自身免疫肝病实验室诊断技术与临床应用

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，AILD）是一组因为肝脏免疫耐受机制失衡引起的肝细胞或胆管上皮细胞的慢性损伤性炎症,是肝硬化和肝功能障碍的常见原因之一[1]。AILD主要包括：（1）自身免疫性肝炎（AIH）：以肝实质细胞损伤为主的肝脏炎症性病变；（2）原发性胆汁性胆管炎（PBC）：肝内小胆管慢性非化脓性胆管炎；（3）原发性硬化性胆管炎（PSC）：以大胆管受累为主的胆管洋葱皮样纤维化；（4）免疫球蛋白G4（IgG4）相关肝脏疾病：以肝脏胆管浸润IgG4阳性浆细胞为主要特征的自身免疫疾病，包括IgG4相关硬化性胆管炎（IgG4-SC）和IgG4相关自身免疫性肝炎（IgG4-AIH）；（5）重叠综合征：兼具任意两者上述疾病[2, 3]。AILD病因尚不明确，缺乏临床表现的特异性，而这些AILD疾病的临床症状、生化及免疫学指标特征有相似之处，加重了对于这些疾病的诊断及鉴别诊断的难度。

目前临床常用的诊断AILD的实验室方法主要包括检测血液AILD相关抗体、免疫球蛋白和生化指标等，但因缺乏特异性标志物，对于不典型的AILD疾病容易漏诊、误诊。因此，寻找新的检测方法来鉴别AILD疾病至关重要。一些新兴的检测方法包括检测血液及组织中的特定细胞、血液中DNA和RNA检测以及肠道菌群微生物组学等方法尚在研究中，但已经被证明其临床检测前景。本综述的目的是概述以上方法对于诊断AILD的临床应用，为AILD的诊断提供科学依据以及新的方向。

一、自身免疫肝病的经典检验指标

1. AILD相关自身抗体的检测及临床意义：对于肝功能异常、未明原因的肝胆疾病患者，建议检测AILD相关自身抗体[4]。自身抗体作为AILD诊断和管理的重要实验室指标，主要用于疾病诊断、预测预后及病情监测等。AILD相关自身抗体包括AIH相关自身抗体、PBC相关自身抗体及PSC相关自身抗体。

AIH相关自身抗体主要包括抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（ASMA）、抗肝肾微粒体-1（LKMI）抗体[5, 6]。根据自身抗体表达的差异，可将AIH分为两种亚型：80%患者为1型，以ANA和ASMA阳性为主；而2型以抗LKM1抗体阳性为主。ANA作为自身免疫病常见的自身抗体，主要存在于系统性自身免疫病患者中，亦可见于器官特异性自身免疫病，甚至可存在于慢性感染、肿瘤及健康人群中。ASMA主要存在于AIH中，在AIH-1型中的阳性率约为50%，可在AIH患者中单独阳性，亦可见于其他肝病患者。抗LKM-1抗体作为AIH-2型的血清标志物，主要见于儿童、青少年AIH患者。在ANA、SMA和抗LKM1结果均为阴性时，可检测非典型的自身抗体，包括抗可溶性肝抗原/肝胰抗原（SLA/LP）抗体、抗肝细胞溶质抗原-1（LC-I）抗体、非典型核周抗中性粒细胞胞质抗体（p-ANCA）、抗肌动蛋白抗体、抗α-肌动蛋白抗体、抗流涎糖蛋白受体抗体（抗ASGPR）和双链DNA(dsDNA)抗体等[7-10]。抗SLA/LP抗体在中老年女性AIH患者中多见，青少年中该抗体少见。抗LC-1抗体常与抗LKM-1抗体并存或单独存在于AIH-2型患者中，阳性率约为30%[4]。

PBC相关自身抗体主要包括抗线粒体抗体（AMA）和PBC特异性ANA等。对于任何原因不明的肝内胆汁淤积，必须检测AMA。通过间接免疫荧光法检测AMA，抗线粒体抗体效价≥1：40被认为是阳性，阳性结果需通过斑点杂交、Western-blot或ELISA方法对AMA-M2型进行检测作为诊断PBC的进一步确认[11]。国外报道AMA-M2型是PBC的标志性抗体，其敏感性和特异性均超过95%[12]，而国内文献报道AMA-M2阳性率为88%[13]，目前缺乏基于中国人群的AMA抗体滴度参考范围，未来需构建中国群体的参考区间范围以减少漏诊。由于AMA-M2敏感度和特异性非常高，在患者AMA-M2阳性、ALP升高且具有胆汁淤积的生化体征时，可以在不需要肝脏活检的情况下确定PBC的诊断[14]。针对PBC的抗核抗体（ANA）存在于大约25%的PBC病例以及50%的无AMA的PBC病例中。间接免疫荧光法检测到的ANA主要为核点型或核膜型。间接免疫荧光法检测ANA结果阳性时必须通过ELISA等方法检测抗ANA特异性自身抗体，包括抗可溶性酸性磷酸化核蛋白100（Sp100）抗体和抗跨膜糖蛋白210（gp210）抗体，来进行进一步的诊断确认[15]。对于不明原因的慢性胆汁淤积症，这些抗体诊断PBC的特异性高于95%。值得注意的是，抗gp210抗体比抗sp100抗体更具特异性，在系统性结缔组织疾病中亦可观察到抗sp100抗体阳性。有研究发现，gp210和sp100抗体阳性提示其疾病进展更快，且预后更差[13]。最近，研究发现了比抗gp210和抗sp100抗体更敏感的抗体——抗己糖激酶1（HK1）和抗kelch样12（KLHL12）抗体，其诊断特异性高于95%，在10-35%的抗gp210和抗sp100抗体阴性PBC患者中存在抗HK1和抗KLHL12抗体，但是目前尚无HK1和KLHL12抗体检测试剂盒[16]。若是在无胆汁淤积的情况下检测到PBC特异性抗体，并不能直接诊断为PBC，建议每年检测一次ALP和GGT来帮助诊断[14]。

PSC相关自身抗体主要包括pANCA等。pANCA在PSC患者中的阳性率为33%-85%，但亦可见于AIH患者，PSC和AIH患者血pANCA在乙醇、甲醛固定的中性粒细胞上呈现不典型的pANCA荧光模型。自身抗体对PSC诊断价值有限。大部分IgG4-SC患者患者自身抗体检测结果为阴性，个别患者为低滴度阳性。

值得注意的是，抗体阳性不一定是AILD；抗体阴性也可能是AILD。AILD相关自身抗体还可见于其他肝脏疾病、肝脏损伤以及部分非肝脏疾病的患者中。自身抗体可出现在AILD患者出现典型临床症状之前，对相关疾病具有预测价值。对肝脏生化指标正常、但AILD相关自身抗体（如ASMA、AMA等）阳性者，应定期随访监测肝功能等指标。儿童AILD相关自身抗体滴度与疾病活动性、疗效监测等存在一定的相关性，但是成人AILD患者可能发生血清学转换，随病情进展逐渐出现相关自身抗体，因此，对于部分疑似患者需定期随访监测AILD相关自身抗体。

2. 血清免疫球蛋白检测：检测肝组织IgG和IgM有助于自身免疫性肝病的诊断和鉴别。AIH患者肝脏汇管区浆细胞主要表达IgG，血清IgG、IgG4水平较PBC、AIH-PBC重叠综合征患者高[13, 17]。血清IgG水平可以反映AIH患者肝内炎症程度，经治疗后可逐渐降低，因此该指标对于AIH的诊断和疗效评估均有价值[13]。

PBC患者肝脏汇管区浆细胞主要表达IgM，血清IgM水平增加。而血清IgM水平下降与PBC治疗应答相关[18]，可作为疗效评估的指标之一。

IgG4-SC以血清IgG4升高为主要特征，有研究报道，以IgG4＞1.35g/L为IgG4-SC诊断标准时，其诊断敏感性和特异性可达到90%[19]。部分患者最初IgG4水平无异常，但在随访期间IgG4水平逐渐升高[20]。IgG4同时可作为检测患者糖皮质激素治疗疗效的指标之一。

3. 血清生化学指标：诊断AILD疾病涉及的生化指标主要有碱性磷酸酶（ALP）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、胆红素（TBIL）等。

AIH患者血清生化指标特征主要为反映肝细胞损伤的ALT、AST升高，而反映胆道损伤的酶学指标ALP、GGT、TBIL升高程度低于PBC患者。值得注意的是，肝炎的生化指标不能用来评估疾病的严重程度，研究表明胆红素和转氨酶水平会随时间波动，可在活动性疾病中自发恢复正常[7]。

PBC患者常见血清胆汁淤积标志物的持续增加：ALP水平升高至正常上限的2倍以上，且通常持续时间超过6个月；GGT水平增加到正常上限的5倍以上。高ALP水平通常表明病情较重、预后较差。而ALT和AST水平通常为轻至中度升高，可以反映肝脏的炎症程度。另外，高胆固醇血症通常与高密度脂蛋白有关，60%的病例在诊断时出现高胆固醇血症[18]。对于疾病病情判断方面，患者血清中结合胆红素浓度高（＞17mol/l），白蛋白水平低（＜35g/l）或血小板计数低（＜150000/mm3）时，可认为患者是PBC疾病晚期[21]；AST-血小板比率高于0.54提示疾病并发症风险高[22]。

PSC患者可见血清ALP和GGT升高，但缺乏特异性。IgG4-SC患者存在ALP、TBIL及GGT不同程度的升高[23]。

二、自身免疫肝病的新兴检验指标

1. 外周血及肝脏组织细胞标志物检测：近期有研究发现，AILD患者外周血或者肝脏组织内存在特定细胞积聚现象。AIH患者肝内浸润CD69+ CD103+ CD8+ 组织驻留T细胞（TRM）增多，该细胞杀伤功能增强，可以促进肝脏炎症状态；而糖皮质激素治疗可以减少CD8+ TRM细胞数量从而缓解这种慢性炎症状态[24]。PBC患者外周血可出现单核细胞型HLA- DR-/low CD33+ CD11b+ CD14+ CD15－髓源性抑制细胞(MDSC)积聚现象，且其百分比与疾病相关生化指标明显相关[25]。PSC的特征之一是胆管周围出现巨噬细胞，阻断巨噬细胞招募至胆管可以减缓肝损伤及纤维化[26]。IgG4-SC患者肝组织浸润大量淋巴浆细胞和IgG4阳性浆细胞，在血浆中亦可检测到浆细胞[27]。通过流式细胞学或者免疫组化的方法对于外周血及肝脏组织的细胞进行检测，可以监控AILD疾病进展及治疗情况。

2. 肠道微生物组学检测：肠道-肝脏轴影响是重要的自身免疫调节剂，肝病与人类肠道的微生物群落密切相关[28, 29]。与健康人相比，AILD患者的肠道菌群发生明显的改变，包括菌群多样性明显降低等[30]。一项大型临床研究表明，AIH患者的肠道菌群特征为专性厌氧菌耗竭以及潜在病原菌扩增；联合分析韦永氏球菌、乳酸菌、颤螺旋菌和梭菌的含量对AIH个体具有较高的诊断价值[31]。另外，研究证实AIH患者肠道双歧杆菌减少与AIH疾病进展相关[32]。对于PBC患者的研究发现，肠道益菌（如乳酸菌等）种类减少，而一些机会致病菌（如肠杆菌、奈瑟球菌、螺旋菌、韦荣球菌等）增加；PBC女性患者小肠细菌过度生长患病率增加[33, 34]。PSC患者肠道和胆汁中的微生物群落生物多样性降低，粪肠球菌显著增加[35]。除了细菌，在AILDs中也发现了衣原体的参与。Abdulkarim团队研究发现在100%PBC患者（39/39例）肝组织中存在肺炎衣原体，而只有8.5%（9/105例）的其他慢性肝病的患者肝组织中检测到了肺炎支原体[36]。此外，肠道微生物组的各种代谢物已被证明参与免疫发育和调节[37]。AILD的发病机制尚未明确，但许多研究证实了肠道菌群的改变与AILD相关。针对肠道菌群的研究可能对AILD的诊断及治疗有重要的意义，未来需要进一步探索肠道菌群在AILD的发生及发展过程中的作用。

3. 外周血DNA或RNA检测：（1）HLA基因分型检测：AIH的遗传易感性主要与人类白细胞抗原（HLA）基因有关[38, 39]。AIH与特异性HLA等位基因的关联可以追溯到40多年前，Mackay等人首次报道了AIH与HLA-DR3之间的关联[40]。在接下来的几年里，大量的研究证实了HLA-DR3和HLA-DR4在AIH疾病发生和结局中的作用[41-43]。其中对亚洲人群的研究表明，DRB1*13和DRB1*14与AIH易感性有关[44, 45]。对于HLA基因分型的检测对于疾病诊断和预后情况有所帮助。（2）SH2B3单核苷酸多态性检测：基因多态性与自身免疫性肝病的易感性相关[46]。SH2B衔接蛋白3（SH2B3）是一种细胞内衔接蛋白，在多种信号转导途径包括炎症信号通路中作为负调节物而发挥作用[47, 48]。SH2B3单核苷酸多态性与自身免疫性肝病有一定相关性，其中CT型、TT型基因型可能与PBC发生有关，TT型基因型可能与AIH发生有关，临床上可通过检测SH2B3基因型，对自身免疫性肝病做出初步预测，以便尽早干预和控制，对预防自身免疫性肝病的发生可能具有重要价值[49]。（3）IgG4 mRNA/IgG mRNA的比值检测:有研究显示通过血清定量聚合酶链反应（PCR）检测外周血IgG4 mRNA/IgG mRNA的比值，认为比值＞0.05对IgG4-SC有诊断价值，尤其对血清IgG4水平不增高的病例有较大诊断价值，可与PSC或胆胰恶性肿瘤相鉴别[50]。（4）miRNA检测:近年来，miRNA在自身免疫性肝病中的病理和诊断相关性已被报道。miRNA通过影响巨噬细胞、调节性T细胞、Th17细胞、CD4+T细胞和肝细胞来调节凋亡和炎症反应[51]。在未经治疗的AIH患者中，血清miR-122和miR-21水平显著升高，但在糖皮质激素治疗缓解期间降低[51]。PBC患者肝组织中miR-21和miR-210水平较健康个体升高[52, 53]。let-7 miRNA和miR-520a-5p的升高，以及miR-125b的降低，是难治性PBC的生物标志物[54]。随着PBC分期的进展，miR-223-3p和miR-21-5p在PBC患者外周血B细胞中的表达被抑制[55]。miRNA通过抑制PBC中的各种信号通路来调节免疫应答、肝细胞凋亡、胆汁酸代谢和胆道纤维化。miR-21靶向周期不依赖激酶2相关蛋白1（CDK2AP1），抑制miR-21可改善肝损伤、坏死和纤维化[52, 53]。此外，miR-92a在PBC患者中下调，提示miR-92a可直接调控IL-17A，参与疾病进展[56]。在PSC患者血清样本中，miR-3178、miR-4484和miR-150-5p水平出现异常改变[57]；血清中miRNA-122水平低可能与预后不良有关[58]；miR-200c的下调可能成为PSC检测的一种新的诊断标志物[59]。利用全血或外泌体中的miRNA建立非侵入性检测的方法尚在研究中，但其对于AILD的诊断和病情监测可能具有重要作用。

三、自身免疫肝病的检测存在问题及未来发展方向

1. 存在问题：自身免疫性肝病发病机制尚不清楚，早期临床症状不明显，病程漫长而病情多变，目前缺乏特异性监测指标，所以对于自身免疫性肝病的诊断和鉴别诊断仍有难度。新的检测指标如细胞表面特定标志物以及微生物组学仍处于实验室研究阶段，尚未应用于临床。

2. 发展方向：高通量测序等技术的不断发展以及对疾病发病机制的进一步研究探索，为新的检测方法的出现提供了可能。随着高通量DNA测序技术的发展，人类微生物组的多样性得到了极大的重视。宏基因组学、宏转录组学和代谢组学分析相结合，可以对人类微生物组进行更全面的描述[60]，这可能成为AILD诊断的和疗效监测的新方向。