国产凝血诊断新技术项目研发面临的机遇与研发策略
丁重辉，1996年毕业于北京理工大学自动控制专业，获学士学位，2013年毕业于澳门城市大学MBA专业，获硕士学位，教授级高级工程师职称。2015年12月至今，任北京赛科希德科技股份有限公司董事、副总经理。长期从事生物医学检测技术及仪器、试剂及耗材一体化的研究和产品转化。现为国家科技专家库及北京市科委专家库专家，SAC/TC338/SC1全国测量、控制和实验室电器设备安全标准化技术委员会医用设备分技术委员会委员。承担起草行业标准7个。获北京市科技进步二等奖1项，国家科技进步二等奖1项。
血栓与止血的诊断项目繁多，大致可以分为以下几大类，常规凝血筛查、凝血因子的检测、纤溶系统及其相关标志物检测、抗凝治疗检测、易栓症、初级止血等。传统血栓与止血诊断应用主要集中在出血疾病筛查与出血原因诊断方面，其应用范围较窄、精准性相对较差。现代血栓与止血体外诊断技术可在筛查、监测、诊断、治疗等多方面应用，且靶向性与精准性更高，可以根据患者情况提醒其提前进行预防治疗，同时也可以协助医师对病人制定更为精准的诊疗方案，提高医院血栓诊治水平，降低患者治疗支出。
在制造过程中，由于凝血分析仪因检测方法学的特殊性，在仪器构造、光学部件及机械部件方面要求较高，国产品牌仪器的质量还有待提升。检测项目种类过少，基本集中在PT、APTT、FIB、TT、D-Dimer、FDP及AT项目。关键生物原材料供应商较少，质量、成本均受一定限制，国产试剂的自产率有一定的局限。长久以来，在我国血栓与止血体外诊断市场中，希森美康、思塔高、美国国家仪器实验室等国外企业因其技术及先发优势，覆盖国内大多数三级医院，占据绝对领先地位，占有80%以上的国内市场份额；国产品牌的主要战场在二级及以下医院，以赛科希德、迈瑞医疗为代表的国产品牌，三级医院市场份额仍然较少。随着国家政策的扶持和国产品牌的技术进步，将有利于国产品牌的发展壮大，推进凝血检测在三级医院的进口替代。
目前在中国市场，血栓与止血检测技术的临床应用，呈现出从血栓性疾病、出血性疾病的筛查，向疾病预防、疾病诊断和药物监测发展的趋势。随着新型直接口服抗凝药（DOACs）的发展，大量临床验证表明，单靶点的抗凝治疗也需要靶向监测。因此出凝血检测特殊项目（包括PC、PS、LA、vWF、Anti-Xa、凝血VIII因子、凝血IX因子等项目）的开展不仅弥补了传统实验室监测的空白，更是将诊断水平向精准治疗、个体化治疗方向持续推进，符合临床技术应用的发展趋势。在临床需求引导下，以上出凝血检测特殊项目也将遵循从三级医院逐渐向二级医院及以下医疗机构发展的规律，最终在国内市场上得到应用和普及，带来凝血检测新一轮的发展。
国内一部分凝血诊断企业已经在出凝血检测项目上开展了研发布局。如血管性血友病因子检测（vWF）、纤维蛋白单体检测（FM）、狼疮抗凝物检测（LA）、蛋白C和蛋白S检测（PC，PS）、抗活化X因子检测（抗Xa）、稀释凝血酶时间测定（dTT）等新的检测项目。
一、初级止血
生理性止血机制主要包括血管收缩，血小板血栓形成和纤维蛋白凝块的形成与维持三个时相。这三重反应在时间上是相继发生而相互重叠的。vWF通过粘连血小板，使血小板易于在受损血管的局部黏附，聚集于血管破损处，形成团块。同时凝血系统激活，凝血瀑布发生级联反应，激活的凝血酶作用于纤维蛋白原形成交联纤维蛋白网，加固血小板达到二期止血。形成的纤维蛋白血栓团块在纤溶系统的激活下逐渐被降解。
血管性血友病因子vWF是一种大分子蛋白多聚体。参与初级止血和凝血过程。vWF在血小板附着到血管内皮表面的过程中起重要作用，通过其和糖蛋白（GP）复合物Ib/IX和IIb/IIIa的连接，形成血栓。凝血过程中，vWF作为VIII因子（抗血友病因子A）载体，可以保护VIII因子不被降解。血管性血友病（vWD）由vWF数量或者功能的异常导致，是最常见的遗传性凝血障碍疾病。vWF的测定包括含量测定，功能分析，必要时还可进行基因诊断。将vWF抗体包被到乳胶微球上，采用免疫比浊法在凝血仪上可实现血管性血友病因子的定量检测。
二、纤溶系统及其标志物
纤维蛋白单体FM与纤维蛋白原降解产物FDP、D-二聚体三者一同构成纤溶系统检测的标志物。纤维蛋白原在激活后的凝血酶作用下形成松散的纤维蛋白单体FM，继而在XIII因子和钙离子的作用下形成交联纤维蛋白，而纤维蛋白原在纤溶酶作用下会形成X、Y、D、E等一系列片段，称为一次纤溶物，交联纤维蛋白在纤溶酶作用下形成XDP、DD/E、DD等片段。FDP包含D二聚体，FM是纤维蛋白原转变为交联纤维蛋白的过程中形成的中间产物。在国内D-二聚体和FDP近些年已进行了一定的临床应用，但核心原材料仍未批量国产化，D-Dimer和FDP的成本依然较高。国内在凝血诊断的优秀企业，已经从纤溶系统的抗原、抗体开始进行上游关键原材料的研发和产业化实现，未来有望在纤溶系统实现从上游原材料到诊断试剂、校准品、质控品的批量产品转化，可以从根本上实现纤溶项目的国产化。
三、易栓症
易栓症不是单一的疾病，而是指机体存在高血栓形成的倾向，主要是由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等的遗传性或获得性缺陷或存在获得性危险因素所致。易栓症的血栓栓塞类型主要为静脉血栓栓塞。
易栓症一般分为遗传性易栓症和获得性易栓症两类。常见的遗传性易栓症有蛋白C缺陷症、蛋白S缺陷症、抗凝血酶AT缺陷症、因子V Leiden和凝血酶原G20210A突变等，是基因缺陷导致相应的蛋白数量较少或质量异常所致，可通过基因分析或蛋白活性水平测定发现。获得性易栓症有些是容易引发血栓的疾病，如抗磷脂综合征、肿瘤，还有一些则是易发生血栓的危险状态，如长时间制动、创伤、手术等。对于AT、PC、PS、LA的检测都属于易栓症的范畴。
1. 狼疮抗凝物（LA）检测：狼疮抗凝物质（lupus anticoagulation，LA）是一种针对带阴电荷磷脂的自身抗体，抗磷脂抗体的一种，导致磷脂依赖的凝血试验时间延长。现已发现它可存在于多种疾病中。狼疮抗凝物质的持续存在被认为是抗磷脂综合征、不明原因的习惯性流产、死胎、胎儿发育迟滞、动静脉栓塞、各种易栓性疾病以及某些自身免疫性疾病的危险信号。
根据凝血途径不同，凝固法筛选LA有三种途径：外源途径、内源途径、共同途径。内源途径的检测方法有APTT、SCT、KCT等；外源途径有dPT、TTI等；共有途径有dRVVT、ECT、Textarin等。LA的检测包括筛查试验、确认试验和混合试验。LA的筛查试剂是含低浓度磷脂的试剂，确认试剂是含高浓度磷脂的试剂，通过各试剂得到凝固时间的比值来确认待测样本中LA的存在。混合试验是通过用健康正常血浆与待测血浆按一定比例（1:1或1:4）混合，来观察延长的活化部分凝血活酶时间（APTT）是否被纠正。若待测血浆缺少1种或多种凝血因子，则混合后延长的APTT将得到纠正；反之若待测血浆中存在LA等抗凝物质，则无法被纠正。
LA检测的敏感性基于磷脂对其的敏感程度，美国临床标准化委员会（CLSI）推荐LA的检测应至少选择两种方法来提高敏感度：稀释蝰蛇毒试验（dRVVT）及一项基于APTT检测的试验，如SCT。如果仅使用一种方法进行试验则一定会漏检一部分LA，所以有条件的情况下应同时使用两种方法进行检测。国内企业正在采用dRVVT和基于硅物质激活的内源途径开展LA的筛查和确认试剂的研发，以提高抗磷脂综合征的检测灵敏度。
2. 蛋白C（PC）检测：蛋白C是维生素K依赖蛋白，由肝脏合成。蛋白C在血浆中是以酶原的形式存在，在凝血酶，钙和磷脂的存在情况下被激活，这种作用被内皮因子和血栓调节蛋白加强。活化蛋白C与蛋白S结合，通过中和来调节止血过程，总之，蛋白C是一种主要止血过程调节物。蛋白C缺乏分为先天性和后天性两种。获得性蛋白C缺乏可由口服抗凝剂治疗和DIC造成的肝素紊乱而引起，先天性的蛋白C缺乏分为I型和II型，I型表现为蛋白C活性的下降和抗原的减少，II型较少见，表现为蛋白C活性的下降而抗原性正常。
国内企业通常采用发色底物法开展的PC的研发，即：蛋白C被一种来源于蛇毒衍生物的激活物激活，形成活化的蛋白C，后者作用于人工合成的发色底物。颜色的变化与待测血浆中的蛋白C活性水平直接相关，从而检测PC的活性指标。
3. 蛋白S（PS）检测：蛋白S在生理上有潜在的抗凝功能。它作为活化蛋白C的辅因子，与其形成复合物。在钙离子存在的情况下，这一复合物与磷脂表面紧密结合，通过蛋白质水解抑制凝血酶激活的FV和FVIII。蛋白S大大加强蛋白C的抗凝功能。蛋白S分子的凝血酶敏感区域可被凝血酶有限的水解。这样，蛋白S可保留与磷脂结合力，但是，丧失了它作为活化蛋白C辅因子的抗凝功能。
目前国内有企业采用乳胶免疫比浊法，开展游离蛋白S抗原的测定，基于对两种乳胶试剂聚集所产生的混浊度进行分析。其中一种是C4bp包被的乳胶试剂，在Ca离子存在的条件下，与待检血浆中的FPS有高度的亲和反应；与C4bp包被的乳胶试剂结合的FPS再次与包被了直接抗人FPS单克隆抗体的乳胶试剂发生聚集，聚集的程度与样本中的游离蛋白S抗原直接相关。
四、抗凝治疗监测
机体内在正常生理状态下凝血系统与抗凝系统达到生理性平衡，抗凝系统通过机体内的三大抗凝系统和其他抗凝蛋白来达到调节凝血的过程。三大抗凝系统主要是抗凝血酶、蛋白C系统、组织因子抑制物TFPI。当机体内的抗凝系统发生紊乱时就会导致血栓疾病的发生，通过体外服用抗凝药物来达到抗凝效果。
抗凝药物从发展至今，随着生物制药技术的发展，经历了传统抗凝药物到新型口服抗凝药物的发展，由以前的多靶点作用到现在的单靶点作用，由静脉注射的肝素类药物，口服华法林药物，到更加安全的低分子肝素、抗Xa、抗IIa药物的出现，包括直接凝血酶抑制剂的达比加群、阿加曲班，间接Xa因子抑制剂的磺达肝葵钠，直接Xa因子的抑制剂阿哌沙班、利伐沙班。由于部分患者对药物代谢的差异，对于抗凝用药治疗方面需要进行监测。其中抗Xa和dTT这两个项目都是针对抗凝药物的检测，从而确定用药的剂量，以免抗凝不足导致的血栓风险和抗凝过量导致的出血风险。
1. 抗活化X因子（抗Xa）检测：近年来，新型口服抗凝药物（DOACs）直接Xa因子抑制剂利伐沙班与阿哌沙班相继面世。由于其难以预测的药代动力学特征，临床在特定情况下也需要对其监测，以更快达到抗凝治疗的目标，满足更长的质量范围，从而降低出血风险和血栓复发的几率。通过抗Xa活性检测，可针对临床上广泛用于预防和治疗血栓性疾病的抗凝药物的药效进行监测，充分发挥药物抗凝效果，同时避免出血问题。
相比较传统的APTT，抗Xa检测在肝素治疗监测中具有更多的优势，体现在测定方法学更为特异，检测结果稳定，剂量响应灵敏，对临床用药更具有指导意义。目前，包括ECLS在内的许多机构把抗Xa活性作为普通肝素和低分子肝素监测、剂量调整的金标准。通过对反应药物作用靶点的监测，以达到最好的治疗效果。
抗Xa测定试剂盒采用发色底物法定量检测人枸橼酸钠抗凝血浆中普通肝素和低分子量肝素的活性。其原理是基于抗凝血酶AT和肝素所形成的复合物中和活化的Xa因子的能力来测定肝素活性。在血浆中加入发色底物，然后加入过量的Xa因子，当Xa加入到血浆-底物混合液中时有两个反应同时发生，即：底物在Xa作用下水解释放对硝基苯胺（pNA），AT-肝素的复合物对Xa的抑制，当竞争反应达到平衡后，pNA的量和反应体系中肝素浓度呈反比，从而可以测量血浆中肝素和低分子肝素的活性。
目前，在国内市场上销售的抗Xa检测试剂较少，国内自主开发的抗Xa检测试剂稀少，国内一些中小型医院没有开展抗Xa检测项目，已开展该项测试的医疗机构大多选用进口试剂，价格较为昂贵。国内一些企业目前立足市场需求，将在近1-2年内完成抗Xa测定试剂盒（发色底物法）的开发，以满足各级医疗机构用药监测的需求。
2. 稀释凝血酶时间（dTT）检测：近年来，直接Ⅱa因子抑制剂达比加群已在临床中得到应用。通过Ⅱa活性检测，可针对临床上用于预防和治疗血栓性疾病的抗凝药物——达比加群的药效进行监测，充分发挥药物抗凝效果，同时避免出血问题。
临床上使用传统的APTT与TT监测达比加群的使用，但是该方法并不能有效监测达比加群，部分出血病人并未被监测到，而dTT测定试剂能够定量检测患者体内达比加群的含量，检测结果稳定，剂量相应适中，对临床用药更具有指导意义。
目前，在市场上销售的Ⅱa抑制剂检测试剂种类少，国际上也鲜少有检测试剂，只有HYPHEN与沃芬具有dTT试剂，价格较为昂贵，在国内并未注册上市。当前，国内生产企业已开展IIa抑制剂的dTT试剂的研发，该试剂采用凝固法定量检测人枸橼酸钠抗凝血浆中达比加群的含量。其原理是凝血酶能够中和达比加群，试剂中剩余的凝血酶量与达比加群量呈反比。该产品一旦研发成功，可填补我国IIa抑制剂达比加群的抗凝药物监测的空白，并形成国际领先优势。
五、研发策略与路径
上述项目无论是从抗凝还是纤溶系统、一期止血各方面的检测，归根结底是为了更好的实现临床诊断以便用药和治疗。随着新型直接口服抗凝药（DOACs）的应用，大量临床表明，DOACs治疗非瓣膜性房颤（NVAF）和急性静脉血栓栓塞症（VTE）的安全性和有效性优于VKAs和普通肝素。然而部分患者由于对于药物的自身代谢差异，用药安全也需要进行检测。上述的抗Xa和dTT检测就是对单一靶点的作用，而利伐沙班可使凝血酶原时间PT延长，延长程度与血药浓度相关性很弱，而且影响因素较多，检测达比加群和阿哌沙班灵敏度低，可靠性差。活化部分凝血活酶时间APTT对于利伐沙班的敏感性比PT更低，同样也不适合监测阿哌沙班，达比加群。凝血酶时间TT对低剂量达比加群异常敏感，但随着浓度增加，明显延长，超出监测上限，只适合低剂量的监测，活化凝血时间ACT，与高血药浓度相关。这些检测方法在临床上由于缺乏剂量-效应关系，很难做到精确的调整剂量。
单靶点的抗凝治疗更需要靶向监测，抗Xa活性试验定量检测，用药品标准品绘制抗Xa定标曲线降低了反应变异性，并提高了敏感度和特异度。通过校准APTT也减少了不同试剂对APTT肝素敏感性的差异造成的干扰，CAP和ACCP推荐肝素治疗时抗Xa的活性为0.3-0.7IU/mL，对于狼疮抗凝物LA，内源性因子缺乏或接触性因子缺乏的患者，用APTT检测都不如抗Xa监测可靠。蝰蛇毒凝血试剂ECT和稀释凝血酶时间dTT受制于方法学的最低检出限，对低于30-40ng/mL的达比加群酯敏感性不足，对治疗剂量和超剂量具有良好的线性关系。
无论是抗Xa还是抗IIa都是单个因子的活性作为作用靶点，最终都减弱了凝血酶的生成，而凝血酶生成试验TGT可能是反映DOACs抗凝效果的理想手段。所以抗Xa监测和dTT都是反映个别凝血因子的抑制情况，而不是总体的抗凝效果，凝血酶生成试验则通过血液凝固速度与强度来反映总体趋势。此外，血液中半衰期很短的凝血酶-抗凝血酶复合物TAT也可以间接评估药物抑制凝血酶活化的程度。凝血酶生成后，催化纤维蛋白原裂解掉纤维蛋白肽，剩余片段形成FM，FM在一定程度上反映了凝血酶生成或者说凝集启动。在FDP和D二聚体判断纤溶和凝块降解的同时，FM可以帮助医生得以评估抗凝治疗中凝血酶被部分抑制后的剩余活性裂解纤维蛋白原的能力，或了解患者术后是否仍存在血栓形成趋势。此外PC，PS，LA，vWF也是从各方面去监测易栓症和一期止血的风险及血管活性水平。因此，国内凝血诊断企业，针对上述项目的开展不仅弥补了传统实验室监测的空白，更是将诊断水平不断提升到精准治疗，个体化治疗，从而实现真正意义上的进口替代。
