多肽自组装技术在临床疾病诊疗中的应用

曹红艳，主治医师。硕士就读于石河子大学医学院免疫学专业，博士就读于解放军医学院临床诊断学专业。第一作者发表SCI论文2篇，影响因子分别为6.35和12.25。研究方向为多肽自组装在疾病检测中的应用。目前就职于北京林特医药科技有限公司，任医学经理一职。

在自然界中，分子可以通过自发结合形成复杂的多组分三维结构，这种自发结合被称为分子自组装[1]。多肽自组装是多肽自发形成有序聚集的过程，例如肌动蛋白分子自组装形成细胞骨架、微管分子自组装形成胞内运输系统[2]。这些多肽具有独特的分子识别基序，能够使相同的多肽分子通过氢键、疏水作用、静电作用和范德华力等非共价相互作用结合在一起，保持在稳定的低能态[3]。多肽可以通过应用不同的刺激，如温度、离子强度、溶剂极性、磁场等改变多肽所处的环境，达到多肽自组装的目的[4-9]；或者是通过非自组装的前体在局部的刺激下（如光[10]或者酶[11]的催化作用）通过化学反应转变为自组装的构件进而进行自组装。多肽易于设计和合成、在结构上易于控制和调节，且具有容易降解、无毒的特点，是研究生物自组装的理想模型系统[12]。这类生物材料具有相当大的应用潜力，包括再生医学组织修复支架[13]、药物传递[14]和疫苗接种[15]等。

在疾病检测方面，目前通常是在中心实验室进行分析。近年来对患者进行早期诊断、快速检测、体内成像分析、诊断和治疗相结合等临床需求不断增加，多肽自组装技术是实现上述改变的关键技术之一。在本文中，我们主要综述多肽自组装在疾病检测方面的应用。

一、病原体检测

聚集诱导发光（AIEgens）是指AIE材料在单分子溶液中不发光或者发光很弱，但在聚集体形成时强烈地发射，荧光急剧增强[16]。聚集诱导发光的出现极大地刺激了发光超分子材料的发展，因为它们在聚集状态下的强发射解决了聚集引起淬灭（ACQ）效应，从而使基于AIEgens的超分子材料成为可能。目前此类材料在发光材料、传感器、生物成像、药物输送和治疗诊断等领域具有广阔的前景[17]。AIEgens和自组装肽的整合是疾病诊断和治疗的潜在策略。Yang等人[18]报告了一种用于诊断和治疗革兰氏阳性细菌感染的敏感和选择性探针。该探针以自组装短肽为骨架，AIEgens为响应性荧光开启基序，万古霉素为靶向基团。探针的体外组装可以打开其荧光并同时增强活性氧（ROS）的生成。该探针通过在细菌表面靶向自组装，对革兰氏阳性菌检测显示出极大的选择性和灵敏度，该探针适用于革兰氏阳性细菌感染的诊断和治疗。

p24抗原被公认是HIV感染早期替代病毒学的生物标记物[19]。由于HIV-1 p24抗原分子量小、空间位阻大，传统ELISA法检测很难提高其灵敏度。我们通过多肽自组装技术，利用多肽在碱性磷酸酶（ALP）的催化下自组装形成β-折叠结构，可以结合环境响应型荧光分子诱导荧光效应的现象，构建多肽-刚果红检测系统。此检测系统可以应用到以ALP为标记酶的ELISA检测体系。通过多肽自组装形成β-折叠结构对荧光信号的联级放大作用，可以提高传统ELISA的灵敏度[20]。此外，我们还通过改变多肽分子的结构，调整苯丙氨酸的数量，进而调节多肽β-折叠自组装效率，实现进一步降低p24最低检测限的目的[21]。通过简单的变换特异性目标抗原或抗体，这种多肽检测系统还可以用于诊断其他疾病。显示了广泛的疾病诊断的潜力，并有可能满足大多数传染病诊断的临床需求。

医疗诊断的快速发展需要具有集灵敏度、小型化、多功能和高集成度的即时检测（POCT）[22]。我们构建并验证了一个多模式检测系统用于检测肺炎支原体特异性抗体的可行性[23]。该系统通过上述检测系统类似的设计，利用多肽自组装形成肉眼可见的水凝胶及多种荧光读取方式，设计了包括水凝胶由肉眼（定性/POCT）、手持荧光紫外灯（定性/POCT）、共聚焦荧光凝胶（定性/实验室）、分光光度法（定量/实验室）以及紫外吸收光谱法（定量/实验室）五种不同的读出模式。这个综合分析系统能同时满足POCT和临床实验室检测需求，与传统ELISA方法进行比对，可以将检测的线性范围扩大3倍，有利于更好地指导临床对于肺炎支原体肺炎的治疗。

多肽自组装材料在进入复杂的生理环境后，其结构的稳定性、蛋白冠的形成等诸多问题给相应的生物研究带来了更多的困难和挑战，王浩课题组在多肽自组装的基础上，提出了“活体自组装”策略[24]，通过多肽原位自组装，可以准确地将诊断探针和治疗药物高效富集到病灶部位，从而实现对疾病的精准定位和靶向治疗。他们将可以特异性识别革兰氏阳性菌的万古霉素作为靶向单元，将能够被感染部位过表达的明胶酶剪切的PLGVRG作为水解底物片段，将焦脱镁叶绿酸-α作为光声信号分子，可以自组装形成J型聚集体，通过聚集诱导滞留（AIR）效应提高了光声信号分子的富集，实现了活体水平对革兰氏阳性菌的检测。“活体自组装策略”既提高了检测的特异性又提高了信号分子的生物利用度，从而实现疾病的精准检测。

二、癌症检测

生物成像在癌症的诊断中发挥着重要作用，尤其癌症的早期诊断对病人的存活率的提高具有重要意义。将酶促反应和自组装结合起来，即酶催化超分子自组装（EISA），通过利用癌症内异常表达的酶，设计酶响应的多肽自组装前体，在肿瘤细胞原位构建自组装体，在癌症分子成像方面的应用取得了显著进展[25, 26]。

基于聚合物为基础的荧光纳米材料对pH值变化极其敏锐，可以普遍成像各种肿瘤，我们[27]设计了一个小分子（DPP-thiophene-4），当pH值为＞7.0时可以自行组装成无荧光纳米组装体，但当pH值为＜6.8时，可逆地拆解回荧光单体。且其荧光发射在0.2pH单位的变化下增加了10倍。这种荧光纳米组合可以利用肿瘤微环境内的酸度区别，精确区分体内正常组织中的一些恶性肿瘤。

Wang等人[28]合成了首个针对Caspase3酶响应的智能光声探针（1-RGD），通过caspase-3触发1-RGD进行快速生物相容性反应并自组装成纳米颗粒，导致放大的光声成像信号，并延长在凋亡肿瘤细胞中的滞留时间，有助于实时和高分辨率成像肿瘤凋亡，检测caspase-3的活性和在肿瘤组织中的分布。

Garrigue等人[29]报告了一种基于两亲树枝状聚合物的正电子发射断层扫描（PET）成像的原始纳米系统，该系统在终端带有多个PET报告单元。这种树枝状聚合物能够自组装成小而均匀的纳米胶束，积聚在肿瘤中以进行有效的PET成像。该树枝状聚合物系统可以检测使用[18F]FDG无法检测到的难成像的低葡萄糖摄取肿瘤。其出色的安全性和良好的PET成像药代动力学特性，为生物医学成像和癌症诊断提供了新的视角。

三、基因诊断

近年来，基于肽的纳米组件在提供新型分子成像纳米探针方面取得了相当大的进展，通过将核酸递送到宿主细胞，可提高诊断成像中的特异性和灵敏度[30]。

在典型的代谢器官肿瘤病变成像方面，An等人[31]报告了原位自组装的近红外（NIR）肽探头，即靶向整联蛋白的RGD识别基序的肽（在肾细胞癌（RCC）中高度表达），当注射到带有原位RCC异种移植物的小鼠体内时，RGD将肽单体靶向肿瘤，在那里它们被MMP-2/9切割并逐渐在原位自组装成纳米纤维。纳米纤维探针在肿瘤病变中具有肿瘤特异性排泄迟缓（TER）效应，从而能够实现人类肾细胞癌（RCC）的高性能成像。此外，在离体人类荷瘤肾脏中还能够精确识别1毫米以下的病变，与传统手术相比，这种基于TER策略的NIR肽探针是检测不同代谢器官肿瘤的一种很有潜力的方法。

它与酶的类似物相比，含有L-和D-异构体的肽自组装通常会导致具有增强特性的纳米结构，Jeena等人[32]设计了一种线粒体穿透三肽，内含二苯丙氨酸（FF）建筑单元，由于线粒体的定位能力，因此命名为Mito-FF。Mito-FF与它的镜像对Mito-FF，自组装形成直径约100nm、长度0.5-1μm的超纤丝，而对映体仅形成直径10nm的细纤维。Mito-FF和Mito-FF联合给药在体外和体内均可引起剧烈的线粒体破坏。在线粒体内观察到通过外消旋混合物（Mito-Rac）共组装形成的超原纤维，导致体外和肿瘤异种移植物中的线粒体被破坏。此外，SPECT/CT（单光子发射计算机断层扫描与计算机断层扫描相结合）成像显示肿瘤周围应用的有效肿瘤定位123I-放射性标记的Mito-FY和Mito-fy肽。这项研究揭示了手性在调节生物应用超分子肽组装方面的潜力。Guo等人[33]通过静电相互作用诱导的自组装，构建了具有可调尺寸的近红外荧光（NIRF）和磁共振（MR）双成像复合纳米粒子/聚肽可调纳米蛋白。这些共同的纳米蛋白由Fe3O4磁性纳米粒子表面装饰有多丙烯酸和Cy5.5改性多l-赖氨酸（PLL-g-Cy5.5），产生用于NIR 荧光和磁共振成像（MRI）。胰蛋白酶反应性纳米颗粒在胰蛋白酶水解PLL后选择性分解，导致近红外荧光放大18倍，增强MRI信号。体内研究表明，该探针可用于通过NIR荧光和MR双重成像来定位过度表达胰蛋白酶的恶性肿瘤。

小结：本文综述了多肽自组装在疾病检测方面的研究进展。多肽自组装因其特有的性质为疾病的检测提供了新的方向。多肽自组装用于疾病的检测可以通过设计新型多肽、结合不同组织器官的靶向、各种刺激响应（酶、光、温度等），联合指示信号（AIE、磁共振、光声成像等）以及临床常用检测体系（ELISA、传感器）的策略，构建用于不同检测目的的多肽自组装检测系统。因此，随着对多肽自组装研究的深入，在未来疾病的检测领域将会有进一步的发展。