Ⅰ型糖尿病相关自身抗体的检测与应用
马荣红，华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科主管技师，免疫学硕士。主要从事临床免疫学检验。参与1项国家重点研发计划及多项国家自然科学基金面上项目，发表SCI论文11篇，其中第一作者／共同第一作者／通讯作者5篇。
全球Ⅰ型糖尿病（T1DM）患病儿童及青少年已超过一百万。中国全人群Ⅰ型糖尿病研究显示我国T1DM全年龄段发病率为1.01/10万人年，其中10岁-14岁是T1DM发病高峰。我国15岁以下人群T1DM发病率与纬度相关，高纬度地区比低纬度地区发病率高[1]。Ⅰ型糖尿病绝大多数是自身免疫性疾病，遗传因素和环境因素共同参与其发病。T1DM患者体液免疫失调表现为许多T1DM患者血清中存在针对胰岛β细胞的自身抗体，如胰岛细胞抗体（islet cell autoantibodies，ICA）、胰岛素自身抗体（insulin autoantibodies，IAA）、谷氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase autoantibodies，GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（protein tyrosine phosphatase-2 autoantibodies，IA-2A）、锌转运体8抗体（zinc transporter 8 autoantibodies，ZnT8A）、四跨膜结构域糖蛋白-7抗体（tetraspanin 7 autoantibodies，Tspan7A）等，本文分别介绍上述6种T1DM相关自身抗体。
一、胰岛细胞抗体（ICA）
ICA是第一种被发现的胰岛自身抗体。1974年Bottazzo等最先采用间接免疫荧光法检测到糖尿病患者血清中的ICA[2]。ICA是一组针对胰岛细胞内多种抗原成分的抗体，相继确定胰岛素[3]、GAD65[4]、IA-2[5]、ZnT8[6]、Tspan7[7]等均为ICA的靶抗原。ICA的靶抗原至今尚未完全阐明，未来也会陆续鉴定出新的ICA靶抗原。
ICA在糖尿病发病前几年就可以被检出，在胰岛素依赖性糖尿病患者的一级亲属中ICA最早在糖尿病发病前30个月就可被检出。ICA在正常人群的阳性率仅为0.5%，而在T1DM新发患者中阳性率高达60%～90%。随病程延长ICA阳性率下降，大部分T1DM病人的ICA在发病2年后消失，T1DM患者10年后ICA阳性者不足5%～10%。在T1DM患者亲属中，ICA含量越高，发生T1DM的风险越高。
二、胰岛素自身抗体（IAA）
胰岛素由A、B两个肽链组成，两个肽链间通过二硫键连接。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸。IAA识别的抗原表位是胰岛素A链的A8～A13残基和B链的B1～B3残基。
T1DM的发病年龄与首次出现抗体时的年龄及IAA的滴度相关。IAA常为出现最早的抗体，持续存在高滴度IAA的人群病情进展更迅速，发病年龄更小。IAA的阳性率与患者年龄相关性较大。IAA在10岁以下儿童新发T1DM患者中的阳性率为50%～60%，而在10岁～30岁新发T1DM患者中IAA的阳性率为10%[8]。在T1DM高风险儿童中，IAA含量到达峰值的时间早于GADA、IA-2A和ZnT8A，且升高的程度也明显高于GADA、IA-2A和ZnT8A[9]。IAA可能与人白细胞抗原（HLA）相关，在T1DM儿童患者中，IAA与DR4和DQB1*0302等位点相关[10]。
IAA作为T1DM筛查的标志物，其阳性率不及ICA和GADA。IAA可出现于其他自身免疫病患者体内，如胰岛素自身免疫综合征、自身免疫性甲状腺疾病、僵人综合征等。使用外源性胰岛素治疗过的患者体内在1周后就会产生针对外源性胰岛素的抗体，所以在应用胰岛素治疗后不建议再检测IAA用以诊断T1DM。
三、谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）
谷氨酸脱羧酶（GAD）是抑制性神经递质γ-氨基丁酸的合成酶，它不仅存在于胰岛β细胞，而且存在于神经细胞、胸腺、甲状腺。GAD有两种同工酶，依据分子量不同分别命名为GAD65和GAD67，人类胰岛细胞主要合成GAD65。
GADA最早发现于一种罕见的神经系统疾病僵人综合征（SMS），1982年在新发T1DM儿童的血清中检测到GADA。GADA可以识别两种不同的GAD65立体抗原决定簇，即IDDM-E1和IDDM-E2。仅10%T1DM患者血清GADA识别IDDM-E1，IDDM-E2为GADA主要识别的立体抗原决定簇。
GADA在T1DM临床发病前和新发病时阳性率约为60%～80%[11]。T1DM患者的一级亲属中阳性率可达9.5%，而正常人群中仅为1.5%～2.5%[12]。有研究发现，在高危人群、新近发病和较长病程的Ⅰ型糖尿病病人中，GADA水平差别不大。在高危人群随访中发现，T1DM患者GADA保持在一个稳定水平，且在T1DM发病后仍持续稳定存在。国内学者报道T1DM儿童患者GADA和ICA阳性率分别为38.7%和45.2%，低于欧美报道的60%～90%和85%，但与日本人接近（GADA36.3%）。亚洲人阳性率低于欧美人的原因可能因为抗体阳性率存在着种族差异。
成人隐匿性自身免疫糖尿病（latent autoimmune diabetes in adults，LADA）属于Ⅰ型糖尿病亚型，GADA和ICA是诊断LADA的主要指标。ICA由于检测方法难标准化，目前临床应用有限。GADA为中国LADA诊疗共识中首选推荐检测的抗体，GADA联合检测IA-2A、IAA、ZnT8A可提高检出率。有研究证实GADA对LADA胰岛功能衰减的预测价值优于其他抗体，GADA高浓度的LADA患者胰岛β细胞损伤更严重[13]。
四、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2A）
IA-2的编码基因定位于人染色体2q35-q36.1，含有979个氨基酸残基，属于受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）超家族中的一员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。IA-2可以影响胰岛素的分泌，也与胰腺β细胞的生长和增殖相关。
IA-2A主要识别IA-2的PTP样胞浆结构域[14]。IA-2A在正常对照人群中的阳性率＜1%，在新发T1DM患者中的阳性率为32%～75%，而这一大幅度的波动也被认为与受试人群的年龄幅度有关。IA-2A的阳性率随着发病年龄的增大而降低。IA-2A在儿童及青少年发病T1DM患者中阳性率可达50%～70%，而在成年发病T1DM患者中阳性率仅为30%～50%。随着T1DM病程延长IA-2A检测阳性率呈现下降趋势。新发病患者、病史＜1年、1～3年、4～9年和10年以上的IA-2A阳性率分别为58.4%、61.3%、40.7%、28.6%和20.5%。在T1DM高风险儿童中，高滴度IA-2A与T1DM的发生发展高度相关。
五、锌转运体8抗体（ZnT8A）
ZnT8由位于人染色体8q24.11的SLC30A8基因编码，包括8个外显子[15]。ZnT8蛋白单体分为A亚型（369个氨基酸）和B亚型（320个氨基酸），现有的研究成果主要针对ZnT8蛋白A亚型。ZnT8可以影响胰岛素的合成和分泌，还可以影响胰岛β细胞凋亡。ZnT8主要表达于胰岛β细胞和少量α细胞中。
ZnT8A主要识别ZnT8胞浆区的羧基末端。ZnT8A常在临床发病前就已存在，有研究发现ZnT8A最早在糖尿病发病前7年就已被检出，对高危人群有着重要的预测价值。ZnT8A的阳性率与年龄的关系：ZnT8A在3岁以下患儿中阳性率很低，大约从3岁开始明显升高；但在青春期后期ZnT8A阳性率高达80%，之后趋于下降，在23～30岁患者中降到58%。ZnT8A的含量在T1DM发病后呈指数衰减，病程第1年内下降最快。在一组GADA、IA-2A、IAA和ICA都阴性的新发T1DM患者中，26.3%的患者ZnT8A阳性[6]。ZnT8A不仅存在于部分LADA患者，还是进行临床分型的重要参考指标[16]。
六、四跨膜结构域糖蛋白-7抗体（Tspan7A）
1996年Anastoot等报道一个分子量为38kD的跨膜糖蛋白，命名为glima38，与T1DM的自身免疫反应早期阶段相关[17]。2016年McLaughlin等通过液相色谱-串联质谱法鉴定glima38为四跨膜结构域糖蛋白-7[7]。2016年Walther等采用荧光素酶免疫沉淀法检测Tspan7A，提出Tspan7A是T1DM的一个体液免疫标志物[18]。
四跨膜结构域糖蛋白-7是四跨膜结构域糖蛋白家族成员之一。四跨膜结构域糖蛋白家族是一组相对分子量为25-50kD的跨膜受体糖蛋白,它们相互作用, 并且与其它蛋白在细胞表面形成跨膜蛋白网络,对各种基本的细胞生理过程进行调控。
在T1DM新发患者中Tspan7A主要识别Tspan7胞浆氨基末端（达39%）和胞浆羧基末端（达22%）[19]。Tspan7A在T1DM白人中的检出率在30%以上，在T1DM中国人中的检出率约26%，但是对于已检出其他T1DM相关自身抗体的人群，增加Tspan7A检测对提高自身抗体在T1DM中的总阳性率贡献很小[20]。在T1DM一级亲属儿童中，如果在IAA、GADA、IA2A、ZnT8A中仅有一种抗体阳性，Tspan7A阳性率为1%；如果有多种抗体阳性，Tspan7A阳性率为21.9%。对于多种胰岛细胞自身抗体呈阳性的T1DM一级亲属来说，Tspan7A是否为阳性，其发展到糖尿病的进程没有明显区别。
增加Tspan7A检测对于中国人群LADA患者的诊断意义比较大，可以提高中国LADA患者的检出率，检出率从22%增加到32.4%。Tspan7A可以作为胰岛β细胞功能障碍的标记物，Tspan7A阳性可以预测LADA患者胰岛β细胞功能进行性下降[21]。
七、T1DM相关自身抗体联合检测在预测和诊断T1DM中的意义
T1DM相关自身抗体检测有多种方法，如间接免疫荧光法、放射免疫沉淀法、荧光素酶免疫沉淀法、免疫印迹法、ELISA法、化学发光法、蛋白芯片法均有报道，文献中使用最多的方法是放射免疫法，但是由于放射性核素的污染，临床实际应用受限。不同试验方法、不同检测试剂检测结果不完全一致,目前尚无标准化检测方法。单一T1DM相关自身抗体检测的灵敏度和特异性均有待于提高，目前常用多种自身抗体联合检测以提高T1DM相关自身抗体在T1DM预测和诊断中的价值。
多种T1DM相关自身抗体联合检测，可以提高胰岛自身抗体检测阳性率，减少T1DM漏诊。在T1DM新发病人中，IA-2A、GADA和IAA三种抗体联合检测的阳性率为94.2%，IA-2A、GADA、IAA和ZnT8A四种抗体联合检测的抗体阳性率为98.2%。
高风险人群表达T1DM相关自身抗体的种类越多，发生T1DM的风险越高。在T1DM高风险儿童中,多种T1DM相关自身抗体阳性的儿童，10年内T1DM发病率为69.7%，其中二种抗体阳性的儿童，发病率为61.6%，三种抗体阳性的儿童，发病率为79.1%；单一抗体阳性的儿童，发病率为14.5%；T1DM相关自身抗体均为阴性的儿童，0.4%在15岁前发生T1DM[22]。
T1DM相关自身抗体的含量与T1DM发病风险显著相关。在高风险儿童中，自身抗体高浓度的儿童比自身抗体低浓度的儿童在10年内发展为T1DM的风险增加2～4倍。
在T1DM发病前后，T1DM相关自身抗体是动态变化的。在T1DM高风险儿童中，首次T1DM相关自身抗体检测中单独IAA或GADA阳性最常见，在持续T1DM相关自身抗体阳性的儿童中，61%会发生多种自身抗体阳性[23]。在进展为T1DM后，自身抗体的种类和浓度会减少，持续阳性的自身抗体主要是GADA，较少是ZnT8A和IA-2A[24]。持续阳性的自身抗体的种类主要受发病年龄和疾病持续时间影响。
IAA和GADA的高亲和力提示出现多种胰岛自身抗体风险增高及更高的T1DM发生风险。IA-2A的亲和力与T1DM的发病风险关系不大。
T1DM患者胰岛移植后，T1DM相关自身抗体持续阳性、阳性抗体种类增多或抗体由阴转阳都预示T1DM复发风险增加。胰岛移植后，ZnT8A转阳晚于GADA和IA-2A，ZnT8A转阳与T1DM复发的间隔时间（0.66年）短于GADA（2.27年）、IA-2A（3.63年），阳性持续时间短于GADA和IA-2A，提示ZnT8A转阳的患者出现T1DM近期复发的可能性大。
T1DM相关自身抗体除了上述六种外，其他自身抗体也有报道，如抗羧基肽酶-H（CPH）抗体、抗SOX13抗体、抗CD38抗体等。T1DM相关自身抗体也可出现于其他疾病，如Ⅱ型糖尿病、僵人综合征、自身免疫多内分泌腺病综合征等。T1DM相关自身抗体的检测目前尚缺乏统一的标准，提高检测的灵敏度和特异性对于预测和诊断T1DM具有重要意义。
