电化学技术检测活化凝血时间的临床应用及其优势
Jeffery Chen，南京岚煜生物科技有限公司CTO，美籍华人。中国科学院微电子与固体电子学博士，美国辛辛那提大学医学院/路易斯安那州立大学化学系博士后。具有20年微流控产品开发经验，曾在新加坡制造技术研究院担任科学家。具有丰富的微流体器件的设计与制造经验，精通各种高灵敏度检测方法的设计与开发。现任美国化学学会、电气与电子工程研究院、美国电泳学会的会员。
活化凝血时间（ACT）于1966年Paul Hattersley 首次发现并阐述[1]，随后发现ACT可在肝素抗凝监测中发挥作用。近些年随着肝素应用场景的不断扩大，ACT的临床研究也逐步深入。ACT作为指导肝素剂量的检测指标，已经在体外膜氧合（ECMO）、经导管主动脉瓣置换术（TAVR）、经皮冠状动脉介入术(PCI)、急性心梗溶栓、心血管手术、血液净化等临床场景得到广泛的使用。随着现代医学的不断发展，ACT的检测从传统的手工方法发展到仪器检测，如半自动、全自动血凝仪，再到便携式血凝仪；检测方法由最早期的计时法发展到光学法、磁珠法和电化学法等[2]，ACT的检测也因此变得更加简便、迅速、准确、可靠。
一、活化凝血时间检测方法
1. 光学法：光学法也叫光学凝固法，使用较人眼更为灵敏的光电传感器检测凝固过程中的浊度变化来测定血液凝固[3]。根据不同的光学测量原理，又分为散射比浊法和透射比浊法两类[4]（如图1）。
图1. 散射或透射比浊法原理图
光学法的优点在于检测灵敏度高、仪器结构往往较为简单。在光学比浊检测时，由于激发光必须照射在测试杯的中间，因此对检测的试剂量需求较多。此外，检测结果也极易受到干扰，如测试杯的光洁度，加样中产生的气泡等都会干扰检测[5]。在检测高脂血、黄疸血等特殊血样时，由于本底浊度或颜色的存在，很多仪器在数据处理过程中会采用本底扣除的方法降低干扰，但这仅对中、低干扰的样品有纠正作用，仍不能解决高干扰样品的测试问题。
2. 磁珠法：测试杯两侧有一组驱动线圈，产生恒定的交替电磁场，在待检样品中加入小磁珠，并使其保持等幅振荡运动，加入凝血激活剂后，随着纤维蛋白的产生增加，小磁珠运动强度逐渐减弱[6-7]，此时仪器根据另一组测量线圈感应到小磁珠运动的变化，当运动幅度衰减到50%时确定凝固终点[8]（如图2）。磁珠法在检测时不受溶血、黄疸血及高脂血的影响，并且磁珠保持在测试杯底部运动，因此检测样本用量较少[9]。由于磁珠属于一次性耗材，生产过程需经多道工艺特殊处理，测量成本较高[10]。此外，磁珠法在使用过程中存在一些局限性[5]：（1）必须有明显和牢固的凝块才能作为判断；（2）弱凝固反应对结果判断有影响；（3）受外界磁场的影响；（4）受血浆黏度的影响；（5）受其他物理因素的影响。
图2. 双磁路磁珠法原理图
3. 电化学法：基于电化学原理和物质的电化学性质而建立起来的分析方法，称为电化学分析法。它是将特定的电极插入试样溶液构成一个化学电池或电解池，然后根据被测体系的各种电化学性质（电极电位、电流、电量、电导和电阻等）来确定其组分及含量的分析方法[11]（图3）。
图3. 电化学传感系统原理图
电化学检测的技术方法主要有三种：（1）电流测定法，测量发生在氧化还原过程中与电子转移相关的电流；（2）电位测定法，测量离子间或化学-生物分子间的相互作用而引起的电极电位变化；（3）阻抗测定法，测量两电极间整个离子介质的相关电导或电容的变化[12]。
二、电化学技术检测活化凝血时间原理
采用电流测定法，利用血液中纤维蛋白的导电性，而纤维蛋白原无导电性的特点，通过主控芯片产生脉冲电压信号，加在血液样本上，让血液样本成为电路的一部分，且导通电路。当血液样本滴入检测卡后，由于毛细管力的牵引，样本流至反应区。每个反应区间都包含有一对金属电极。配套手持式凝血分析仪器会产生恒定的电压输出到该金属电极上。在反应区内，血液通过与固定的反应试剂结合诱发一系列生化反应开始凝固。仪器监测血液凝固的过程，产生电流信号的变化并生成电流与时间变化的凝血曲线。在凝血曲线里，一开始由于样本的流动，两个电极之间被连接，电流信号上升并达到顶点，伴随着凝血过程中凝血因子的激活以及纤维蛋白原转化成纤维蛋白的过程，曲线发生变化并产生相应的特征（高度、面积等），由数据处理系统对这一曲线的凝血特征代入构建的模型计算得出凝血指标检测结果[13]（如图4）。
图4. 电化学技术检测活化凝血时间原理图
三、活化凝血时间临床应用
1. 体外膜氧合：体外膜肺氧合（ECMO）临床上主要用于心脏功能不全和（或）呼吸功能不全的支持，是治疗难以控制的严重心力衰竭和呼吸衰竭的关键技术。在ECMO辅助期间，患者血液处于持续高凝状态，必需使用抗凝措施以预防血栓形成，肝素是ECMO运行期间最常用的抗凝剂，但剂量使用不当容易导致出血风险增加，危及患者的生命健康[14]。
在成人使用时，根据PCI是否联合ECMO，决定不同的抗凝要求；如ECMO+PCI联合实施时，ACT应大于350s；而PCI后或单一ECMO运行期间，ACT维持于140-220s范围内[15]。在儿童使用时，ECMO建立后待ACT值降至300s以内，开始持续泵注普通肝素抗凝，术中ACT维持于160-200s范围内[16]。
2. 经导管主动脉瓣置换术：经导管主动脉瓣置换术（transcatheter aortic valve replacement，TAVR）已成为老年主动脉瓣狭窄患者的一线治疗手段，这类高龄患者的并发症发生率较高，而出血是主要的并发症之一。TAVR术中主要使用普通肝素进行抗凝，但使用剂量过多会增加出血风险，为了减少出血的风险，需要监测ACT并维持在250-350s范围内，从而控制肝素的使用剂量[17]。
3. 经皮冠状动脉介入术：经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）是治疗冠心病的主要手段之一。该类疾病尤其是急性冠状动脉综合征的患者，血液处于高凝状态，加上PCI的有创性操作和导管接触血管内皮表面，加剧血栓形成，因此PCI围术期前中后阶段均为血栓事件的高发时期。
普通肝素是PCI围术期的一线抗凝药物，但是肝素剂量使用过多会有出血的风险。因此PCI手术过程中，正确使用肝素剂量至关重要，需要监测ACT，并维持ACT在一定范围内[18]。
4. 心血管手术：体外循环支持下的心血管手术需要全身肝素化进行抗凝，肝素剂量使用不当容易造成出血，因此出血是常见的严重并发症之一。为了避免出血，术中肝素使用后5min开始测ACT，根据ACT的结果及时调整肝素使用剂量，以及进行主动脉插管（ACT＞300s）和转机（ACT＞480s）的决定[19]，并在转机及拔管后都需要复查ACT且维持在300-600s范围[20]。
5. 血液净化：预防体外凝血是血液净化持续有效进行的基本原则之一，血液未抗凝时，滤器及管路的寿命将缩短，治疗效果不佳。目前最广泛使用的抗凝剂仍是普通肝素，但剂量使用不当可能会增加出血风险，为了评估患者血液净化过程中体外循环和体内血液的凝血程度以及是否易于出血，需要监测凝血状态。
不同情况下血液净化时凝血功能维持水平有所差异：儿童急性肝衰竭时，维持ACT在180-250s[21]；儿童脓毒症时，维持ACT在140-220s或APTT在正常值的1.5-2倍[22]；成人血液净化时，若抗凝剂为肝素或枸橼酸钠，维持ACT至治疗前的1.5-2.5倍[23]。
四、电化学检测技术优势
这与其他方法学相比，电化学分析法无需设计光路，就可获得与荧光检测同等的灵敏度，成本低，检测系统可以小型化[24]。电学和电化学技术设备一般是便携式、微型化，同时还可以满足以下优点：（1）简单易行，相比难以测定的化学信号参数，电信号参数更容易测定，且设备操作相对简单；（2）灵敏度高，物质间微小的变量可以通过容易测定到的电流或电位进行测定；（3）实时性好，利用高精度的特点，可以检测出微反应量，可实现实时定量检测。（4）样本用量少，可适用末梢血等微量血样操作。
电化学技术具有高灵敏、操作简单、经济、快速、可移动、微量血样、不受样品的浊度和颜色影响等优点，在ACT检测临床应用上，具有更广泛的适用场景。
1. 可床旁检测：传统中心实验室/检验科检测，需完成采血-样本送检-仪器检验-出结果报告等基本流程，报告周转时间（TAT）较长。床旁检测设备可在手术室中使用，能够通过一份样本检测短时间内获得所有需要的血凝参数，缩短报告周转时间（TAT）。且床旁检测结果与部分患者的临床预后密切相关，研究证实，在心脏手术中使用床旁检测设备，降低了围手术期输血的需求[25]。
2. 可实时监控并调整用药：在肝素作为抗凝剂的手术中，预防血栓的同时会增加患者出血风险，因此术中需加强凝血功能监测[26]。在床旁检测时，可实时监测并维持适当的ACT水平，根据监测结果及时调整抗凝药物剂量，结合患者病情实时监控综合判断，可有效降低患者血栓/出血风险。
3. 其他：基于电化学技术设备的小型化、操作简单及可移动性等优势，除了可应用于常规医疗场所外，还可应用于口腔医院，美容医院，宠物医院以及救护车、野外救援和家庭（自测）等不同场景。
五、总结与展望
ACT电化学检测既具有技术优势性又满足其临床应用需求，在肝素治疗监测中为患者的个性化肝素用药提供了客观依据，目前已在临床上广泛应用，值得市场推广。但不同ACT检测方法学设备之间缺乏规范性，应根据术者自身技术及医院条件来选择合适的检测方式。若期望缩短报告周转时间(TAT)，满足临床医生对指标快速准确报告的迫切需求，或许可更多的考虑采用电化学检测技术。
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