抗血小板抗体检测技术与临床应用

朱明清，副教授，高级实验师。现任职苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所。长期从事血液淋巴肿瘤疾病的流式免疫表型诊断工作。积极推动国内流式教育与标准化进程。参与国内多个临床与实验室的指南和专家共识的编写。江苏省医学会血液分会实验诊断学组副组长，江苏省血液免疫分会实验诊断学组组长，中华医学会检验医学分会血液与体液学组委员，中国医师协会检验医师分会血液与淋巴肿瘤专家委员会委员，中国抗癌协会临床流式联盟副主任委员，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞学组常务委员，中国老年保健医学研究会肿瘤防治分会第一学术部副主任委员，中国生物工程学会细胞分析专业委员会委员，中国慢性淋巴细胞白血病工作组委员，中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会委员。

韩建，硕士研究生，毕业于首都师范大学生物系分子生物学专业。现任苏州元德维康生物科技有限公司市场部经理。专注临床检验项目的解读及临床应用推广，撰写论文5篇。2008年至2011年就职于中国疾病预防控制中心病毒免疫所，主要负责DNA构建及蛋白质表达。2011年至2013年就职于北京昭衍新药研究中心，主要从事药理、药物代谢动力学、药物毒代动力学研究，在此期间被评为北京市技术之星。

特发性血小板减少性紫癜（Idiopathic thrombocytopenic purpura），鉴于病因明确为免疫性，且很多患者无紫癜，故2009年国际工作组将其更名为免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenic purpura，ITP），简称ITP[1]，是临床较为常见的出血性疾病，约占出血性疾病的30%，临床表现持续性血小板减少，皮肤黏膜及内脏出血，对于患者生命构成严重威胁[2]。体液免疫异常产生抗血小板抗体所致的血小板破坏是ITP经典的发病机制，50%～60%的ITP患者血小板表面结合有IgG型自身抗体，可识别血小板表面的一种或多种血小板膜糖蛋白（Glycoprotein，GP），包括GPIIb/IIIa、GPIb/IX、GPIa/IIa、GPIV、GPV、GMP140等。其中约75%的抗血小板抗体都位于血小板膜GPIIb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ复合体上[3, 4]，因此抗血小板抗体检测对于诊断ITP具有较高的敏感性和特异性，可作为鉴别免疫性和非免疫性血小板减少的重要诊断指标。

一、抗血小板抗体检测技术

检测抗血小板抗体的早期方法是以检测血小板是否活化为指标，此类方法原理是检测结合在血小板表面膜糖蛋白上的IgG或补体成分，由于敏感性和特异性偏低而被淘汰。Goldman等[5]将血小板基因分型和血清学检测技术概括为四大类：（1）免疫印迹技术，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。即将血小板裂解后电泳分离，转移到纤维素膜上后与受检血清杂交，然后加入标记的抗IgG抗体，检测是否存在相应的血小板抗体。（2）放射免疫分析，主要包括放射免疫沉淀，使用放射性同位素标记的血小板膜蛋白，与受检血清结合，电泳分离后采用自身显影原理检测是否存在血小板抗体。（3）血小板黏附免疫荧光试验，又称血小板悬浮免疫荧光试验，其原理是将已知血小板黏附于一种特殊的玻璃孔中，与被检血清反应后洗净，以荧光素标记的兔抗人IgG球蛋白避光静置反应后，在荧光显微镜下观察结果。（4）酶联免疫吸附测定（ELISA），包括：①单克隆抗体特异性血小板抗原捕获法（monoclonal antibody immobilization of platelet antigenassay，MAIPA），1987年由Kiefel等报道，首先将血小板特异性抗原固定，然后用待检血清与之反应，以此来鉴定PAIgG，为临床上鉴别免疫性与非免疫性血小板减少提供了特异性诊断方法。②抗原捕获酶联免疫吸附试验（modified antigen capture ELISA，MACE）。1996年Stockelberg等[6]对65例慢性ITP患者血清分别采用抗原捕获酶联免疫吸附试验（modified antigen capture ELISA，MACE）、MAIPA、MACE三种方法检测抗血小板抗体，抗体检出率FCM法显著高于MAIPA、MACE法（FCM：45%、MAIPA/MACE法：35%）。目前国内临床较为常见的检测方法：

1. 流式微球技术（cytometric bead array）：该技术是基于FCM发展起来的一项新技术，以聚苯乙烯微球为反应界面，利用特异性单克隆抗体包被后即可俘获目标物质，通过检测微球的放大作用对一些目标物质进行检测，流式微球技术可以同时检测多个血小板糖蛋白特异性自身抗体，Yang He等[7]用流式微球法及MAIPA法检测50例ITP患者抗血小板抗体，两种方法的敏感性、特异性分别为96%、44%、72.1%、76.7%，FCM显著优于MAIPA，FCM具有耗时短，重复性好，敏感度高，多项目同时检测等优势，进一步提高鉴别免疫性与非免疫血小板减少的准确性。

2. 固相凝集法（solid-phase red cell adherence，SPRCA）：将供者含血小板的血浆加入微量板，使供者血小板固定在孔底，与患者被检血清反应，以抗IgG致敏的红细胞指示反应结果。如果患者血浆（血清）中无血小板抗体，则指示红细胞聚集在反应孔底部中央，形成细胞扣，为阴性结果；如果患者血浆（血清）中有血小板抗体，则指示红细胞均匀分散黏附在反应孔底部表面，无细胞扣形成，为阳性结果[8]。该方法判断结果主观性强，结果难以把控。

3. 微柱凝胶法[9]（microcolumn gel immunoasay，MGI）：依次将受检者血清、多人份混合的O型血小板悬液、指示红细胞加入到微柱凝胶中。指示红细胞上包被有抗人IgG抗体，该抗人IgG抗体通过Fc段与指示细胞接合，如果受检者血清中含有抗血小板抗体，则结合于该抗体Fab段，形成“指示细胞（抗人IgG抗体）-血小板抗体-血小板”复合物，该复合物的分子量尚不够大，再加入交联试剂，则可以将其连接形成网状结构，微柱在一定的离心力的作用下，由于分子筛的效应，这种网状结构浮于凝胶的表面，即为阳性。如果受检者血清中没有血小板抗体，指示细胞经离心后沉于凝胶的底部，即为阴性。

4. MAIPA：其原理为鼠抗人GP单克隆抗体与血小板孵育，后与反应孔底固定的羊抗鼠抗体结合连接，洗涤加入酶联羊抗人抗体和反应底物后比色测定。以此来鉴定血小板特异性抗体，为临床上鉴别免疫性与非免疫性血小板减少提供了特异性诊断方法，可以定量测定血小板抗体[10]。

5. MACE：将患者致敏血小板与单克隆的抗体反应，然后加抗人IgG反应、显色，终止反应后在特定波长下检测吸光度值，结果等于或大于2倍阴性对照值的结果即为阳性。此方法可以检测对HPA、HLA的IgG抗体。

二、抗血小板抗体检测的临床应用

（一）抗血小板膜糖蛋白特异性自身抗体临床应用

1. 鉴别免疫与非免疫性血小板减少：血小板减少症是常见的出血性疾病，病因十分复杂尚未完全阐明，且不同病因所致血小板减少症的临床应对策略也不尽相同，抗血小板特异性自身抗体检测项目在免疫与非免疫性血小板减少症的鉴别排除方面具有较高的敏感性及特异性[12]，对临床医生制定对症治疗方案具有重要临床意义，进而使患者最大限度的获益。①肿瘤化疗相关性血小板减少症[13]（chemotherapy induced thrombocytopenia，CIT）是指抗肿瘤化疗药物对骨髓巨核细胞产生抑制作用，导致的外周血中血小板计数低于100×109/L。CIT为最常见的化疗相关性血液学毒性之一，可增加出血风险、延长住院时间、增加医疗费用、严重时可导致死亡。CIT的发病机制包含多个方面，主要包括血小板生成减少、血小板破坏增加以及血小板分布异常。1）生成减少：化疗药物可对血小板生成的各个环节产生影响，包括抑制造血干细胞和巨核系祖细胞增殖，使巨核细胞产生减少，抑制巨核细胞生成和释放血小板的功能等，最终导致血小板减少；2）破坏增加：化疗药物可导致药源性的免疫性血小板减少症。患者血液中可检测到血小板特异性抗体，导致血小板破坏增多；3）分布异常：化疗药物导致肝窦损伤，肝窦内皮细胞受损并脱落，肝窦阻塞，进而引起门脉高压和脾机能亢进，血小板在脾内滞留和破坏增加，引起外周血血小板计数下降。此类情况多表现为血小板计数持续下降，患者可合并脾肿大和门脉高压等并发症。②感染相关的血小板减少症[14、15]，是由于细菌、病毒、真菌及其他病原体等感染引起的血小板减少，以往认为病原体对血小板的直接破坏、影响血小板生成及血小板消耗增多是其发生的主要原因。目前认为病毒、细菌感染是导致ITP的主要原因，其临床症状是机体感染后的一种天然免疫应答，不同病毒导致ITP的机制不完全相同。微小病毒B19可能是通过非结构蛋白（NS1）介导的对巨核细胞的细胞毒作用导致了ITP；而HHV-6可能直接感染巨核细胞，或受其他单个核细胞HHV-6感染后所产生的某些细胞因子的影响，使其血小板生成功能受到抑制。EBV和HCMV是B淋巴细胞多克隆活化因子，能刺激受感染的B细胞产生与正常组织发生交叉反应的抗血小板自身抗体，从而导致血小板的破坏。目前较为常见的感染诱因为：幽门螺旋杆菌、病毒（RNA、DNA）。③妊娠相关性血小板减少症（PAT）：妊娠期血小板减少是妊娠期常见的合并症，可由多种内外科合并症和妊娠并发症引起，不同原因引起的血小板减少，其母儿预后及病死率相差很大[16]。Schwartz等[17]报道妊娠合并血小板减少的总发生率约7.6%，其中最主要原因是PAT，其次为ITP，以及妊娠期高血压疾病、自身免疫系统疾病、HELLP综合征、白血病等[18]。④风湿免疫性疾病合并血小板减少：系统性红斑狼疮（SLE）是一种多系统受累的自身免疫性疾病。血小板减少是SLE常见临床表现之一，也是其预后不良的独立危险因素。有16%SLE患者在狼疮表现10年前表现为ITP，大约3%-5%ITP发展为SLE[19]。目前认为抗血小板抗体致血小板破坏增多是SLE伴血小板减少较为常见的发病诱因，与ITP发病机制类似[20]。

2. 指导用药：Nieswandt等[21]通过动物实验证实抗GPIIb/IIIa抗体和抗GPIb抗体诱导血小板清除的途径不同，抗GPIIb/IIIa抗体主要依赖Fc-途径清除血小板，而GPIba不依赖Fc途径，可能通过Fc-清除途径在网状内皮系统内诱导血小板活化、聚集和凋亡来清除血小板。随后有研究发现，肝细胞表面的Ashwell-Morell脱唾液酸糖蛋白受体和Kupfer细胞表面的Mac-1整合素能够选择性结合GPIb，使血小板活化和凋亡增加。然而大剂量地塞米松可下调ITP患者单核/巨噬细胞活化FcγRI和FcγRⅡA表达，上调抑制性 FcγRIIB表达，并下调FcγR介导的单核/巨噬细胞吞噬活性。Normura[22]等就报道了抗GPIb抗体阳性的ITP患者对糖皮质激素的治疗反应差。Zeng[23]等也通过对ITP患者血小板特异性抗体的研究，发现仅抗GPIb抗体阳性的患者对糖皮质激素的疗效明显差于抗GPIb抗体阴性的患者，提示抗GPIb抗体与疾病的严重性和难治性有关。也有研究报道，IVIG对于抗GPIb抗体阳性的ITP仅部分有效或无效，可能的原因在于抗GPIb抗体为非Fc依赖性抗体，而IVIG的主要作用靶点在于封闭Fc受体，因而不能有效减少抗GPIb抗体引起的血小板破坏。大量的临床研究数据表明，检测抗血小板膜糖蛋白自身抗体对指导临床用药、制定个体化应对方案具有重要意义。

（二）抗血小板同种抗体临床应用

1. 血小板同种抗体致血小板输注无效（PTR）辅助诊断：血小板同种抗体是免疫性PTR的主要诱因，患者反复输注血小板后血小板同种抗体阳性率为8.2%-60%[24-27]，其中白细胞抗体（HLA）较为常见。对血小板同种抗体阳性患者进行血小板交叉配型输注，可有效避免血小板同种抗体致PTR。

2. 胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）的辅助诊断：FNAIT的发病机制为胎儿与母体血小板抗原不相容，来自母体的IgG血小板抗体作用于胎儿血小板引起血小板破坏的同种免疫性疾病，发病率为0.05%-0.15[28-29]。检测孕妇血小板同种抗体有助于FNAIT的诊断。

总之，血小板作为出凝血的重要组成部分，不管数量还是质量的变化，均会导致严重的出凝血问题，抗血小板抗体与ITP、PTR、FNAIT等多种出血性疾病显著相关，国内外大量研究报道，抗血小板抗体检测可为此类疾病的辅助诊断、风险分级、预后预测、处置方案等提供重要的实验室诊断依据。