干血滴标本采集与临床应用
吴万通，医学硕士，副主任技师，天津市东丽医院设备科科长、检验科副主任。天津市临床检验质控委员会委员，天津医学会检验分会委员，天津市防痨协会委员，发表SCI和核心期刊文章10余篇，获天津市东丽区科学技术进步奖一项，主持或参与国家自然科学基金等课题四项。参编著作1部。
一、干血滴标本采集
使用干血滴方法的典型分析过程包括如下步骤：将血滴到特种纸上（典型的是15~20μL，但一些研究者使用100μL），然后将点样卡放到一个垂直的干燥架上，放置2h或过夜，干燥后，将点样卡封入放有干燥剂的塑料拉链袋中，室温条件下运输到分析实验室中，再将卡片钻孔（典型的为3~4mm）并排列成96孔板的形式，最后加入萃取剂并混合振荡30~60min，除去上清液并注入液相色谱-质谱仪中进行分析。
1. 在临床研究中，成年人静脉采血、手指刺伤是首选的采样模式。同临床前的干血滴收集一样，血被收集到一个微管中或直接用毛细管点样。在生物分析实验室中，鉴于处理的血样体积较大及需点样的点样卡数量较多，连发移液管是在干血滴卡片上点样的首选工具。
2. 新生儿筛查，从足跟采集的血液是NBS的首选血液，应在足跟最内侧或外侧靠近足底面的部位采集。（“内侧”定义为最靠近身体中线；“外侧”指远离身体中线。）如下图所示：
图1. 适宜的采血部位
足弓，手指，耳垂皆尽量避免采样，因为新生儿足部（足弓）的中心区域可能会导致神经、肌腱和/或软骨损伤；新生儿每个手指最后一段最厚部分的皮肤表面到骨骼的距离在1.2到2.2毫米之间，可用的刺血针很容易损坏骨骼。
3. 采血装备：滤纸采血的滤纸规格。滤纸应由100%纯棉短棉绒制成，不含湿强度添加剂；基重应为179克/平方米，24英寸×36英寸；pH值应为5.7至7.5（检测方法为国际标准化组织ISO-6588-11）；灰分：最大1%。滤纸采集卡上应注明的中文信息：新生儿的姓名，性别，出生日期，初生重，胎龄，母亲的姓名，病历号，标本采集日期。
图2. 滤纸采血的滤纸规格
4. 血斑干燥：避免触摸或涂抹血斑。让血液样本在水平、非吸收性、开放表面上，在18至25℃的环境温度下风干至少3小时。如下图所示：
图3. 血斑干燥装置
自然干燥，避免高湿度，避免阳光直射，不应加热、堆叠或让样本采集卡滤纸片上的血斑接触其他表面。不要将卡放在通风口或其他移动空气源的前面。在充分干燥之前，不应将样本放在（气密）密封的容器中并通过气动导管运输。
因为样本之间可能会发生交叉污染，所以样本之间的接触是不合适的。在将样本放入容器进行运输之前，样本采集卡应旋转180°，与堆叠中卡上方和下方的血斑成180°。如果收集卡被物理屏障（折叠盖或单个信封）隔开，则无需旋转样本。
除非筛选实验室另有指示，否则干燥血液样本应在干燥后尽快（至少三小时）且不迟于采集后24小时内运输或邮寄至实验室。应保存从采集到实验室交付的标本运输所有阶段的适当跟踪文件。跟踪过程应进行定期审查，以便在每个阶段及时处理，同时进行QA审核。建议尽可能使用每日快递运输，以控制环境条件，持续跟踪，并最大限度地减少装运延迟。及时装运的标本缩短了诊断时间，并保持了血斑和待测生化分析物的完整性。
不建议将DBS样本包装在气密、防漏的密封容器（如塑料袋或箔袋）中，因为密封容器内部环境缺乏空气交换会导致热量积聚和水分积聚。同时放置干燥剂，热、阳光直射、湿度和湿气对DBS样本的稳定性和分析物回收有影响。
5. 采集中质量保证：处理样本采集设备（卡）时应使用无粉末手套。确保样本采集设备（卡）的有效期未过。手动或通过电子方式填写标本采集设备（卡）人口统计学数据部分要求的患者信息。在手动应用中，应该使用圆珠笔，因为软笔不会复制到其他纸张上。除非处理过程确保患者信息不被遮挡且采血区域不受影响，否则不得使用地址印记设备（或胶粘标签）。请勿使用可能会压缩滤纸或样本采集设备（卡）滤纸段的打字机或打印机。在采集样本（血斑）之前、期间和之后，避免触摸滤纸（样本采集设备[卡]）部分圆圈内的区域，因为手接触到的油和其他物质可能会影响或污染样本、样本采集设备（卡）或滤纸。在使用之前或之后，不要让水、喂食配方、防腐溶液、手套粉末、洗手液或其他材料接触滤纸片或样本采集设备（卡）。
6. 血斑质量的判定：
二、干血滴标本应用
1. 血液药物分析：2014年Regina V Oliveira 氏等[3]应用液相色谱/高分辨率准确性质谱仪（LC/HRAMS）共轭自动化系统直接提取DBS用于定量人血液咪达唑仓（MDZ）和α-羟基咪达唑仓（α-OHMDZ）。DBS卡进入色谱柱被直接提取随后由HRAMS检测，不需额外处理样本，自动测量出靶分析的质/荷比，保证试验的特异性。2分钟内分析一个DBS样本，显示灵敏和高选择性范围5-2000ng/mL，天内和天间精密度和准确性均低于15%（20%/L LOQ法）。成功地用于单次7.5mg剂量MDZ后的MDZ与α-OHMDZ的测定。
2021年意大利学者Lucia Mainero Rocca氏等[7]报道了“一种稀释和快速液相色谱质谱方法分析预切干血滴中多种药物”，药物可影响听觉和神经系统，由于病理学观点不同而被内耗，在工作环境中风险的源头又被提出。在呈现的课题中所涉及到的所有靶成分显示毒性或发作性睡眠病副作用，基于这些理由，职业安全组织已经认可它们作为工伤潜在原因。开发并确认多种方法用于最普遍广泛的15种药物的分析（属于9种不同类别包括抗组胺剂类、贝塔洛克类、抗抑郁药、Z-药和类罂粟碱）。该研究描述了利用专门的预切干血滴快速、灵敏和有效的方法分析全血中这些底物。在一种简单容易的“稀释与快速”溶解作用后随之被UPLC分离用三个四极质谱仪实现了检测。干血滴全部结果与全血类似，诸如细胞压积变异、容积评价和样本携带抉择于方法开发期间进行了认真研究和管理。可靠性研究成功显现pgμL-1LOQs，好的线性间隔，绝对回收率不低于75%，几乎忽略不计的基质效应，用欧洲和美国导则验证了准确性与精密度。为了鼓励方法传播作为原始预防介入所特别追求的目标全部获得，甚至在小的私人工作平台。2021年沙特阿拉伯学者Bushra等[8]报道“一个简单灵敏的干血滴定量甲福明二甲双胍的LC-MS/MS方法”甲福明二甲双胍具有改善胰岛素抵抗减少肝脏葡萄糖产生从而降低血糖作用，报道采用两个溶剂流动相于Waters HSS-T3层析柱色层分离：A溶剂由含2%蚁酸0.1%10mM蚁酸氨组成，B溶剂为含0.2%蚁酸的乙腈，流速为0.2mL/min，运转3分钟。Afatinib作内标。线性范围8-48ng/mL，相关系数ŗ＞0.9907，天内和天间精密度为每个管理导则所接受，满足EMA和FDA文件。
2. 兴奋剂检测：反胺苯环醇是一种用于治疗慢性或急性疼痛的合成的类鸦片药，体检机构发现在运动员中滥用流行，反胺苯环醇的消费与诸如麻木、惶恐及警戒的副作用相关，这个事实提示国际自行车联合会在自行车竞赛中禁止使用反胺苯环醇。2020年瑞士学者Olivier Salamin氏等[4]开发了一种干血滴样本采集及随后用LC-MS分析的制备方法用于快速检测血液样本中反胺苯环醇及其它的两个主要代谢物，同年来自瑞士伯尔尼大学伯尔尼法医研究所的Marc Luginbühl氏等[5]报道世界反服用禁药政府组织（WADA）和国际检测机构（ITA）最近宣布开发并落实了干血滴试验在北京2022年冬季奥林匹克运动会和残奥会比赛中用于常规分析。随着2019年3月在比赛中禁止使用反胺苯环醇禁令的发布，国际运动员联合会（UCI）开始一个试点研究——在DBS中以反对使用兴奋剂为目的手工反胺苯环醇分析。在这种背景下，他们提出用一个CAMAG DBS-MS500自动化样本制备装置用于基于全自动LC-MS/MS方法来分析在DBS中曾经的反胺苯环醇和其代谢产物邻-去甲基胺苯环醇。减轻了手工，仅仅需要制备标准品和质量控制DBS卡。利用来自法庭病例真实样本基于液体血液的分析方法交叉验证开发方法为最适和可靠的。显示提取效率为52%，线性ŗ2＞0.99，在LLOQ处精密度为±15%准确度为±20%。26份液体血液样本方法学比较显示好的一致性（反胺苯环醇为90±19%和邻-去甲基胺苯环醇为94±14%）。结论，对反服用禁药提供了快速、准确筛查方法，适于具有每样本4分钟的高效分析。手工提取已经过时了。该系统还应用于新生儿筛查、工作场所药物试验、法医筛查、直接酒精标志物分析、抗逆转病毒药物、抗癫痫药物和剂量药物管理等[6]。
3. 新生儿筛查：孙云等[9]采用非衍生化串联质谱技术检测干血滤纸片氨基酸、酰基肉碱和琥珀酰丙酮，报告南京地区新生儿氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢病总发病率分别为0.0199%、0.0068%和0.0085%，其中最高分别为苯丙氨酸羟化酶缺乏症0.0159%、甲基丙二酸血症0.0051%和原发性肉碱缺乏症0.0051%。鲍幼维等[10]对10252名男性新生儿干血斑进行CK-MM含量进行分析用于筛查杜氏肌营养不良症（DMD），对超过700ng/mL截定值的4例通过基因诊断确诊2例，其均携带外显子缺失，CK-MM均大于2000ng/mL，干血斑在2~8℃干燥环境中可稳定14天。结论是干血斑CK-MM测定为筛查新生儿DMD有效手段，其操作简单、成本低廉，可用于大规模筛查，对于DMD早期干预与治疗具重要意义。唐玥氏等[11]报道遗传性酪氨酸血症Ⅰ型（HT-1）通过新生儿筛查干血斑中的酪氨酸和琥珀酰丙酮（SA）水平，结合典型生化指标改变及分子遗传学检测结果可早期诊断患者，通过尼替西农联合饮食治疗可促进患者长期生存。
三、未来的发展方向
近几年来干血滴技术因其具有较大的优势得到了迅速发展。5年前，干血滴用于小分子分析的科学文献很少。现在，可以获得的科学文献很多，一些杂志甚至专门刊登干血滴技术的文章。自动化和技术的进步将进一步促进实验室干血滴方法的广泛应用。尽管采用这种技术在改善、减少和替代药物开发中动物的使用三个方面具有明显优势，然而，干血滴方法的开发和分析仍然漫长而耗时。未来，干血滴的自动化和直接分析将加快这一进程。
