血栓前状态分子标志物检测方法与早期检测的临床应用价值

作者:吴科伟
作者单位:广州万孚生物技术股份有限公司 2022-01-26

吴科伟工学博士,现任广州万孚生物技术股份有限公司产品经理。2013年毕业于浙江大学材料物理与化学专业,曾供职于中国科学院、万孚生物等,长期从事市场与产品相关工作。


循环血液中的有形成分因某些诱因附在血管壁,引起体内凝血系统、抗凝系统、纤溶系统的失衡,导致更多有形成分附着于内皮细胞,造成血管壁狭窄、堵塞,进而会发生血液循环障碍。这种血液异常凝聚的特殊结构即是血栓。在动脉系统,血栓可能导致肢体或者靶器官无法供血供氧(常见如心梗或脑梗);在静脉系统,可能导致血液无法回流(常见如深静脉血栓或肺栓塞)。


 

一、血栓形成的危害及早期检测的价值


血栓性疾病在临床上具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发的特点。据《2021年中国心血管病医疗质量报告》数据,“2020年,医院质量监测系统共有心血管病住院患者1026万例”,其中与心梗相关的人数占到了冠心病的14.9%[1]。按照美国2010年对静脉血栓的流行病学数据[2],5%-8%的人口拥有血栓风险,而每年有1‰-2‰的人口会受影响,导致了6万-10万的人的死亡,且1/3的患者在长期康复中会有复发现象。2021年1-6月全球心脑血管类药物的销售总额达到了294.3亿美元,同比增速8.9%[3]。1990-2017年的研究数据表明,心脑血管疾病和癌症是过去三十年中国人主要死因[4]。这两类疾病与凝血功能的异常都有密切关系。


图1揭示了内源、外源、共同凝血途径,这是各类凝血指标的理论基础。目前临床上常用凝血组合测试(例如血浆凝血酶原时间PT、国际标准化比值INR、活化部分凝血活酶时间 APTT、凝血酶时间测定TT、血浆纤维蛋白原测定FIB、纤维蛋白原降解产物FDP、D二聚体DD、抗凝血酶Ⅲ AT-Ⅲ)以及凝血因子(例如凝血因子Ⅱ,Ⅴ,Ⅸ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅴ,Ⅷ,Ⅺ等)活性等检测。这些检测已经覆盖凝固、纤溶等系统,往往属于血栓形成后的筛查检测与治疗评估,对血栓前状态、Pre-DIC早期识别等不敏感,同时对溶栓治疗检测未能及时反馈。临床始终缺乏对血栓进行早期诊断明确指标,加上未有明显的临床表现,早期检出概率几乎只有1%。



图1. 内源(Intrinsic Pathway)、外源(Extrinstic Pathway)、共同途径(Common Pathway)示意


无栓做预防、有栓早发现,是应对血栓性疾病的重要手段,对改善预后有重要且直接的影响。因此,开发新型凝血标志物用于预测血栓风险具有重要意义。


二、代表性标志物及检测方法


在国内的血栓防治的各种临床指导性共识中,不管是弥散性血管内凝血防治指南还是骨科静脉血栓防治指南,绝大多数涉及的实验室检验项目对血栓前状态关注较少。


血栓前状态(PTS)或称血栓前期,是一种止血、凝血和抗凝系统失调的病理过程。因此血管内皮细胞、血小板/白细胞、红细胞、凝血因子、抗凝血因子、纤溶因子及血液粘度发生变化,表现出某些特征或者释放某些产物,都可以作为血栓前的分子标志物。笔者总结了各类凝血研究中涉及的相关指标(见表1)。


这些研究涉及对抗凝、纤溶活性的检测,凝血、纤溶物质抗原和活性的检测以及与凝血、纤溶有关的分子标志物检测三个层次。在商用试剂层面,仅血管性血友病因子vWF、蛋白C、蛋白S、血栓调节蛋白TM、血浆凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物TAT等少数获得了国家药监局(NMPA)的注册批准,方法学以凝固法、发色底物法和化学发光法为主。


表2比较了凝血标志物检测中用到的不同免疫方法学。放射免疫对实验室操作有较复杂要求,逐渐为酶联免疫、化学发光等主流免疫技术替代;流式细胞术在因子类的多重检测方面具有独特优势,但由于设备昂贵、使用专业而在临床应用中也相对受限。从实验室质量、测试通量、操作便利性等角度来看,凝血标志物的检测倾向于向发色底物法、化学发光法、流式细胞术的方向转变。

 

 

 

临床实践揭示,单独测定某一指标很难准确反映体内的真实情况(促凝与抗凝、纤溶的失衡是血栓形成或出血的重要原因),宜根据引起血栓前状态或治疗目的以及采用的制剂,采用多种分子标志物指标,综合分析动态观察。


三、常用分子标志物检测的意义


随着学科认知及检验技术的进步,越来越多的血栓标志物从放射免疫法、酶联免疫法等方法学转向了化学发光法。与常规凝血检测使用的全自动分析仪类似,化学发光法也可以通过高度的自动化流程来提高检测的便捷性(例如自动上样、自动温育、自动稀释等),减小人为操作的影响(全程无需人工值守),通过高灵敏度的光电系统确保检测的灵敏度(一般可以达到pg/ml级),通过与免疫项目共用仪器的方式减少投入,这些优势使得项目应用能够真正走向临床。


比较典型的案例代表是用于凝血-纤溶功能异常评估的四项检测指标,即血浆凝血酶-抗凝血酶复合物TAT、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物PIC、血栓调节蛋白TM、组织纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物t-PAIC。简单来说,TAT反映抗凝系统被激活(凝血系统启动标志物,判断抗凝治疗最佳时期,适用于血栓/DIC早期诊断,溶栓治疗的再栓监测),TM反应内皮损伤(提示血管内皮系统受损程度),t-PAIC和PIC反应纤溶系统启动(PIC是提示纤溶激活,t-PAIC提示纤溶抑制,辅助诊断DIC和指导抗纤治疗方案),其作用机制简单表述如图2所示。



图2. TAT、TM、PIC、T-PAIC检测项目在血栓形成路径中的作用机制简图


现行的化学发光法检测TAT、PIC、TM、t-PAIC时,一般都采用自动化发光仪的双抗体夹心法,使用酶促化学发光原理进行检测。通过四项的组合,结合FDP、DD检测,可以对血栓性疾病的早期诊断、溶栓治疗时再栓的监测、血管内皮系统损伤诊断具有很高的临床价值。


以弥散性血管内凝血DIC为例。弥散性血管内凝血是一种获得性全身性血栓—出血综合征,此类患者会出现不同程度上的皮下、伤口和颅内等部位出血、皮肤黏膜发绀、坏死和脱落、呼吸困难、低血压等。DIC是临床和实验室综合诊断的结果,没有单独的实验室检查能准确地确认或除外诊断[5]。但值得注意的是,日本DIC防治指南(日本血栓形成与止血学会JSTH发布)将TAT作为评分标准纳入到评分体系中,2017年《中国弥散性血管内凝血诊断积分系统》的解读中也提到可以将这四个项目与评分系统联合应用于DIC的诊断和分型[6]


JSTH对于DIC的诊断,提出显性DIC(overt-DIC)和非显性DIC(non-over-DIC)概念,将出现DIC症状但未达到DIC诊断标准的情况定义为非显性DIC,并强调对于凝血紊乱的动态监测,以更好的对于DIC的早期诊断及干预,在非显性DIC诊断标准中提出对于TAT、PIC等分子标志物的监测[7]。而在2017年日本血栓与止血学会DIC诊断标准中,除原有FDP等指标外,加入后TAT,提出TAT存在超出正常值两倍以上升高,作为DIC诊断的评分标准之一[8]


在国内由华中科技大学协和医院牵头的一项全国前瞻性多中心研究显示,对于444名具有不同基础疾病的疑似DIC患者和137名健康人进行TAT、PIC、t-PAIC、TM和常规凝血指标(如D-二聚体、FDP等)检测,对于DIC患者和健康对照间,TAT、PIC、tPAIC、TM、DD等指标间存在显著差异,而在pre-DIC患者(患者未来7天内进展为显性DIC)中,TAT、t-PAIC、TM等指标与非显性DIC患者具有明显差异,与显性DIC患者接近,说明其可在DIC进展早期阶段鉴别,有助于及时干预,并且将4种标志物综合分析,可以获得更高检测效能。并且TAT、t-PAIC和sTM也是患者28天死亡率的良好预测指标,高水平与不良结果相关[9]


而对于不同基础疾病引发的DIC中,由于病理机制不同,TAT、PIC、TM、t-PAIC也分别具有辅助诊断价值,为其诊断提供针对性评估。在华中科技大学协和医院多中心的研究显示,血液系统恶性肿瘤和实体瘤中DIC患者与非显性DIC患者的四种生物标志物均有显著差异。脓毒症性DIC患者血浆TAT、t-PAIC和sTM水平明显升高。创伤/手术患者的t-PAIC和sTM表现出显著差异。由此提示TAT、PIC、t-PAIC和sTM可分别对于不同基础疾病的DIC患者辅助诊断[9]


另外其他研究也有类似的证实,与非DIC患者相比,创伤诱发的DIC患者血浆中TM水平升高,这反映了患者体内早期的高凝状态[10]。而严重感染合并DIC的患者中,血浆TAT、PAI-1和APC活性均显著高于非DIC患者[11]


此外另有王猛等研究发现,TAT、TM及t-PAIC联合检测对早期诊断重症感染引发DIC的具有较高的价值[12]。陈雅铃总结发现,出凝血分子标志物(如PAP、TAT等组合)不受凝血因子变化的影响,具有较高的特异性与敏感性,有利于弥散性血管内凝血的早期诊断和病情的监测[13]。张彤等也揭示在脓毒血症合并DIC的早期诊断中,血栓四项阳性诊断率更高[14]。类似的,蒋冬雪等人认为TAT、PIC、TM、t-PAIC可用于早期诊断DIC,并且认为四种指标联合应用较单一指标更有价值,提出联合中国弥散性血管内凝血诊断积分系统(CDSS积分系统)可大大提高DIC的早期诊断率,为临床早期干预和治疗提供最佳时机[15]


肿瘤与凝血的相关研究也是值得关注的主题。由于肿瘤的异质性很大,不同的肿瘤、不同的分期,以及是否用药、是否化疗,与其相关的凝血可能变化很多。而凝血酶会激活补体系统、细胞增殖、炎症系统,都会对肿瘤产生影响。更进一步的,某些肿瘤药物的应用,也不可避免的带来凝血因子、血栓性微血管病或者内皮细胞功能异常等。静脉血栓栓塞(VTE)包括深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE),是癌症患者常见并发症及死因,发生率在4%-20%[16],在所有首次发生VTE的病例中20%~30%和肿瘤相关。肿瘤患者VTE的发生率比非肿瘤患者高4~7倍,且呈逐年上升趋势。


Hiromitsu Kitayama等对于97名进行化疗的恶性肿瘤患者分别于化疗前和化疗后3个月采用影像学方法进行VTE检测,于化疗前检测TAT、PIC等凝血指标。发现在97名患者中有17名患者在化疗前存在VTE,而12名患者于化疗后3个月内发生VTE。研究显示血浆中TAT升高伴有PIC不升高(TAT 2.1ng/mL和PIC 1.8μg/mL为阈值)是对于总体VTE患者和化疗后新发VTE患者的唯一显著危险因素,其OR值分别为3.0和9.4,说明其可用于对于肿瘤化疗患者的VTE评估手段[17]。国内崔婵娟等针对171例恶性肿瘤患者做了研究。通过观察其体内血浆凝血纤溶情况,探讨凝血纤溶标志物在诊断恶性肿瘤患者血栓中的作用,认为恶性肿瘤患者体内凝血与纤溶活性异常增强,TAT及PIC优于DD对恶性肿瘤患者血栓的诊断[18]。陈文欣等通过比对164例恶性肿瘤患者(包括呼吸道肿瘤、消化道肿瘤)和52名体检健康者(正常对照组)的血栓四项结果,提示该四项指标可以作为恶性肿瘤病情进展、疗效观察及预后判断的指标[19]


综合来说,TAT、PIC、TM、t-PAIC等项目在ICU、骨科、肿瘤科、产科、新冠肺炎患者、心内等都有良好的临床研究成果,体现了这些项目在外科围手术血栓风险评估与急危重症患者的凝血功能监测中的重要意义。


同时我们必须意识到,血栓类疾病的发病机制比较复杂,涉及到凝血,抗凝和纤溶等多个过程,仍应提倡不同阶段多指标组合使用。与D-二聚体等经典项目相比,大多指标仍缺乏足够的循证证据,许多试验指标虽然在前期研究中已经初步阐释了病例性变化特征,但更多是病例系列研究和病例对照研究,很少有基于前瞻性设计的多中心临床对照研究,因此难以准确把握这些指标的临床价值、在疾病发展过程中的演变规律及与临床结局的相关性,从而无法真正意义上指导临床诊疗行为。另外,现有研究结果中,围绕中国人群的高质量数据还比较少,而缺乏本地化数据和指南在应用于临床时存在安全性问题。需进一步开展经过规范化设计的临床研究,并与临床协作,选择适合的血栓实验室项目纳入到各类型血栓防治研究中。


 

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2022年1月:血栓与止血实验室检测