凝血全过程检测技术：凝血酶生成试验的研究热点
凝血酶在凝血过程中发挥极其重要的作用如图1。凝血酶生成后，主要作用是催化纤维蛋白原向纤维蛋白单体的转化，除此之外，它还可通过多条途径加速和巩固凝血过程，主要包括：（1）激活FⅤ、FⅧ使两者分别转化为FⅤa、FⅧa；（2）激活FⅦ使其转变为FⅦa；（3）激活FXⅢ,促进纤维蛋白的交联；（4）激活FⅪ。（5）引起血小板活化，从而为FⅩa和凝血酶原复合物的形成提供有效的膜表面载体等。除此之外，凝血酶还有许多其他功能，如激活蛋白C使其发挥抗凝活性、刺激成纤维细胞分裂、对巨噬细胞有趋化作用、参与内皮细胞增殖调控等[1]。因此，对凝血酶活性的检测就显得尤为重要。
图1. 凝血酶在凝血过程中的促凝作用
图2. 凝血酶在凝血过程中的抑制作用
既往主要通过检测常规凝血项目凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶原时间（APTT）来反应体内凝血酶的活性。然而，研究显示这两种指标并不能完全代表体内真实的凝血环境。在血友病和相关患者中，PT和APTT确实有异常的延长，但是在部分体内抗凝蛋白(蛋白C、蛋白S和抗凝血酶)缺乏的患者中，PT和APTT的检测结果却处于正常范围。造成这种结果的原因主要有两个方面：首先，在PT和APTT的反应达到终点时大约只有5%的凝血酶被激活[2]；其次，反应过程中抗凝系统未被完全激活，比如蛋白C的激活需要血栓调节蛋白的参与，而血栓调节蛋白存在于内皮细胞[3]。因此，PT和APTT虽然能反应部分凝血酶活性，但是并不能反应体内凝血的全过程。凝血全过程检测技术—凝血酶生成试验（Thrombin Generation Test，TGT）填补了这一空白。
一、凝血酶生成试验检测原理和主要结果指标
TGT的产生可追溯至1953年，英国的临床病理杂志（Clinical Pathology）首次对其应用进行了报道[4]。经过多次改良，目前TGT通过监测反应体系中凝血酶作用下荧光底物的分离所产生的荧光信号，同时与已知凝血酶活性的标准品相比较，实现对样本中凝血酶浓度的定量检测。由于凝血酶标准品含有已知浓度的与α2巨球蛋白连接的凝血酶样酶，因此，凝血酶不受血浆成分的抑制，只与荧光底物发生反应。血浆颜色可能会干扰检测结果，因此，每个血浆样品都要加入相对应的凝血酶标准品进行检测。
简单来说，在96孔板的反应孔中加入检测血浆和试剂（如组织因子、磷脂、钙、荧光底物）来激活凝血。随着时间的推移，促凝物质活化，凝血酶生成，同时抗凝物质活化凝血酶生成延迟。反应体系中生成的凝血酶结合荧光底物（Z-Gly-Gly-Arg 7-amino-4-methylcoumarin），释放荧光基团，该荧光强度随时间的变化与生成的凝血酶浓度呈比例变化。通过特定的计算机软件记录荧光信号的变化，以内部凝血酶标准品为参照，计算待检样本中凝血酶的活性，绘制凝血酶生成曲线，计算相关参数。
凝血酶生成实验的基本参数如下图3和表1：（1）延迟时间（lag time），即检测体系从加入启动剂反应开始到凝血酶开始生成所经历的时间，以分钟（min）为单位；（2）峰值（peak），即生成凝血酶的最大量，以nM（nmol/L）为单位；（3）达峰时间（time to peak，tt Peak），即从反应开始到凝血酶达最大量所需要的时间，以分钟（min）为单位；（4）内源性凝血酶生成潜力（endogenous thrombin generation，ETP），即凝血酶生成曲线下的面积，其反映凝血酶生成的量，以nM*min为单位；该参数为凝血酶生成实验最重要的参数。（5）速率指数（velocity index，VI），代表凝血酶生成阶段的平均速率，VI=[peak height /（time to peak-lag time）]；（6）拖尾时间（start tail）：代表灭活凝血酶所需要的时间，以分钟（min）为单位。
图3. 凝血酶生成曲线
二、凝血酶生成试验血浆及试剂要求
1. 血浆：TGT可以应用多种类型的血浆，包括乏血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）、富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）[5]、冻融的富血小板血浆[6]和全血[7]。然而，不同类型的血浆需要选择相应的试剂进行检测。
2. 启动试剂：为了更接近体内环境，TGT选择尽可能低浓度的组织因子和磷脂作为启动试剂，最常用的组织因子浓度为1或5Pm，磷脂浓度为1-4μm。但是在进行一些血浆促凝能力降低的特殊样本（应用肝素或其他抗凝剂治疗）的检测时可能需要选择更高浓度的启动试剂[8]。
3. 荧光底物及定标品：TGT采用Z-Gly-Gly-Arg 7-amino-4-methylcoumarin作为荧光底物TGT配套有已知浓度的凝血酶定标品，定标品与测试样本同时进行平行检测或者分别进行检测，最终再将荧光信号转化为凝血酶浓度。
4. TGT配套试剂：CAT系统除了发色底物和定标品外，还配有6大试剂方案，包括普遍应用的TGT检测试剂（PPP-reagent）；对FVIII, IX and XI高度敏感的低浓度的PPP试剂（PPP-reagent low）；在凝血酶生成被高度抑制时（如应用肝素或抗凝血酶药物的患者）应用的高浓度PPP试剂（PPP-reagent high）；检测微粒适用的PRP试剂（PRP-reagent）和检测微粒的标准化试剂（MP-reagent）；血栓调节蛋白试剂（TM-PPP），能够满足多种实验用途需求，也支持对激活条件进行进一步方案调整[9]。
三、凝血酶生成试验的应用
1. 复杂疾病状态下患者凝血状态的评估：凝血异常与许多临床疾病相关，并且许多疾病导致出凝血异常的机制尚不清楚。TGT是一项检测从凝血酶生成开始到凝血酶生成结束的整体性试验，更能准确的判断在一些复杂的疾病状态下机体内凝血的状态，如肝硬化晚期或者肥胖、糖尿病、库欣综合征时患者的凝血酶生成潜力。
2. 出血性疾病的应用：在临床工作中，即使相同分型的血友病患者出血倾向也会有相当大的差异，给临床工作中患者治疗方案的选择带来一定的困难。TGT可以更好的区分虽然凝血因子水平相同，但出血风险不同的重症血友病[10]，从而为患者选择个性化的治疗方案。在相关治疗性药物如重组凝血因子、延长因子半衰期的制剂和基因治疗等研发的过程中，TGT也可以用来协助判断治疗方案提高患者凝血酶生成潜力的水平[11]，判断患者的出血风险。同时有研究证明，凝血因子水平并不能完全反应血友病患者的出血风险[12-13]，相比之下，TGT能更准确的预测患者出血事件的发生。VWD是最常见的遗传性出血性疾病,其发病率在百分之一到千分之一，然而并不是所有的VWD患者均会有出血事件发生，只有大约万分之一的患者有需要治疗的出血表现。Rugeri的研究显示，VWD患者TGT曲线低峰值与出血风险增加有显著的相关性（OR=14.5，95%CI=5-41.3）[14]。
除了上述先天性的出血性疾病，在术后、癌症等患者治疗过程中常需要进行抗凝治疗，这些患者通常没有既往出血病史，但是抗凝治疗大大增加了其出血风险，甚至危及生命。此时，判断患者出血风险显得尤为重要，相较于传统的常规凝血筛查，TGT结果可以是一个更加可靠的判断指标[15-16]。
3. 血栓性疾病的应用：静脉血栓栓塞（Venous thromboembolism，VTE）包括肺栓塞（pulmonary embolism，PTE）和深静脉血栓（Deep vein thrombosis，DVT），是临床上常见的血栓性疾病。近年来，我国的VTE诊断例数明显增加，国内相关流行病学研究结果显示，住院PTE的比例从1997年的0.26‰上升到2008年的1.455‰[17]。大多数的VTE患者经治疗都可以取得较好的效果。但是如果发现和治疗不及时，血栓将会快速进展，反复发作的下肢血栓脱落会导致大面积的肺栓塞或肺主干栓塞，严重者可能会导致患者死亡。Hylckama的研究结果显示，TGT是提示体内VTE风险的一个较好的指标，但是其与D-二聚体对VTE预测效能的优劣仍需更多临床试验进行探索[18]。
在大多数国家，心脑血管疾病仍然是导致死亡的主要原因之一。Carcaillon的一项长达两年的多中心观察性研究结果显示，发生急性冠脉综合征的患者高ETP、VI和peak的死亡率明显升高[19]，多项急性缺血性脑卒中相关临床试验证实，TGT显示高凝状态的人群急性缺血性脑卒中的发病率也会显著高于正常人群[20-21]。体外膜氧合（Extra-Corporeal Membrane Oxygenation，ECMO）用于在心肺手术时为患者进行体外的呼吸与循环支持。然而，在ECMO设备中，血液与非生物材料或生物材料持续性接触，可能会导致凝血系统的激活，然后将其输回给患者，可能会导致患者发生血栓、出血或设备故障。目前的常规实验室凝血检测项目如PT、APTT、Fib、TT和肝素的剂量对ECMO患者血栓风险的预测水平一般，有研究证实D-二聚体的升高可能与ECMO患者中血栓发生相关，但是其结果受其他致病因素的严重影响，并不完全可靠[22]，TGT可能是判断ECMO患者中促凝与抗凝系统状态的更好的参考指标[23]。
4. 抗凝治疗监测：在临床多种疾病中需要用到抗凝及抗血小板药物，常规的凝血检测项目虽然能提示体内出凝血风险但是并不能反映机体实际的出凝血状态。作为一项整体性的功能性试验，TGT可以较好的评价应用肝素、低分子肝素、磺达肝癸钠、直接口服抗凝剂进行抗凝治疗的患者深静脉血栓发生的风险[24-25]，另一方面，TGT也可以评价应用抗凝治疗的深静脉血栓患者的出血风险[26-27]。
四、展望与应用前景
TGT兼具准确性、敏感性和多功能性，在临床与科研领域都具有广泛的应用前景。临床中，TGT可用于对多种疾病出血和血栓风险的评估，也可进行抗凝治疗的检测，预防医源性出血的发生，提高治疗的安全性。在科研工作中，TGT也有助于了解药物开发过程中药物具体的作用机制及其对体内凝血酶生成的作用。TGT的结果可以给目前凝血检测项目提供强有力的补充，提高对机体内凝血状态的认识，将成为临床实验诊断的又一利器。
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