血液样本中病原微生物快速富集技术研究进展与临床应用

血流感染（blood stream infection，BSI）是指由细菌、真菌等病原微生物入侵血流所致的感染，是医院住院患者常见的严重并发症之一。根据感染的严重程度可分为菌血症、败血症和脓毒症。无明显症状时称为菌血症；发生急性全身性感染时称为败血症；引起全身炎症反应综合征时称为脓毒症。近年来，随着创伤性诊疗技术的大量开展以及广谱抗菌药物、激素和免疫抑制剂的广泛应用，脓毒症发病率呈逐年升高趋势。从发达国家的数据推算，全球每年脓毒症患者约有3150万例，严重脓毒症患者约有1940万例[1]。该病死亡率高，普通脓毒症死亡率约30%，严重脓毒症死亡率达50%，感染性休克死亡率则高达80%，全球每年因脓毒症死亡病例达530万例[2]。脓毒症的死亡率已经超过心肌梗死，成为ICU内非心脏病人死亡的主要原因，严重威胁人类健康。

脓毒症有“黄金诊疗时间”，确诊时间每晚1小时，死亡率将上升5%～10%。2018年《脓毒症集束化治疗指南更新》提出“1小时集束化治疗”方案[3]。快速、正确、合理地应用抗菌药物是脓毒症救治成功的关键。越早诊断，越早治疗，甚至在血流感染的早期实现快速诊断，及早用药，阻断发病进程，防止发展为脓毒症，将极大改善血流感染患者的预后。

目前，血培养仍然是诊断血流感染的金标准，但诊断时间较长（约30小时），不利于临床医生及时合理应用抗菌药物；且血培养灵敏度较低，培养阳性率仅为30%～40%，对于难培养及生长缓慢的病原微生物更是束手无策[4]。新兴的Sepsityper和FilmArray BCID系统在血培养报阳之后，直接收集血培养瓶中的菌体，通过质谱和PCR方法进行鉴定，但依然需要24小时才能得到鉴定结果。这就造成抗菌药物治疗延迟，严重影响脓毒症患者的治愈率和存活率。因此，临床上迫切需要实现病原微生物的快速诊断。

直接采用血液样本进行检测的方法有望解决这个难题，但由于血液中病原微生物浓度较低，检测阳性率低，难以满足临床要求。因此，开发高性能病原微生物快速富集技术成为当务之急。目前已发展出非标记富集法和标记富集法两类富集技术，包括离心、过滤、电泳、磁珠分离等。因此，本文就血液样本中病原微生物快速富集技术的研究进展及其应用进行了综述。

一、非标记富集法

1. 离心富集法：离心富集法是基于病原微生物和周围液体密度的差异，利用离心场使不同密度的病原微生物加速沉降来实现分离。该方法操作简单快速，不需要昂贵设备，但如果病原微生物不能被有效离心下来，就会导致假阴性结果。此外，离心后的洗涤步骤增加了病原微生物丢失的风险。

FAST-ID BSI全自动病原微生物鉴定系统采用低渗溶液选择性裂解血细胞后，通过离心、洗涤、电脉冲裂解得到病原微生物DNA，再通过PCR扩增实现病原微生物鉴定，仅需1小时即可完成测试（图1）。该系统可以鉴定90%以上引起脓毒症的细菌、念珠菌等病原微生物，并可识别耐药菌株[5]。

图1. 离心法富集病原微生物示意图

2. 过滤富集法：过滤富集法是采用滤膜去除样品中的其他组分而保留病原微生物。血液样本在过滤前进行选择性裂解，以避免堵塞滤膜。在滤膜上保留的病原微生物经反向洗脱得到富集，可用于后续的鉴定和药敏试验。

Micro-Dx系统利用过滤富集法，在滤膜上富集得到病原微生物，然后经化学试剂处理释放DNA，洗脱后，通过PCR扩增或测序实现病原微生物鉴定。该系统已被验证适用于多种临床样本，包括组织样本、关节抽吸物、胸膜液、腹膜液、脑脊液、伤口拭子、骨髓和支气管肺泡灌洗液等[6]，可满足临床样本多样化的检测需求。

3. 声电泳富集法：Ohlsson等[7]利用声电泳技术直接从血液样本中分离细菌，其工作原理是：含有细菌的血液样本以层流的方式从侧边入口流入，而密度匹配的缓冲液从中心入口流入。当超声波打开时，在通道侧壁之间形成驻波，从而在血细胞上施加一个指向通道中心线压力节点的声辐射力。当血细胞流经通道时，声辐射力使血细胞向通道中心横向迁移，并从中心出口排出（图2）。由于声辐射力与粒子半径的平方成正比，而细菌直径（0.5～1μm）比血细胞（红细胞6～9μm、白细胞7～20μm、血小板2～4μm）小4～20倍，所以细菌受声辐射力的影响非常小，导致它们一直留在血浆流中，并被引导到一个单独的出口中排出，从而实现细菌分离富集。利用该系统，1mL未稀释血液可在12.5分钟内处理完毕，细菌捕获效率为90%，血细胞清除率几乎达到100%。

近年来，声电泳分离技术由于具有非接触、生物相容性、高可控性和通用性等优点而不断发展壮大。然而，声电泳分离设备的吞吐量相对较低，分离临床血液样本仍需约1小时。开发高吞吐量的声电泳分离设备是未来发展的重点。此外，由于真菌直径（主要为念珠菌，直径3～6μm）与血细胞直径差距较小，用这种方法难以实现有效分离，从而限制了该技术在真菌富集方面的应用。

图2. 声电泳从血液中分离病原微生物示意图[7]

4. 凝胶电泳富集法：Chantell[8]采用凝胶电泳技术实现临床样本中病原微生物的富集。在电泳缓冲液中，由于样本中裂解的血细胞碎片及细菌/真菌携带负电荷，当施加电压时，它们均由负极向正极移动。由于琼脂糖凝胶的空隙小于细菌/真菌直径，血细胞碎片进入凝胶，而较大的细菌/真菌会被截留在凝胶孔壁上。然后通过短暂施加反向电压，将细菌/真菌从孔壁上释放出来，从而实现病原微生物分离富集。富集后的病原微生物可用于鉴定和药敏检测。

二、标记富集法

基于标记的富集方法是将特异性或非特异性捕获单元标记在载体上，通过捕获单元结合病原微生物从而实现病原微生物的富集。以下分捕获单元和载体两部分进行综述。

（一） 捕获单元

1. 特异性捕获单元：常用的特异性捕获单元，包括抗体、适配体、噬菌体等。抗体因其对病原微生物的高亲和力和特异性，是检测中最常用的捕获单元。但抗体的稳定性较低，不利于长期保存。适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行高亲和力和高特异性结合，近年来已成为抗体的热门替代品。噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称。由于噬菌体对宿主具有特异性，因此可作为宿主的特异性识别元素。虽然特异性捕获单元对其目标具有高亲和力，可以有效地结合特定的病原微生物，但高特异性缩小了可被富集的病原微生物范围，限制了其在病原微生物快速富集中的应用。

2. 非特异性捕获单元：（1）4-巯基苯硼酸（4-MPBA）：肽聚糖是由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸与四到五个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构，存在于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁中。4-MPBA分子含有一个硼酸基团，能与细菌细胞壁上的肽聚糖可逆结合，从而可以捕获各种细菌[9]。（2）甘露糖凝集素（mannose binding lectin，MBL）：MBL是一种钙依赖性凝集素，在病原微生物感染早期，由肝细胞合成和分泌，具有2至6个糖识别结构域，能识别细菌、真菌和病毒表面的甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖。在高浓度钙离子存在时，MBL经由钙离子结合病原微生物细胞壁上的糖残基从而捕获病原微生物；当钙离子浓度降低时，MBL不再与病原微生物细胞壁结合，从而释放出病原微生物。工程化的MBL（FcMBL）是通过基因工程去除天然MBL的促凝血结构域，剩余的糖结合结构域与免疫球蛋白G的Fc片段融合获得，其蛋白结构更加稳定。因此FcMBL标记的磁性纳米材料已经成为一种广谱性的病原微生物捕获材料，可用于大部分常见病原微生物的捕获[10]。（3）硫酸乙酰肝素：人血管内皮细胞顶膜表面覆盖着一层多糖蛋白复合物，而这层复合物的成分之一就是硫酸乙酰肝素。当血液里存在病原微生物时，会被这层多糖蛋白复合物中的硫酸乙酰肝素吸附。因此，可以利用硫酸乙酰肝素对病原微生物的吸附实现病原微生物的富集[11]。（4）抗菌药物：与病原微生物细胞壁特异性作用的抗菌药物也可用作病原微生物捕获探针。万古霉素是一种广谱糖肽类抗菌药物，可结合大多数革兰氏阳性菌细胞壁中的D-丙氨酰-D-丙氨酸基团，因而成为一种针对革兰氏阳性菌的广谱性富集材料。

（二）载体

1. 磁珠与磁性纳米颗粒：在磁珠与磁性纳米颗粒表面覆盖稳定性好、能进行后期标记的功能基团作为载体，然后标记上捕获单元（如抗体）。当吸附在磁珠或磁性纳米颗粒上的捕获单元与相应的病原微生物或特异性抗原结合后，形成免疫磁珠复合物。这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使该复合物与其他物质分离，从而达到分离富集病原微生物或特异性抗原的目的。其优点在于高灵敏度度和特异度，病原微生物活性不受影响，操作简便，适合大规模生产。当使用永磁体作为磁源时，该技术还具有高通量、低成本的特点。目前，该技术被广泛应用于细胞、蛋白质、DNA、病毒、细菌、真菌等富集。

Denyes等[12]将特异性结合沙门氏菌的噬菌体S16的长尾纤维固定在磁珠上，利用磁珠捕获不同样本中的沙门氏菌。捕获时间45分钟，捕获范围10～105 CFU/mL，捕获效率达95%。Feng等[13]建立了一种基于万古霉素和树状高分子纳米颗粒的方法，使用多价结合策略分离人血液中的细菌，后续以PCR法进行病原微生物鉴定。病原微生物分离时间为62分钟，检出限为32CFU/mL。Lim等[14]利用肽聚糖结合蛋白与金黄色葡萄球菌上的肽聚糖层的亲和力，制备了肽聚糖结合蛋白修饰的磁性纳米珠，可在1小时甚至15分钟内捕获血液中的金黄色葡萄球菌，对革兰氏阳性菌的捕获限度约为102.8～104 CFU/mL，捕获效率约为81.67%。Wang等[15]开发了一种利用适配体标记的氧化铁磁性纳米颗粒特异性结合血液中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的方法，能在1.5小时内从小鼠血液中捕获和检测微量细菌。Che等[16]制备了氨基化磁性纳米颗粒，通过与病原微生物的静电吸附及聚乙二醇层析柱层析实现高效富集分离，对血液中大肠杆菌的捕获效率可达95.4%，检出限为100CFU/mL。

2. 三维纳米界面：相对于二维平面载体，三维纳米界面具有更高的结合能力，可以提供更多的活性位点与靶标结合，从而显著提高检测灵敏度。Zheng等[17]采用电化学方法制备了氧化锌纳米棒阵列，并用刀豆球蛋白A（ConA）对其进行功能化修饰，形成三维纳米界面。通过刀豆蛋白A与大肠杆菌细胞表面多糖的多价结合实现对大肠杆菌的捕获和检测，捕获范围为1.0×103～1.0×107CFU/mL。Liu等[18]开发了一种由预接纳米线的三维碳泡沫制成的透析器，用于从血液样本中捕获细菌。在配体-受体分子力的作用下，多晶纳米线尖端区域的杨氏模量从底部到尖端逐渐减小，容易弯曲形成三维的纳米钳以捕获细菌。当置于流速为10cm/s的血流中时，细菌捕获效率从普通碳泡沫上的10%和碳泡沫上的不可弯曲纳米线上的40%提高到碳泡沫上的可弯曲多晶纳米线上的97%，细菌捕获效率提高了近十倍之多。Wu等[19]通过在镍多孔电极上原位沉积抗菌刺状Zn-CuO纳米颗粒和氧化石墨烯纳米片制备了多功能传感器。由于表面毛刺状纳米结构，该传感器即使在50CFU/mL的低浓度下也表现出非常好的细菌捕获效率（20分钟内达70%～80%）和高灵敏度（低至10CFU/mL）。Wang等[20]开发了一种多功能芯片，该芯片由4-MPBA功能化的硅片组成，捕获限度为1×102 CFU/mL。以上实验结果表明三维纳米界面在富集病原微生物方面优势显著。

3. 其他：Xu等[21]采用适配体标记PEG水凝胶载体，特异性结合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。PEG水凝胶载体通过其抗粘附作用降低了非特异性吸附，而载体中修饰的适配体探针可以提高细菌捕获和检测的灵敏度和特异度。同时，PEG水凝胶载体被纳米图形化以增大表面积，显著提高目标细菌的结合效率。利用该载体，可在2.5小时内从掺有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌（浓度低至100CFU/mL）的人血液中捕获多种细菌。Spina等[22]采用微孔冷冻凝胶实现液体样本中的细菌捕获。微孔冷冻凝胶具有大的比表面积，在其上标记捕获单元，从而实现复杂样本中病原微生物的捕获。Olanrewaju等[23]设计了一种由带有抗体标记微珠组成的新型微流控免疫亲和层析柱，测定时间短（7分钟），人工合成尿液中大肠杆菌的检出限为1.2×102 CFU/mL。Qu等[24]开发了一种可重复使用的、用于细菌特异性捕获和释放的平台。该平台采用多层聚电解质膜作为载体，标记经甘露糖修饰的β-环糊精衍生物作为捕获单元。捕获的细菌通过十二烷基硫酸钠作用而从表面释放出来，从而实现该平台的重复使用。这为开发新的、廉价的、可重复使用的诊断设备奠定了基础。

三、病原微生物快速富集技术的应用

1. 病原微生物鉴定：病原微生物快速富集技术可与荧光原位杂交、PCR、基因测序和质谱等检测技术结合，开发基于病原微生物快速富集技术的鉴定系统，将显著缩短鉴定时间，为患者赢得宝贵的治疗时间。

目前，开发出多款基于离心富集法和PCR扩增的病原微生物鉴定系统，包括FAST-ID BSI（QVella，加拿大）、T2 Bacteria（T2 Biosystems，美国）、Hybcell Pathogen Array（CubeDX，奥地利）、SepsiTest（Molzym，德国）以及Magicplex Sepsis Test（Seegene，韩国）等。Micro-Dx是通过过滤富集病原微生物来分析血液样本的商业系统。这些病原微生物鉴定系统由于不需要经过血培养即可直接实现鉴定，将目前临床常用病原微生物鉴定系统BD Phoenix、VITEK、FilmArrayBCID以及Sepsityper鉴定时间由1天缩短至1～4小时，具有显著的时间优势。

2. 病原微生物药敏检测：除用于病原微生物鉴定外，快速富集得到的病原微生物还可用于药敏试验。 随着抗菌药物的广泛应用，临床上出现越来越严重的耐药现象。选择有效的抗菌药物用于临床治疗, 是医学界迫切需要解决的问题。药敏试验结果是临床医师合理选用药物、提高疗效和避免滥用抗菌药物的重要依据。目前，国内外广泛认可的真菌药物敏感试验标准化方法主要是美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的扩散法和稀释法。这两种方法的共同缺陷是临床感染样本需人工培养，耗时长达3～7天。将病原微生物快速富集技术与快速药敏检测技术（如拉曼光谱技术[25]、异步磁珠旋转技术[26]、纳米机械传感技术[27]等）进行结合，有望在获得临床样本后2小时内完成病原微生物药敏。这对于快速指导临床医生合理用药、降低感染患者死亡率、挽救患者生命具有极其重要意义。

Accelerate Diagnostics公司基于凝胶电泳技术开发成Accelerate Pheno®微生物快速鉴定药敏检测系统，并已取得FDA和CE注册认证。利用该系统，可在2小时内得到鉴定结果，7小时得到药敏结果。

3. 血液感染治疗：病原微生物的快速富集技术不但可以用于血流感染的诊断，还可以用于血流感染的治疗。目前已开发出两种血液吸附系统，即基于甘露糖凝集素的Opsonix血液吸附系统和基于硫酸乙酰肝素的Seraph 100血液吸附系统，用于从血液循环中广泛清除病原微生物。

Opsonix公司开发的血液吸附系统采用聚砜或聚醚砜中空纤维过滤器，标记FcMBL配体，目前可以结合90多种病原微生物及毒素。在体外测试时，这种过滤器可有效清除血液中的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及真菌，2014年被评为“转化医学领域十大科技突破”。

ExThera Medical公司开发的Seraph100血液吸附系统采用标记硫酸乙酰肝素的磁珠来清除血液中的病原微生物。研究结果表明，它能从血液中去除巨细胞病毒、肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及单纯疱疹病毒，清除效率超过90%。该系统获得欧盟CE认证和美国FDA授权紧急使用[28]。该系统有望实现血流感染的快速有效治疗，显著提高患者治愈率，降低死亡率。

四、总结与讨论

为实现血液样本中病原微生物的快速富集，目前开发了多种富集方法，包括离心、过滤、电泳、磁珠分离等（表1）。过滤法和离心法虽然简单快速，但灵敏度低。声电泳富集法吞吐量低、耗时长，且不适用于真菌的快速富集。磁珠分离法中，特异性吸附仅适合单一类群的分离，难以满足病原微生物多样性的需求；非特异性吸附可实现多种病原微生物的捕获，更适合临床样本中病原微生物的富集。基于静态吸附的富集方法通常需要1～3小时的吸附时间，耗时太长；动态吸附则可以在数分钟内完成吸附。从捕获时间、捕获效率和捕获限度三个参数来衡量，FcMBL、预接可弯曲纳米线的3D碳泡沫和微流控免疫亲和层析柱具有较好的发展前景，而微流控免疫亲和层析柱更具有成本优势。总之，发展基于非特异性捕获单元的动态吸附系统是快速富集技术的未来发展方向。

目前病原微生物快速富集技术的研究聚焦在细菌感染方面，对于真菌的研究较少。随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的广泛应用以及器官插管、透析疗法的大量实施，临床真菌血症发病率明显增高。因此，十分有必要对真菌的富集技术进行系统研究。

病原微生物快速富集技术与下游荧光原位杂交、PCR、基因测序、质谱和拉曼光谱检测等检测技术结合，开发全自动病原微生物快速鉴定药敏系统，在短时间内实现病原微生物的鉴定和药敏检测，有望在发病早期指导临床医师合理使用抗菌药物，从而显著提高血流感染患者的治愈率。该技术还可开发为血液吸附系统，用于吸附血液中的病原微生物及毒素，从而实现血流感染的治疗。该技术可作为抗菌药物的替代疗法，在耐药菌感染的治疗方面具有显著优势。