微流控生物传感器检测技术与临床应用
李祖兰，主治医师，医学博士。专业特长：肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、肠癌等基因检测、染色体核型分析、生化检测、免疫检测及微生物检测等技术，具有22年丰富临床检测经验。学术研究方向为血小板功能试验质量控制和纳米材料微流控免疫检测的研究，发表学术论文20余篇，其中第一作者SCI论著最高影响因子为10.257，参与撰写血小板功能试验标准化专家共识，多篇论文学术交流获“三等奖”和“优秀论文奖”。
本文综述了微流控免疫传感器的研究进展，主要介绍微流控生物传感器分类、基底材料、基底材料的表面修饰、抗体固相化、检测、信号放大和在微流控装置上实现多分析物免疫分析。在不影响蛋白活力的情况下抗体固定，表面修饰作用主要防止非特异蛋白质吸附。通过改进制造工艺，整合自动化分析系统，可以大大减少分析时间和试剂消耗，新兴的微流控免疫分析技术有助于推动药物研发，临床和医疗诊断水平的提高。
自上个世纪60年代末，酶联免疫吸附法等定量免疫学方法在临床实验室、基础研究等领域应用得较多。通过这些技术我们能够获得大量重要临床分析物信息，如疾病生物标志物、抗体、病毒、细菌等。但微量滴定板进行免疫测定通常存在样本处理过程繁琐、耗时，样品、试剂消耗大等缺点，新兴的生物分析技术——微流控免疫传感芯片有望克服这些问题。
微流控免疫分析装置具有高比表面积和纳升体积微通道等优点。无论是均相还非均相，是直接竞争ELISA、间接竞争ELISA还是双抗体夹心ELISA，均与微流控模式兼容。与传统的ELISA相比，这种微通道可以直接作为免疫反应室，用最小量样品、试剂检测，将分析时间从小时降低到分钟。微流控免疫传感器还可以与阀门、搅拌器和探测器等整合，大大提升其分析能力，而且还可以向床旁即时检测、便携式、多分析物同时检测等方向发展。
自从上个世纪90年代初，新型的芯片上实验室（Lab on chip）提出以来，微流控生物传感器成为了全世界范围关注的焦点。其所有的检测程序，包括样本预处理、样本采集、试剂混匀、反应与未反应成分分离和信号输出过程，都可以在一张微型芯片中完成，可以实现从小分子到病原菌的高灵敏度、低消耗检测[1]。此外，还可以实现小型化装置、控制细胞培养条件、检测时间大大缩短和样品量[2]减小。生物传感器有望替代传统检测方法（如ELISA），适用于监测各种病原体或分析物，对医学健康、食品行业、农业发展和生态保护等领域具有很重要的意义。
一、微流控生物传感器分类
生物传感器主要分为光学、电化学和压电类传感器等，以荧光、光吸收、电流、电阻抗、电位、位移和振动等为输出信号。目前主要的传感器种类如图1。
图1. 传导器分类
注：（A）光学传感器；（B）压电类传感器；（C）电化学传感器。
1. 光学微流控生物传感器：光学传感器具有制造简单、成本低等优势（图1A），通过荧光、光吸收、反射率的变化等输出信号采集，可以实现对分析物的检测。比色技术利用了传感材料与分析物的相互作用所产生的尺寸大小或浓度变化引起颜色变化而实现检测。在实验室最常见的光学技术是酶联免疫吸附法（ELISA），可检测生物样品中的抗体、抗原、DNA、酶和小分子等。微流控生物传感器在采用生物发光技术的检测中，探究了培养细菌样本发光与对照生物样本发光模式的差异[3]。虽然光学微流控生物传感器不能确定目标检测物类型，但灵敏度高、省时、操作简单[4]。
修饰后功能化纳米材料具有很多优点，如抗肿瘤活性、高表面与体积比、优越光电特性和电导性好等，该领域使用最多的技术是表面增强拉曼散射（SERS）和局部表面等离子体共振（LSPR）。表面增强拉曼散射技术可以通过内部和外部检测两种方式检测分析物[5]。内部检测可以直接获得分析物的分子特征，该方案只能适用于一些具有明确拉曼光谱的小分子；外部检测采用具有拉曼效应分子标记目标生物标志物技术尤为关键，来进行检测。金和银纳米颗粒是SERS方法中常使用的无毒、抗光漂白标记的两种材料[6]。
局部表面等离子体共振（LSPR）技术就是把导电的纳米粒子置于周围波长大于其尺寸的波中相互作用，相关局部区域发生了具有共振频率的等离子体振动，具有共振频率的光被吸收或散射，即LSPR现象。这种技术即使是捕获目标检测物引起的不明显折射率变化也能探测到[7]，灵敏度非常高。
由于尺寸、浓度变化或一些新物质产生引起颜色变化，可实现大多数比色技术检测。比色技术是一种定性、方便的读出方法，但也有基于酶反应定量研究被报道[8]。荧光检测的光学技术，仅适于检测自带荧光的目标检测物，如量子点。但大多数目标分析物都不自带荧光的，故采用荧光分子标记分析物是采用荧光检测的关键步骤[8]。方法缺点是不能提供关于分析物结构的详细信息，还需提供复杂的检测设备如质谱仪，这就限制了荧光光学法在床旁即时检测领域的应用[9]。与比色技术类似，该技术包括孵育和标记步骤。检测过程很耗时，这种方法对连续监测并不适用。
基于光学的生物电子传感器，如福斯特共振电子转移（FRET），量子点主要应用于这类系统，其工作原理为电子从激发态量子点转移到目标生物标志物，与目标分析物接触瞬间导致量子点荧光淬灭[9]。上述常见的光学方法如图2所示。
图2. 光学法微流控生物传感器分类
注：（A）表面增强拉曼散射（SERS）生物传感器[6]。（B) 局部表面等离子体共振（LSPR）的生物传感器[7]。（C）荧光生物传感器，量子点荧光随其大小而变化，这在荧光生物传感平台上非常适用。（D）光学电子（FRET）的生物传感平台[8]。
2. 电化学微流控生物传感器：电化学生物传感器（图1C）是各实验室研究最多的传感器，该传感器成本费用低、灵敏度高、反应背景低、重复性和便携性好，可分为电阻抗、电导、电流和电位传感器。电化学微流控生物传感器可以不通过读出装置直接测量样品信号，因此可以开发为便携式床旁即时检测设备[10]。由于分析物的固定作用，信号可以以电流、电导、阻抗或电压变化触发的形式显示。电化学技术通常评估电位或电导的变化，恒定或可变电位下的电流变化[11]。
电化学生物传感器的工作电极上固定反应物或分析物，与辅助电极构成完整的电流回路。这两个电极必须由导电性和化学性质稳定的材料制成，如：铂、金、石墨和硅胶化合物。参比电极主要由银组成，电极表面覆盖氯化银。电化学生物传感器可采用不同的运行程序，也称自主功能传感器[12]，主要分为：离子选择性电极（ISEs）[13]、涂层电线电极（CWEs）[14]和场效应晶体管（FETs）[15]。
3. 压电类微流控生物传感器：压电类生物传感器是应用最多的技术，该技术利用机械的变化作为输出信号，如位置变化移动、力变化或质量变化等形式输出，直接或间接的微机械转导（见图1B)，测量随着传感信号变化而变化的共振。如石英晶体微平衡器（QCM），具有表面应力[16]、声学[17]、膜[18]等压电性能技术，其中膜技术以偏转、共振频率变化为输出信号[19]。
二、基底材料
微流控装置基底材料是一个至关重要因素，而基底材料表面化学性质和光学透明是微流材料性能主要决定因素。芯片内部的表面处理和流体处理主要受材料表面性质的决定，而检测方式则由其光学特性决定。近10年来，硅、玻璃和聚合物是微流控免疫分析主要的基底材料。硅起源于半导体行业，其优点是物理化学性质得到了很好的表征，制作方法很成熟几乎能够生产任何几何图形的技术微结构、精度非常高；硅缺点是在光学上紫外线/可见光区并不透明，但紫外线/可见光区是大多数生物分析的检测波长范围[20]；硅的微芯片制造需要昂贵的设施从而限制其实现商业化。玻璃作为基底材料具有良好的耐化学性腐蚀性，为生物分子检测的提供优秀的光学性质。并兼容压力驱动和电动驱动两种流体转运。尽管如此，用玻璃的微细加工也比较昂贵，比如常用的各向同性湿法蚀刻方法。硅、玻璃及其混合微装置需要使用昂贵、先进的设备，令人满意性能的材料在微芯片毛细管电泳和电化学免疫测定等的应用中仍有待开发。
聚合物材料是大规模生产的理想材料，优点易于微加工，如注射成型、压塑、挤出、热压花和复制等，成本低、可复制性强；优越的物理化学特性，如耐化学腐蚀性、光学透明度好、自发荧光低、无荧光紫外线吸收，良好的材料性能与玻璃相当[20]。聚合物材料具有不同的表面化学性质，故针对不同的抗体或抗原固定技术有多种选择。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是用于微流控免疫分析最主要的基底材料，这是由于其微加工过程简单，成本低和可靠等优点[21]。聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等聚合物也是较常用的基底材料。文献报道，聚碳酸酯（PC）-聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合微芯片，并结合铕纳米颗粒（EuNPs）用于流感病毒的检测[22]。Miyazaki CM，Mishra R等采用简单方法来生物功能化聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），利用分层技术，他们组装了聚乙稀亚胺（PEI）和氧化石墨烯的纳米结构薄膜[23]。Zeonor是一种环烯烃聚合物，具有稳定的尺寸和较长保质期。与PDMS相比，Zeonor具有透明度高、光学纯度好、自荧光低，具有良好的耐化学腐蚀性等优点，作为微流控免疫分析的基底材料受到了一些关注[24]。Bhattacharyya和Klapperich展示了微流控免疫传感器的进展，能够快速、可靠、即时检测C反应蛋白（CRP），一种人类血清中炎症标志物[25]。此外Laib和MacCraith提出了一种新的方法，即通过血浆和液体化学处理，然后涂覆聚电解质来将DNA和抗体固定在Zeonor上[24]。Fakunle ES和Fritsch I将低温共烧陶瓷（LTCC）材料与丝网印刷金（SPG）电极用于独立的酶联免疫吸附测定与电化学检测，实现了电化学检测5.0ng/mL小鼠IgG[26]。Costa MN和Veigas B把简单、成本低的传统纸作为微流控应用的基底材料，赋予传统纸质产品的新功能[27]。高分子材料在实现床旁即时检测中起着重要的作用，也是理想的一次性材料。
最近几年，随着纳米科学技术快速发展，具有独特结构和形貌的静电纺丝纳米纤维在科学界受到越来越多的关注。这些纤维已经出现在许多领域，如医学诊断，组织工程、药物载体、太阳能电池、催化剂、能量转换和存储、物理和化学传感器等。灵敏、快速的生物传感器平台发展迅速，引人瞩目。静电纺丝纳米纤维膜具有许多优越性能，如高比表面积，与生物活性分子类似的尺寸等，成为生物传感平台的最有潜力候选者。M. Mahmoudifard等开发了一个新的免疫分析平台，基于蛋白质分子共价固定于聚醚砜静电纺丝纤维膜表面[28]；另一个团队Hosseini等人开发基于新生物材料特别是纳米纤维生物传感器[29]，他们报告了一种检测登革热病毒的的免疫分析方法，该方法采用静电纺丝聚甲基丁酸酯（PHB）纤维。萨迪尔和同事[30]也采用不同的基底开发了基于纤维的ELISA系统：即静电纺丝聚乳酸（PLLA）和醋酸纤维素纳米纤维，以及商用卫生棉签微纤维，基于纤维的ELISA成功地检测C反应蛋白（CRP）。
Lee等人[31]报道了采用安聚体固定静电纺丝聚苯乙烯（PS-PSMA）纳米纤维作为传感基底，制备用于检测蛋白质的生物传感器。蒙达尔和同事们[32]开发了一种基于酯化胆固醇的电化学检测方法的生物传感器，采用静电纺丝技术制备具有介孔特征的二氧化钛纳米纤维，经表面修饰后可作为检测基底。
王和他的同事[33]也报告了使用交联和金修饰聚乙烯醇（PVA）静电纺丝纳米纤维膜，电化学法检测模型分析物—过氧化氢。作为另一种方法，Unal等人[34]制造了一种电化学生物传感器，采用静电纺丝制备PVA/PAMAM G2蒙白云石粘土的复合纳米纤维，吡喃糖氧化酶类固定在玻璃状碳电极表面上，PVA/PAMAM-Mt修饰的静电纺丝纳米纤维作为反应基底。ARezaei和他的同事[35]还开发了一种搅拌型纳米纤维—羧化多壁碳纳米管（CMWCNT）嵌入式夹层型电化学免疫传感器，用于检测心衰标志物肌钙蛋白I（cTnI）。在聚苯乙烯/CMWCNT/PEG纳米纤维静电纺丝后，通过去除聚乙二醇（PEG），获得搅拌型纳米纤维（WNFs），可应用于酶标记传感层cTnI的安培式免疫分析。李等[36]采用静电纺丝制备二氧化钛纳米纤维作为微流控反应基底（如图3），并使用OPA和PEO-PPO-PEO对纳米纤维进行表面修饰，可快速、灵敏地检测HIV-1 p24和白介素-5（IL-5），该微流控免疫分析装置具有高比表面积和微升体积微通道等优点，所需试剂量少（15µl/通道），可以大大节约试剂成本，有较好的应用前景。
图3. TIO2纳米纤维制备和免疫检测过程流程图
（A）静电纺丝制备TiO2纳米纤维和三明治结构式微流控芯片：TiO2纳米纤维膜夹在具有7个微流控通道PDMS和底部PDMS板之间构成微流控芯片；（B）TiO2纳米纤维表面修饰和ELISA免疫检测过程；a）介孔纳米纤维；b）OPA修饰在纳米纤维表面；c）TiO2纳米纤维表面OPA捕获固定一抗；d）PEO-PPO-PEO封闭纳米纤维；e）一抗捕获待检生物标志物；f）生物标志物与检测抗体特异性反应，加入化学发光底物即可信号读出。
三、表面修饰及抗体固定
具有较高的比表面体积的小型化装置能明显缩小扩散距离而大大降低分析时间，也提高了抗原/抗体与材料表面分子的作用几率，但可能会导致蛋白质活性降低和反应背景增强。因此对基底材料进行表面修饰以降低反应背景，使分析的结果更加准确。表面修饰是通过物理或化学方法，物理表面修饰是一种简单地将蛋白质吸附在基底材料表面的方法，比如传统的表面封闭剂牛血清白蛋白（BSA）。化学表面修饰是通过共价键将表面修饰分子结合在材料表面[37]。Liu J，Zhao J等使用简单的环氧硅溶胶-凝胶涂层/键合方法制备了聚碳酸酯（PC）-聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合微芯片，并结合铕纳米颗粒（EuNPs）对流感病毒的检测，溶胶-凝胶材料的结合提供了功能化的通道表面，可用于一抗的共价固定化[22]。Miyazaki CM，Mishra R等采用简单而多功能的方法来生物功能化聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），通过（PEI/GO）5膜的表面处理，明显增强了PMMA表面润湿性和抗体结合能力[23]。聚氨基甲酸乙酯（SBMA）水凝胶涂覆在聚氨酯（PU）基板上，具有较高的亲水性，7天内性质稳定，并且减少了80%的表面吸附纤维蛋白原和人皮肤成纤维细胞[38]。
熔融石英毛细管可用作微流控免疫传感器[39- 41]，Ligler及其同事也报道了使用熔融石英毛细管作为免疫传感器[39]的早期工作。此外，Balakirev和他的同事们使用一种光活化剂苯甲酮衍生物做了一个简单的实验，将光化学模式的寡核苷酸和蛋白质固定在毛细血管内壁上[40]。萨利姆等研究了在蛋白质的浓度、孵育时间、缓冲液pH、缓冲液离子强度和流动的影响的条件下，将生物分子吸附在玻璃上的微通道表面[41]，这种微流控毛细管模式来实现免疫检测。
聚合物表面是疏水性的，在疏水表面上与抗体相互作用易导致抗体变性，导致其活性低下，因此使表面具有蛋白兼容性很有必要。例如，Bai等人使用了含有胺的轴承亲水性聚合物，用聚乙烯亚胺简单地对PMMA芯片表面进行钝化处理[42]。常规方法直接采用通过紫外线照射，氧化法制备PDMS表面亲水材料[43]、氧等离子体处理[44]和二氧化碳脉冲激光[45]，Si-OH极性基团又转回到本体聚合物中，以尽量减少表面能，这些方法暂时使PDMS表面亲水[46]。一些目前的方法使PDMS具有更稳定的亲水表面[47]，如聚合物接枝、化学功能化[48]、表面用磷脂聚合物[49]处理，支持双分子层细胞膜（SBMs）[50, 51]和水解酶（hydrophobins）[52]。YU等人开发了一种简单而可靠的方法，通过氨丙基三乙氧基硅烷、戊二醛、聚乙烯醇和戊二醛的相继引入而使PDMS表面钝化[48]。与未修饰组PDMS比较，这种功能化修饰产生了一个均匀的表面并尽可能的吸附固定兔抗体IgG，可提高灵敏度（1pgmL-1）。另一种有趣的表面修饰方法是使用的仿生膜SBMs，Cheng的小组重点研究了SBMs在PDMS表面性能和稳定性，其中利用链霉亲和素层来改善SBMs的空气稳定性，这使得非特异性吸附比没有膜涂层的PDMS表面减少了100-1000倍[51]。
一种叫“疏水剂”的新型表面修饰剂用来提升PDMS传感器的分析性能，它是一种小的、富含半胱氨酸的两亲性真菌蛋白，能够自我组装，将疏水表面转化为亲水表面。因此表面修饰不仅可以降低反应背景，还有利于吸附更多蛋白质如抗体、抗原。基底材料表面单分子层的形成和物理吸附有利于这些蛋白质固定，其中起关键作用的化学功能基团有环氧化合物、叠氮、羧基末端和硫醇等。
抗体/抗原固定化技术的主要目的是通过考虑构象、迁移率限制或传质限制等因素，以及在微流体装置内的位置选择性固定来提高蛋白质的活性。用于蛋白固定的特异性试剂有聚乙烯-生物素化聚乙二醇[53]、生物素基寡核苷酸[54]、聚邻苯二胺[55]和光接枝抗体[56]。Sebra等人通过嫁接合成方式将丙烯酸抗体固定在聚乙二醇单丙烯酸[56]表面。
生物材料选择性固定是一种重要的技术，它能够在单个微流体设备中同时分析不同的抗原。光刻和软光刻是实现微通道内位置选择性固定的两种主要技术。在光刻技术中，抗体的图案是由掩模决定的，其中微通道的特定部分暴露在紫外线下进行化学反应。例如，Park等人将抗体固定在光聚合（365nm光照射）的甲基丙烯酸缩水甘油酯[57]上。Lee等人展示了一种新兴的光刻方法，利用低熔点琼脂糖来构建两种不同蛋白质[58]的排列模式。微接触印刷是软光刻技术的一种，它可以使抗体固定到微通道中，并从蛋白印迹固定在预先形成的PDMS表面上。Delmarche等人利用微接触打印技术在微观结构[59]内的绘制蛋白质。在一份报告中，他们研究了在不同的模型平面表面（玻璃、Si、Si/SiO2、Au）和Au衍生化硫代聚乙二醇（HS-PEG）上印迹的效果。此外，还确定了微观结构宽高比（深度:宽度）对蛋白质转移和产生的图案的准确性的影响。研究发现，Au衍生化HS-PEG为蛋白质图形化提供了更具有生物相容性的表面，为纵横比小于1:6的微结构可以实现准确的蛋白质微接触打印[60]。Kaji等人通过电化学方法在已经组装好的微流体装置中开发了一种按需模式的蛋白质。该技术利用了亚溴酸在微通道的微电极上生成，使肝素涂层微通道从防污切换到蛋白粘附[61]。
四、流体输送和操作
流体在微通道内流动形式是层流，粘滞力起着主要作用，而不是惯性力。微结构内部缺乏混匀或紊流混合装置，分析物如抗体或抗原的大规模运输主要受对流和扩散控制。压力[62-69]和电动驱动[70-76]流动是微流控芯片免疫测定使用最广泛的流体输送方式。在压力驱动流体中，生物材料在微流控免疫传感器内传送，注射泵或真空作为一种主动流驱动装置来辅助驱动，这种主动流驱动可以广泛用于液体驱动。由于设备所承受的压力，密封微通道是必要的手段。用手动操作注射器，Linder等人演示了一个简单的、可靠和无阀门微流控分析系统，包括存储、按顺序传送各种检测试剂、缓冲溶液进入微流控，采用非均相免疫分析检测艾滋病毒[63]。
微泵如蠕动泵只需较少的工作空间和外部连接，非常适合微流控芯片集成[64]，缺点是蠕动泵的液体流动路线通常是非直线的，流体处理会有一定困难。Zubtov等人提出了实验和理论评估基于凝胶的免疫传感芯片，是使用蠕动泵进行混合、基于反应-扩散动力驱动的芯片[65]。目前的被动流体处理技术，如毛细管泵，重力诱导流体[62, 66]和真空PDMS泵[67]由于其简单和易于操作，被动流体处理技术获得一些领域的关注和研究。细川等人使用真空PDMS进行了连续注射，用于各种相关溶液的免疫测定，即所谓的无电源序列注入（PFSI）[67]。这些被动流体传送技术提升了床旁型生物诊断芯片的性能。流体输送的自动化是一些研究者需要在微流体免疫测定领域要解决热点问题。
电动驱动流动是一种非常稳定流体驱动，在微观总分析系统应用中能适应自动化。在电动流体中，一种自动装置开关模块用于控制某芯片贮槽上的电场。这允许在整个测定过程中控制特定的流体流动操作[68, 69]。然而，只有导电液体可以用于这种类型的流体驱动。最近的研究关于其在微流体免疫分析中的应用涉及反应-传递过程的模拟[70, 71, 75]，芯片上胶束电动色谱法（MEKC）[72]，负介电泳[74]，瞬态在线预浓缩等速电泳[76]等。Gao等人进行了数值模拟微流体网络内部传输过程的研究，并进行芯片上电动力学控制异相免疫分析法用于多种分析物的检测[69]。此外，Shackman等人还提出了一种新的片上芯片电泳分离称为梯度洗脱运动边界电泳（GEMBE）。这利用流体动力学的本体逆流和电泳迁移来分离的免疫反应产物。从八个不同的通道中取校准点，演示了均相免疫分析法[73]。
流体控制和操纵，处理微流控芯片中预装的试剂溶液，仍是早期考虑的。采用微阀控制免疫传感器流体的量和流向，特别用于异相免疫测定需连续的溶液传送，有利于微流控实现。一些目前的成就：微阀集成在微流控生物芯片上有扭矩驱动阀[77]、鱼骨阀[78]、膜基阀[79]和通过直接电润湿操作阀[80]。其中膜基阀是最常用于芯片上有活性阀门中的一种。奎克和同事们都很巧妙采用多层软光刻技术演示了一个简单的单片微加工[81]。该工作已应用于PDMS芯片进行高通量多抗原免疫分析[79]。然而，从集成的角度来看，主动阀（活性的阀门）不方便使用，因为它需要一个单独的、更繁琐的制造程序。这一技术的发展趋势是制造无动力微阀而不是需要额外的驱动部件，并提供简易的微芯片集成。例如，Lu等人开发了一种鱼骨微阀，基于超疏水性的概念，他们成功地展示了它集成CD样ELISA装置[78]。
微流控免疫芯片体系另一个重要部分是微流控混频器，微流控设备性能主要取决于在扩散混匀上，因为达到完全混匀相对较慢，芯片微型混频器有助于快速混匀样品溶液。特殊微加工工艺和微球技术是应用到芯片搅拌器一些方法[82-84]。Golden等人在微通道上设计了凹槽作为微混合器[82]，这些微凹槽有助于目标生物样本的从液体传递到受体表面并防止在表面形成的耗尽层。除了通过微细加工技术的无动力微混合器，微粒子[83, 84]也可开发用于扩散混合。卢卡斯等人使用了高碳酰化的聚苯乙烯/有机玻璃微球促进扩散混合[83]，赫尔曼等人利用了磁珠的磁性混合能，磁珠作为反应性免疫复合物的形成的固相支持[84]。特别在微流控装置内部实施检测时，微粒增强免疫分析效率是由于表面积的显著增加而实现的。在一个微流控装置中，微流控模式特别有利于分析时间缩短，主动或被动混频器有助于混合是一个重要的模块，而不是取决于基于对流和扩散流体运输。
五、检测和信号放大
标记功能一般用于免疫测定技术，采用光学或酶标记抗原或抗体，这可能有助于信号放大。免标记检测优点可在其原生状态下定量蛋白质。目前主要有三种检测技术：荧光[85-86]，表面等离子体共振（SPR）[87-89]和电化学[80, 90]。由于荧光检测提供良好的分析灵敏度和较强信号，故荧光检测是光学检测的主要方式。采用荧光或酶标记抗体或抗原是两种传统标记技术。抗原与荧光抗体结合时可以通过荧光观察、直接监测免疫复合物的形成。常用的商用荧光标记基团有Cy系列（Cy5、Cy3等）、荧光异硫氰酸盐（FITC）、异硫氰酸四甲基罗丹明和Alexa系列。这些荧光团的灵敏度是取决于它内部的量子产量。酶标记抗体通过酶反应产生荧光量显示其信号，由于荧光的积累可获得更高的灵敏度。碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶（HRP）是两种使用得最多的酶标记物。例如，Endo等人开发了一种免疫传感器芯片采用竞争性免疫分析法用于污染物检测，它以聚苯乙烯珠作为固相的支持抗体在微通道中发生反应和样品溶液含结合HRP和不结合HRP的抗原，能检测线性范围为0.1pgmL-1到1.0gmL-1共面的多氯联苯（Co-PCBs）。使用酶标记抗原或抗体是一个信号放大技术，目前有多种新颖、简单的放大信号策略。例如，Shin等人使用包被珠技术，提高灵敏度，插入预浓缩模块在便携式的床旁即测测试装置并包含小型荧光检测系统的装置，检测限为1.4nM的C反应性蛋白（CRP）抗原。Hosakawa等人开发了一种有趣的信号放大方法—树突放大（DA）。DA是一种三明治免疫分析法，即一个生物素化二抗和FITC标记的链霉亲和素和生物素化的抗链霉亲和素反应，最终形成树突状网络结构层流。
在微流控免疫测定应用中，纳米颗粒可以替代酶或荧光标记在蛋白质上，如金纳米颗粒标记在抗原或抗体上，在光学信号放大的研究进展中做出巨大贡献[91-93]。与荧光标记相比，金纳米颗粒将入射的白光散射产生我们肉眼可见的单色光，产生光强是荧光素标记分子的10万倍[94]。一种被称为生物条形码的间接异相免疫分析法在诊断性的微流体芯片中利用磁性粒子和金纳米颗粒的结合进行了前列腺特异性抗原（PSA）检测，检测低限为500aM[92]。Bailey等人引入了一种称为DNA编码抗体库（DEAL）在单个微通道进行检测，可快速多蛋白检测通过利用化学扩增纳米金标记的二抗，该方法的白介素-2检测限可达到10fM，敏感性是模拟ELISA法150倍[93]。值得一提的是DEAL方法能够在同一个诊断平台上对ssDNA，蛋白质和细胞进行联合检测。各种蛋白质标记检测技术和荧光信号放大方面快速发展，其它荧光检测技术如表面等离子体荧光光谱法（SPFS）和全内标法反射荧光显微镜（TIRFM）正应用于微流体免疫分析。YU等人巧妙地演示了SPFS应用程序来检测血浆中游离的前列腺特异性抗原[85]。这该方法利用了表面等离子体模式放大在金属-液体界面激发荧光分子光信号。另一个有趣的进展是全内标法反射荧光显微镜启用其内部的激光反射在液界表面，用于激发荧光分子[86]。此外，在这微流控免疫分析领域中还有很多其他的光学检测技术很有价值，如化学发光[95]、静态光散射[96]、磁电子[97]和成像椭圆光度法[98]。Tsukagoshi等人开发了一种微处理总分析系统，其化学发光检测用于癌症标记物的测定[95]。卢卡斯等人，报告了使用光纤来检测来自微流控免疫分析光静态散射可间接检测血管炎标志物，抗PR3[96]。与此同时，Mulvaney等人利用光学计数或磁电子技术作为检测模式实现了对蛋白质的多路径、飞摩尔检测[97]，他们在异相微流控免疫分析使用微珠标记二抗。此外，Wang等人利用椭圆偏振成像技术，实现了一套完整的测量系统。免标记蛋白质微流控芯片系统测定乙型肝炎5种标志物的浓度[98]。SPR和电化学检测广泛用于间接或非光学方式的免疫传感器。在SPR模式下，免疫传感器基于在SPR中角度偏移，源于一种免疫复合物形成于抗体或抗原修饰的金属表面。例如，Kurita等人展示了一种芯片上的酶免疫分析法检测心脏标志物，B型利钠肽（BNP），是一种微流体装置与便携式等离子体共振相结合系统[89]。在电化学检测中，蛋白质用酶或电活性标记分子。安培法是小型化的理想接受者，微电极的尺寸变得更小，能非常有效收集电活性物质[99]，显著提高了灵敏度。该技术称为交错阵列（IDA）电极技术，它具有电活性物质电化学循环的特点使信号放大[100]，是一种集成在芯片上电化学检测器，便于携带。纳什达等人展示将注入、冲洗和电化学传感的功能结合在单一微流体装置中。他们把甲胎蛋白（AFP）或抗人AFP抗体固定在铂工作电极，然后孵育抗原和葡萄糖氧化酶标记的二抗，其AFP检测限为0.1ng/ml[80]。Carbonara和Sohn引进了一种免标记免疫传感器，称为电阻脉冲传感器。它的核心是粒子通过孔隙使导电液体发生位移并产生脉冲，可以观察到电阻减小。另一种免标记技术利用了石英晶体微天平（QCM），其免疫感受器固定在石英薄片电极上，能检测抗体和抗原之间的结合亲和力引起的共振频率变化。
六、多个抗原分析
在微分析系统和芯片领域中，在单微流控装置中多个抗原同时检测是一个发展趋势，可以进一步提高分析性能检测更多的样品或分析物，因此大大减少了每个分析物分析时间。对不同蛋白质的同时分析有助于评估对某些化学或生化扰动的相关生物反应，这些反应可能导致生物标志物的发现。目前的一些微流控免疫分析就是面向多抗原/样品分析开发各种技术，如平行微通道免疫测定[84, 87, 101-102]，微流控微球阵列[57, 66, 103]，排列电极[55, 104]，亲和微柱[105]，电动力学控制免疫测定[69]和微型盘免疫测定[106-107]。高通量微流控免疫测定也可以是微装置设计的一种功能[79, 108]。引入了集成各种功能的毛细管并含有不同的抗-IgGs，如人、羊、鸡，毛细微阀装配在PDMS晶格微通道上，形成毛细管组装微芯片（CA-chip）[101-103]。另一种方式是通过使用微珠阵列技术集成各种生化功能在一个防交叉污染传感器微装置。ZHOU等人开发一维模型微流控微珠阵列检测蛋白质（P53，c-Myc和-Actin）表达变化。此外，SHI等人将微电极IDAs用于电化学免疫、多通道检测血清标本[104]。这技术通过电化学操作、共同将所需的抗体和聚吡咯沉积在微通道指定位置，使多抗原同时检测。但该方法只允许微型化的工作电极，其中参考电极和反电极没有设置。因此，这导致了再现性差的问题。因此，将3个电极集成在一个微流控芯片是不可避免的。他们通过集成3个电极改进了微设备：金电极，Au对比电极和Ag/AgCl参比电极（在硅片上），使用绝缘材料的电聚合邻苯二胺（PoPD）容易使抗体固定在金电极上，该设备能够同时检测ngmL-1水平的3个肝纤维化标志物[55]。
七、临床应用
应用于微流控免疫分析检测主要分为均相和异相免疫分析、磁性和非磁性微粒子免疫分析和基于分离的免疫分析，目前应用的主要目的是需要分析不同的临床重要抗原。均相免疫分析法是一种直接将未固相化抗原与抗体结合形成的免疫复合物，单一步骤的免疫分析，优点是应用到微流体设备其分析时间很短，缺点其一对一的抗原-抗体相互作用，敏感性和选择性较差，在免疫反应过程中部分抗体和抗原未反应需要分离去除。微芯片毛细管电泳免疫分析法是应用该技术的最佳案列之一。例如，Herr等人使用集成了预处理（过滤、富集、混合）的芯片上电泳免疫分析技术，展示了唾液中胶原裂解酶基质金属蛋白酶-8的快速分析（＜10min）[109]。
近年来研究较多的异相免疫分析（竞争性免疫分析或夹心免疫分析）将抗原或抗体固定在一定载体上。三明治免疫分析的高特异性是通过单一抗原特异地与两种抗体形成复合物来实现，这使分析结果更准确和更具选择性，目前这种方法可以分析临床重要疾病生物标志物，如C反应蛋白（CRP）、前列腺特异性抗原（PSA）、降钙素原（PCT）、细胞因子白介素-6、白介素-5等。病毒、细菌和过敏原等较大生物分子的免疫分析也适用于不同的微流控模式。另一方面，压力驱动和电动驱动免疫分析的分析时间都在数分钟左右[109, 110]，抗原最低检出限在渺摩尔范围[92]。
在微流控免疫分析中，微珠作为一抗的固相载体也受到了广泛的关注。这些微珠可以是磁性的，非磁性的或拥有相应分子功能微凝胶，如链霉亲和素包被微粒用来固定抗体。在微流控装置内应用各种分离技术仍是比较活跃的研究领域。色谱、电泳、磁泳是在单微芯片上进行多抗原分析检测的3个主要方法。例如采用磁光分离技术对两种室内尘螨的分离进行了分析，本实验测量了微球在外加磁场作用下的磁泳偏转速度，平均速度与微球中存在的螨过敏原特异性抗体IgE的数量相关[111]。这个简单、新颖的检测技术在未来具有重要意义，可以应用于临床以及医疗诊断。
多种结构和形态的的纳米材料已率先应用在生物传感器设备[112]、组织工程[113]、药物传送载体[114]、复制成型[115]、伤口敷料[116]等领域。采用纳米纤维作为检测基底构建一种超敏生物传感器，是纳米技术最新发展。由于纳米纤维的独特特性，包括高比表面积、独特和可定制的化学表面和大孔径体积，纳米纤维已成为生物传感器应用的特殊候选材料。目前微流控免疫分析芯片检测一些重要临床生物标志物，如C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、白介素6（IL-6）、白介素5（IL-5）、前列腺特异性抗原（PSA）、肌红蛋白（Myo）、心肌肌钙蛋白T和I （cTnT，cTnI）等。
八、总结和未来展望
分析装置的制造，比如微流控免疫传感器芯片，涉及到科学和工程领域多方面知识的整合，处理化学材料所采用的技术，流体动力学和光谱学等等。最近关于应用于这一领域的材料的发展并不理想。聚合物仍然是这一领域的主要材料，在PDMS作为基底材料器其各种性能得到了证实，其优点是易于制造和其优秀的光学性能。由于微流体基底材料的可改进的空间很小，这导致了表面修饰方法的巨大改进，并且决定了抗体固定化的类型。表面修饰是一个重要的步骤，不仅可以防止非特异性蛋白的吸附，而且可以通过保持抗体或抗原的固有功能状态来提高免疫传感器的敏感性。流体的输送和操纵通常是通过电动压力驱动流体来实现的，但目前的进展是朝向无动力驱动泵、阀门和混合器。由于它提供了一个易于控制的流体，去除了其他宏观运动部件，最终实现了一个性价比高的微芯片。在检测领域，荧光仍可能是最常用的信号转导模式，因为它信号灵敏度高，可用来监测免疫复合物的形成。电化学检测通过制造一组微电极阵列，显示了同时进行多分析物传感的前景。因为大部分生物样品中的分析物浓度极低，信号放大在检测实际样品中十分必要。目前的方法是在免疫传感器的局部区域增加荧光标记抗体的数量，如光嫁接抗体和树突放大。这些技术优点有利于的信号放大，而不是基于酶动力的方法，而使分析时间显著缩短。
另外，磁性微粒和纳米颗粒组合事实证明是一对强大的组合，这不仅可以增强信号，还易于在磁场中操纵液体。与均相免疫法比较，异相免疫测定是目前常用的方法，它提供了更灵敏和具有选择性的分析性能。如果可以尽量减少或消除各种繁琐步骤，如清洗，封闭和蛋白质引入，那将是一个很大的改进。文献报道，一种新型的“Lab-on-a-Disk”平台，并展示了其用于糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性患者的血管内皮生长因子（VEGF）快速敏感测量的能力，无需样品制备，只需将检测试剂混合并将其加载到磁盘上[117]。展示了纳米等离子体电场增强共振器件（NE2RD），通过纳米颗粒的波长和消光强度变化精确测量光谱颜色变化，而无需对样品进行标记、预处理、定量的、便携式的、多靶点平台，灵敏度降低到400fgml-1 [118]。微流控免疫分析芯片的发展一般是由生物学、临床或医学领域的需求驱动。生物样本存在于混沌样本基质中，比如唾液、血浆、血清、脑脊液和活检样本，它们都含有重要疾病生物标记物或蛋白质。每种抗原既要考虑其浓度低，又要考虑其动态浓度范围。当前的新兴的微流控技术可单个或同时检测多个重要抗原，检测限的接近阿托摩尔水平，很令人鼓舞！但是，由于流体处理、检测的均匀性和蛋白质的条件，集成芯片内部校准化标准物来使系统误差最小化是必不可少的。总而言之，使用高分子材料，无动力流体控制和片上检测，微流控免疫分析芯片制造正朝着简单、便携式、床旁即时诊断设备方向快速发展。
具有独特结构和功能的静电纺丝纳米纤维，将成为一种开发新兴、高效生物传感平台候选基底材料。目前生物传感技术的应用领域非常广泛，但应用于纳米纤维生物传感器领域较少，主要为电化学或荧光传感技术，而其他技术可能更灵敏、更适用。因此，未来应该进行更多的研究来填补这一空白。将静电纺丝纳米纤维集成到微流控装置中，导致了生物传感器和分析设备性能的改进，适用于床旁即测诊断系统。这些便携式床旁即测设备非常适用于发展中国家，可以更快地进行医疗诊断。随着微流控生物传感器分析系统的进一步发展，微流控体系也将引入新兴的芯片上器官平台。将组织工程和生物传感平台集成在一个装置中，可不间断地原位监测不同器官对不同环境参数（如新开发药物的效果）的反应，以估计其潜在毒性提供了全新的视野。因此，预计在未来，新一代生物传感器将从各种类型纳米纤维的独特性能中受益更多，将在更敏感、更快的床旁即测设备开发中发挥关键作用。
