直接口服抗凝药物的实验室监测技术方法与临床应用价值

屈晨雪，博士，主任医师，硕士生导师。现任北京大学第一医院检验科副主任、北京大学医学部检验学系副主任、北京大学医学部检验专业专科医师规范化培训项目组组长。学术兼职：北京医学会检验学会常务委员、北京市中西医学会检验分会常务委员，中华医学会检验分会血液体液组成员，中国医师协会检验医师分会造血与淋巴组织肿瘤检验医学专家委员会委员、全国中西医学会检验分会青年委员、卫生部全国卫生人才评价领域专家等。专业特长：主要从事临床血液体液检验，研究方向为血栓与止血的基础与临床，血小板检验及临床应用，血液系统肿瘤的实验诊断，细胞免疫表型分析研究。发表论文多篇。国际多中心合作项目1项，参与国家级、省部级科研课题多项。参与部教材及专著编写。2018年获得北京市教育教学成果二等奖，2005年获国家教育部科技进步二等奖。

口服抗凝药物（direct oral anticoagulants，DOACs），主要包括直接凝血酶抑制剂（达比加群酯）及直接Xa因子抑制剂（利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班），它们阻断凝血途径的最后通路，通过直接抑制凝血酶（Ⅱa因子）或Ⅹa因子发挥其抗凝作用。临床试验证实，DOACs较传统口服抗凝药物相比，具有诸多优点[1]：起效快、半衰期短（t1/2是5~18h）；与药物、食物相互作用少；固定剂量给药，不需调整剂量，不需常规监测凝血功能；较低颅内出血率。本文主要总结了DOACs实验室监测适应证及实验室监测方法等进展，以期对DOACs的安全应用提供依据。

一、DOACs实验室监测的适应证

DOACs从肠道吸收，经肝脏、肾脏清除，故当患者肝/肾功能受损时，或联合使用影响渗透性糖蛋白（permeability glycoprotein，p-gp）的药物时，体内血药浓度差异很大，患者有可能处于抗凝过度或抗凝不足的状态中，进而导致出血或血栓形成。中国专家建议在急诊手术、严重出血或血栓事件、合并用药、可疑过量、肾功能减退时可能需要监测抗凝效果[2]。ICSH发表的最新文献建议在一些紧急情况（如急性出血，或决定使用逆转剂时），以及在一些非紧急情况，如老年、严重肾衰需透析维持、高出血风险的提前干预、体重指数＞40kg/m2、药物相互作用等，建议监测DOACs的抗凝效果[3]。这除了能指导临床医师对患者进一步临床处理外，也有可能推动对不同患者进行个体化治疗。

监测DOACs抗凝效果最直接的方法是检测DOACs血药浓度，其“金标准”是采用液相色谱串联质谱分析（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）直接检测DOACs药物浓度[4]。然而这种方法操作复杂、仪器昂贵，很多实验室无法开展，常规凝血功能指标在筛查DOACs抗凝效果方面的优势凸显出来。同时，简便、快速定量监测DOACs血浆浓度方法成为研究热点。

二、直接凝血酶抑制剂达比加群酯实验室监测

目前，口服直接凝血酶抑制剂仅有达比加群酯（dabigatran etexilate）一种药物。它是一种可逆、直接凝血酶抑制剂，最初用于预防髋关节置换术后患者深静脉血栓形成[5]，其后RE-LY试验[6]证实达比加群与华法林相比明显降低房颤患者脑卒中风险、大出血风险。该药于2013年在中国上市，主要用于成人非瓣膜性房颤患者卒中和全身性栓塞的预防。

（一）筛查试验

1. 活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）：有多个研究[7-8]表明APTT随达比加群浓度升高而延长。服用达比加群150mg bid剂量的患者，峰值（服药后2~4h）APTT大致为基线APTT的2倍，谷值（服药后12h）APTT大致为基线APTT的1.5倍[5]。不过，该研究[5]发现APTT在达比加群浓度＜200ng/ml时与达比加群血药浓度呈现良好线性关系，但在达比加群浓度≥200ng/ml时，没有明确线性关系。不同厂家APTT试剂敏感性不一[7]，运用不同厂家APTT试剂检测同一标本，结果有差异。另外，APTT本身会受其他因素干扰，如狼疮抗凝物、内源性凝血因子缺乏等均可导致APTT延长。因此，APTT可作为达比加群抗凝效果的筛查指标，如APTT正常时可基本除外高浓度达比加群。当达比加群过量时，APTT数值与达比加群浓度无线性关系。此外，还需排除达比加群药物以外其他干扰因素。

2. 凝血酶时间（thrombin time，TT）：当血浆中存在凝血酶抑制物时，TT显著延长，故理论上TT可直接反映达比加群抗凝效果。在健康成人药物试验中，TT表现出与达比加群浓度良好相关（r=0.926），当志愿者口服大剂量达比加群400mg tid时，TT最长为基线值29倍（此时APTT为基线值3.1倍），这说明TT试验过于敏感，在达比加群浓度过高时，TT可能超过测试范围高限而不能给出结果[9]。因此，在临床实际应用时受到一定限制。

3. 凝血酶原时间（prothrombin time，PT）：有研究发现[9]，PT不能反映达比加群浓度变化，健康志愿者口服大剂量达比加群400mg tid时，PT（INR）随达比加群浓度升高而延长，但在达比加群治疗范围内，PT（INR）数值变化很小。Douxfils等[7]的研究显示，当达比加群浓度由67ng/ml升至200ng/ml时，PT仅延长几秒，故不建议采用PT来监测达比加群抗凝效果。

（二）定量监测

直接检测达比加群血药浓度的参考方法LC-MS/MS操作复杂，不适用于临床快速监测。目前，常见的快速定量监测指标包括以下这些。

1. 稀释凝血酶时间（diluted TT，dTT）：为了克服TT试验太敏感，Avecilla等[10]采用了一种新方法检测血浆中达比加群水平。他们将1份患者血浆用3份正常人混合血浆稀释，加入固定量的凝血酶启动凝血反应，检测dTT，同时测定含有已知浓度达比加群血浆样本的dTT进行定标，这样，将患者血浆检测出的dTT与该标准曲线比对，即可得到达比加群浓度，检测范围为0~500ng/ml。Avecilla的研究显示dTT试验变异系数（coefficient of variation，CV）为1.6%~2.1%，与参考定值的偏差为2.4%，其准确度及精密度均较好。进一步的研究也显示[11]，dTT与参考方法LC-MS/MS呈良好线性相关（r=0.9799），在达比加群低至中等浓度（≤100ng/ml）时，dTT与参考方法LC-MS/MS相关性甚至比ecarin蛇毒发色试验（ecarin chromogenic assay，ECA）更好，相关系数分别为0.964、0.935、0.915。提示dTT可作为达比加群抗凝水平的定量监测试验。

2. ecarin蛇毒凝固时间（ecarin clotting time，ECT）：ecarin蛇毒特异地激活凝血酶原，产生不稳定的凝血酶，该凝血酶可被直接凝血酶抑制剂达比加群抑制，因此ECT试验可直接反映达比加群抗凝活性，通过与标准曲线比较得出达比加群浓度[12]。健康成人志愿者的药物试验研究表明[9]，ECT随达比加群浓度升高而延长，两者具有紧密的线性关系（r=0.957）。临床试验证明，ECT敏感性比APTT好，在相同达比加群浓度范围内，ECT比值变化幅度比APTT比值变化幅度大[12]。ECT试验的优点是不受肝素、双香豆素类、异常抗凝物（如狼疮抗凝物）的干扰，缺点是受血浆样本中凝血酶原浓度和纤维蛋白原浓度影响。由于目前无标准化ECT试剂，因此该试验在临床中应用并不广泛。ECT试验改进后出现ecarin蛇毒发色试验（ECA），是将ecarin蛇毒加入血浆样本中，通过发色底物测量不稳定凝血酶的产生。在Douxfil[7]等人的研究中，ECA试验与定标好的达比加群浓度呈线性相关（r=0.999），该试验优点是不受纤维蛋白原浓度影响。目前已有ECA商品化试剂。

三、直接FⅩa抑制剂利伐沙班、阿哌沙班的实验室监测

利伐沙班是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的第一个FⅩa抑制剂，它竞争性、可逆结合游离和结合状态的FⅩa。关于利伐沙班的临床研究ROCKET-AF[13]结果显示：利伐沙班在预防房颤患者中风以及出血风险方面与华法林没有显著差异。它于2009年在我国上市，目前主要用于骨科大手术术后血栓预防。阿哌沙班是FDA批准的第2个FⅩa抑制剂。关于阿哌沙班的Ⅲ期临床试验ARISTOTLE[14]表明，与对照华法林组相比，阿哌沙班组更为有效预防房颤导致的卒中或体循环栓塞事件，且出血并发症发生率与全因死亡率均降低。该药于2013年在我国上市，主要用于髋关节或膝关节置换术术后预防静脉血栓栓塞症。

（一）筛查试验

1. 凝血酶原时间（PT）：有研究表明，PT随利伐沙班血浆浓度升高而延长[15]，与参考方法LC-MS/MS相关性较好（r=0.775）[16]，因此，PT可用于筛查利伐沙班抗凝效果。但是不同厂家试剂的敏感性不一。有研究[17]尝试运用INR来监测利伐沙班血浆浓度，发现INR与利伐沙班浓度并不呈线性关系。这可能与国际敏感度指数（International Sensistivity Index，ISI）是基于维生素K依赖凝血因子的敏感性而定，并非依据DOACs抑制的凝血因子敏感性计算有关。Douxfil等[18]研究表明随阿哌沙班浓度升高，PT延长，但该指标不敏感，因此不适用于筛查阿哌沙班抗凝效果。

2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）：利伐沙班对APTT试验的影响小于PT试验，不同厂家试剂也表现出不同敏感性，因此APTT不适用于筛查利伐沙班抗凝效果。Douxfil等[18]研究表明随阿哌沙班浓度升高，APTT延长，但该指标不敏感，因此不适用于筛查。

3. 稀释蝰蛇毒时间（dilute Russell viper venom time，dRVVT）：用蝰蛇毒试剂激活FⅩ，加入Ca2+和磷脂观察血浆发生凝固的时间，称为蝰蛇毒时间，该方法通常用于狼疮抗凝物检测。有研究发现用dRVVT确证试验（含过量磷脂）检测利伐沙班与LC-MS/MS检测结果呈线性相关（2个不同厂家的试剂的相关系数分别为0.87、0.80）[19]，提示其可作为监测利伐沙班抗凝效果的一个指标，但仍需后续研究。有研究发现[18]，dRVVT对于监测阿哌沙班不敏感，不适用于监测阿哌沙班抗凝效果。

（二）定量监测

抗FⅩa试验（发色底物法）：抗FⅩa试验通常用于检测体内低分子肝素或普通肝素浓度。抗FⅩa试验测定利伐沙班/阿哌沙班浓度的原理是：利伐沙班/阿哌沙班直接与FⅩa结合并灭活FⅩa，剩余的FⅩa水解发色底物S-2765，释放出黄色对硝基苯胺（pNA），其颜色深浅与血浆中利伐沙班/阿哌沙班浓度呈负相关。Douxfil等[16、18]的研究显示抗FⅩa试验（利伐沙班）及FⅩa试验（阿哌沙班）与参考方法LC-MS/MS相关性很好（r分别为0.97、0.97），提示该方法可用于利伐沙班/阿哌沙班的定量监测。目前，已有用于利伐沙班的抗FⅩa试剂盒。

四、床旁试验

为了方便患者监测药物浓度，一些床旁试验也逐渐用于DOACs的监测中。

1. 血栓弹力图（thromboelastography，TEG）：TEG全程监测凝血与纤溶过程。研究显示，R值随达比加群浓度升高而延长，与ECT相关性好（相关系数分别为0.944、0.956），可作为急诊患者监测达比加群抗凝效果的快速床旁试验[20]。正在进行临床试验的TEG 6s试验拥有4个通道，弹药筒内包含高岭土（通道1）、ecarin蛇毒（通道2）、活化X因子（通道3）、阿昔单抗（通道4），通道2和通道3用于鉴别不同种类的DOAC，敏感性大于90%[21]。

2. 干血纸片法（dried blood spot，DBS）：DBS可采集手指血检测，便于患者院外自行检测[22]。但是，该方法尚有一些局限性，如标本的红细胞压积水平差异导致的系统误差、病人采血及检测培训等。

3. 除了血标本的检测，一些尿标本检测的试纸条也在评价中。有文献报道，尿试纸条的灵敏度、特异度均较高，但是与DOACs无剂量依赖关系[23]。若尿试纸条检测出阳性，进一步明确需检测血中的DOACs。

五、DOACs的推荐监测流程

DOACs的应用日渐广泛，对DOACs的抗凝监测也逐渐由“无需监测”转变为“特殊情况下的监测”。常规凝血试验是目前大多数医院开展的项目，DOACs使用时，会对凝血试验结果有所影响。正确了解这种影响，不但对监测其抗凝效果起着重要作用，而且能帮助医生更好地解释结果，判断病情。三种DOACs对常规凝血指标的影响见表1。当临床上遇到已知患者服用DOACs类型，推荐DOACs实验室监测流程如图1。

图1. 推荐DOACs实验室监测流程[25]

六、 总结与展望

直接口服抗凝药物较传统口服抗凝药物具有诸多优势，在一些特定情况下，监测直接口服抗凝药物的抗凝效果很有必要。本文总结的实验室指标均可用于DOACs监测，实验室可根据患者服用不同种类的DOACs选择相应筛查、定量指标进行监测。但由于各厂家试剂敏感性不一、成分不同，因此运用不同厂家试剂检测时其结果也可能不一致。建议各实验室在开展这些实验时，应建立适用于自己实验室的监测范围。寻找一个标准化的、具有可比性的监测指标，将是进一步研究的方向。

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