗体和抗双特异性磷酸酶-11（DUSP11）抗体：PTX3是一种由巨噬细胞和其他类型细胞或组织在主要炎症介质（如脂多糖、白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α）作用下产生的一种分泌型模式识别受体，可通过C1q补体途径广泛参与先天性免疫反应[53, 54]。PTX3可能参与了RA早期补体介导的滑膜损伤以及晚期并发的血管炎性损伤等[54]。最近的一项研究显示，血清PTX3水平在RA患者中显著升高，与疾病活动相关，而且在六个月的配对治疗中不受不同治疗方案的影响[55]。

DUSP11是酪氨酸磷酸酶家族中的一员，可能在来自角质形成细胞、表皮样细胞和成髓细胞的细胞系中表达[56]，直接作用于TAK1并调节其在巨噬细胞中的活化，实现调节各种免疫细胞信号通路的功能[57]。

Li等应用高密度蛋白质芯片筛选自身抗体时发现了抗PTX3抗体和抗DUSP11抗体存在于RA患者中，且与ACPA是否阳性无关，提示在血清阴性RA的诊断中有一定的临床应用价值[58]。

6. 抗肽基精氨酸脱亚氨酶（PAD）抗体：PAD酶家族是介导蛋白瓜氨酸化这一钙依赖性蛋白翻译后修饰过程的关键酶[59, 60]，有五个成员，分别命名为PAD1-PAD4和PAD6。近年来的许多研究发现RA患者的血清中同时存在靶向PAD2和PAD4的自身抗体[61-65]，而且抗PAD4抗体与较为严重的病情和发生EAM的风险增加有关，比如ILD的较高发病率[61-64]，而抗PAD2抗体则与较少的炎性疾病和较低的ILD发生率有关[65]。最新的一项研究在26.4%和20.9%的RA患者血清中发现抗PAD2抗体和抗PAD4抗体，提示抗PAD2抗体对RA诊断具有一定的潜在价值，同时发现抗PAD2抗体和抗PAD4抗体的联合检测有助于识别具有RA-ILD风险的患者，可能成为现有RA血清学标志物的重要补充[66]。

7. 抗II型胶原抗体（α-CII）：II型胶原是存在于透明软骨的主要蛋白质，RA患者的血清和滑膜液中均可检测到α-CII，α-CII与RA早期关节侵蚀性损伤相关[67, 68]。α-CII在RA患者中的阳性检出率为30%-67%, 而特异性为56%-80%[69]。虽然α-CII对RA的诊断价值有限，但是α-CII阳性的RA患者具有独特的临床表型，而且可能是老年患者急性发作RA的表型之一，具有独特的预后价值[70, 71]。

8. 抗HLA抗体：Del Angel-Pablo等首次在约29%的RA及25% RA-肺间质疾病（ILD）患者血清中发现抗HLA抗体，提示PRA阳性可能与疾病严重程度相关，并可能对RA患者间质性肺病的治疗有影响。此外，该研究还发现抗HLA抗体与ILD RA患者的C反应蛋白水平相关[72]。

三、展望与结语

对RA相关自身抗体的研究不仅有助于我们了解疾病的免疫发病机制，而且其可用于临床疾病诊断、预后预测以及指导用药的生物标志物[33]。RA的实验室诊断指标主要集中在系统性炎性标志物和相关的自身抗体方面，以RF、抗CCP抗体和CRP/ESR为基础，辅以ACPAs等其他新型自身抗体，如如抗MCV抗体、抗RA33抗体、抗CarP抗体和抗CEP-1抗体等[73]。系统性炎性标志物特异性差，但由于其与疾病活动度相关，因此常用于疾病活动性的监测。RA中自身抗体谱的不断研发将为RA的早期诊断，尤其是血清阴性的RA的早期诊断、预后预测以及个体化治疗提供新的方向。