多重自动化技术在自身抗体检测中的临床应用价值

曲昌华，主任技师，现任山东省烟台市烟台山医院检验科副主任。从事医学检验工作三十余年，主要研究方向自身免疫，曾先后两次到北京协和医院风湿免疫实验室进修学习。共发表SCI文章2篇，参与课题多项。

主要社会兼职： 山东省急诊检验协会常务委员；烟台市中西医检验学会副主任委员。

自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID），是一类由于免疫功能紊乱，机体产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应而引起组织、器官或系统损伤的疾病，临床表现复杂多变、病变累及广泛。自身抗体是机体B淋巴细胞成熟分化为浆细胞后产生的针对自身成分的抗体总称，高效价自身抗体的产生是绝大多数自身免疫性疾病的特征之一。自身抗体对于AID的诊断、病情判断、疗效观察具有重要作用。自身抗体检测方法很多，包括间接免疫荧光法、速率散射比浊法、放射免疫法、免疫印迹法、酶联免疫试验、化学发光法、多重免疫测定等。

由于自身免疫性疾病以及自身抗体的复杂性，一种自身抗体对应多种自身免疫性疾病，一种自身免疫性疾病会有多种自身抗体，因此自身抗体的组合检测大大减少了疾病的漏诊和误诊[1]。并且与自身抗体定性检测相比，定量检测自身抗体更准确，更易自动化，而且更加反映与疾病的相关性，更有效地监测病情和疗效，预测疾病的发生和预后[2]。随着检验技术的发展以及临床对自身抗体的要求和依赖性越来越高，自身抗体高通量、自动化、定量检测的技术必将成为未来的发展趋势。自动化技术的引入，为精确、微量和高效的检测提供了保障[3]。本文重点介绍的两种自身抗体检测方法，是最近国内新兴的多重自动化技术，更能满足国内临床对于自身抗体的检测需求。

一、流式荧光技术

1. 流式荧光技术原理：流式荧光技术[4]又称液相悬浮芯片技术、多功能流式点阵技术、液相芯片分析技术、xMAP技术等。该技术原理包括以下4点。编码磁球 用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径6.5μm的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，从而获得多达100种荧光编码的微球。共价交联将针对不同待测物的抗体/抗原分子或基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。结合反应将针对不同待测物的荧光编码微球混合，加入待测物质或待测的基因扩增片段，形成复合物再与标记荧光素发生结合反应。激光分析微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿两束激光，红激光用以判定微球的荧光编码，绿激光用以测定微球上报告分子的荧光强度。

如图所示[5]，某种颜色的微球与不同的纯化抗原偶联，因此不同颜色球代表不同的抗原，组合在一起，通过红绿两束激光识别抗原种类以及荧光强度，在一次检测中可以完成不同自身抗体的检测，可以实现自身抗体谱的联检及定量。

图1. 流式荧光技术（flexible multi-analyte profiling）

2. 流式荧光技术发展：1997年，《Clinical Chemistry》杂志刊登专文介绍流式荧光技术，并将其誉为“真正的临床应用型生物芯片”。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列产品率先通过美国FDA认证标志着流式荧光技术成为首个美国政府许可用于临床诊断的多指标并行检测技术。2005年6月9日，基于流式荧光技术的学术论文刊登在《Nature》杂志上。2005年11月，为表彰其对临床诊断技术进步作出的贡献，全球科技产业、行业研究的权威机构Frost&Sullivan授予流式荧光技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”，标志着该技术在国际临床诊断技术领域的地位得到了权威的认可。

3. 流式荧光技术应用现状：国外研究显示，流式荧光技术与传统ELISA方法检测自身抗体谱结果相当，总体符合率88.1%到95.2%，可以同时检测多种抗体，有效的应用于临床实验室[6]。根据2019年美国CAP自身抗体室间质评统计，约有56%的用户用流式荧光的方法检测ENA抗体谱。

国内研究显示，流式荧光技术检测干燥综合征自身抗体的评价，8种抗体的批内差异及批间差异均较小，诊断pSS的总敏感度可达97.2%，总特异性可达96.34%[7]。流式荧光技术检测抗核抗体谱与免疫印迹技术相比，一致性尚可，特异性更高，可以替代免疫印迹技术成为新一代的抗核抗体确认试验检测方法[8]。除了抗核抗体谱之外，还有研究发现流式荧光技术检测原发性胆汁性胆管炎（PBC）自身抗体与免疫印迹法检测结果一致性较高，联合检测M2、GP210和sp100抗体诊断PBC的敏感度更高，诊断价值更大[9]。

4. 流式荧光技术检测优势：流式荧光技术有机整合了荧光编码微球技术、计算机运算法则等多项科技成果，具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广等优点。

5. 流式荧光技术检测项目：国家收费目录中自身抗体有154种[10]，绝大多数医院检验科开展50种左右。通过国家药品监督管理局医疗器械查询，目前已取得注册证的应用流式荧光技术的自身抗体检测项目包括抗核抗体谱、自身免疫性肝病谱、血管炎谱、磷脂谱、类风湿关节炎谱等，可满足大部分项目的检测需求。

二、数码液相芯片技术

1. 数码液相芯片技术原理：数码液相芯片技术[11]（digital liquid chip method，DLCM）是采用具有不同编码的磁条码表面分别包被不同的抗原。与流式荧光技术比较，其编码方式及判读方式不同。

编码方式：芯片的中间支撑层为硅片，首先硅片上附上镍层（磁性来源），然后覆上树脂，树脂是半透明材料，对树脂可进行激光光刻，形成4096种图案，可以转换为12位的二进制，最终可编码4096种芯片。

判读原理：根据样本中不同抗体的含量不同，不同编码的磁条码芯片（对应不同的抗原）通过电荷耦合器件（charge-coupled device）显微成像技术进行两次明场、暗场成像，可获得对应芯片不同的荧光强度。通过软件计算分析各编码芯片的荧光强度，换算成对应抗体的浓度或抗体系数（图2）。

2. 数码液相芯片技术应用现状：通过PubMed和中国知网，未检索到应用数码液相芯片技术进行自身抗体检测公开发表的国内外文献，而较多集中在应用该技术进行肠炎病原体、呼吸道病毒等联合检测，是国内新兴的用于自身抗体谱检测的多重自动化技术。

3. 数码液相芯片技术检测项目：通过国家药品监督管理局医疗器械查询，目前已取得注册证的应用数码液相芯片技术的自身抗体检测项目包括抗核抗体谱、自身免疫性肝病谱、肌炎谱、血管炎谱。

三、多重自动化技术在自身抗体检测中的临床应用与展望

流式荧光技术和数码液相芯片技术均可实现自身抗体的联检定量及自动化检测。国家卫健委临床检验中心抗核抗体室间质评报告显示，虽然目前应用流式荧光技术和数码液相芯片技术的单位数量较传统方法学少，但是呈现逐年增加的趋势且都是满分通过室间质评。

国内流式荧光技术的应用较国外起步晚，如上海透景生命科技股份有限公司的全自动流式荧光发光免疫分析仪TESMI F4000（2019年上市），配套十六项自身抗体谱检测试剂盒（流式荧光发光法）、自身免疫肝病抗体谱检测试剂盒（流式荧光发光法）、抗髓过氧化物酶抗体、抗蛋白酶3抗体、抗肾小球基底膜抗体测定试剂盒（流式荧光发光法）等，可实现自身抗体谱的联合检测、全自动、可定量及随到随检，满足自身抗体谱检测的标准化、自动化、定量化发展趋势，能够更好的服务于临床。相信随着国内用户越来越多，该技术及平台也会越来越成熟以及受到更多客户的认可，使得国内自身抗体检测进入新的时代！

图3. 全自动流式荧光发光免疫分析仪TESMI F4000