光学比浊法检测血小板聚集标准化专家共识

 参与血栓形成与止血是血小板的主要生物学功能，血小板相互间的联结称为血小板聚集，是血小板实现其功能的重要环节，血小板聚集率是诊断血小板疾病、评估血栓前状态、抗血小板药物疗效监测重要的实验室辅助检测指标。随着技术的发展，血小板功能分析的方法越来越多，如光学比浊法（light transmission aggregometry，LTA）测定血小板聚集率、计数法测定血小板聚集率、血小板功能测定仪、快速血小板功能分析仪、血栓弹力图等。

LTA测定血小板聚集率是最经典的血小板功能检测方法，检测成本低，与临床事件的相关性较好，临床应用比较普及，被称为血小板聚集功能检测的“金标准”[1]。其基本原理为：在特定的连续搅拌条件下，于富血小板血浆中加入诱导剂，导致其中的血小板发生聚集，富血小板血浆浊度变低，光电管将浊度变化转变成电信号，并在记录仪上描记出聚集曲线，由此可计算出血小板聚集的程度。采用不同诱导剂测定血小板聚集率，可初步判断血小板的活化途径。另一方面，影响LTA测定血小板聚集率的因素较多，涵盖检验前、中、后过程，涉及标本采集质量、转送和保存，抗凝剂及诱导剂的合理使用，试验仪器和耗材技术指标等诸多因素[2-9]，此外，LTA因人工操作步骤，不同实验室间可比性不强，目前还没有可以控制其精密度的室内质控物等因素，极大地限制了其在临床上的广泛应用[10]，因此有必要对LTA检测血小板聚集率进行标准化。

本共识起草组曾在2019年初至2020年8月，组织解放军总医院第二医学中心等6家三级甲等医院，进行了老年人群（60~100岁）多中心大样本（4820例）LTA血小板聚集检验结果参考区间的研究[11]，同时对试验方法学进行深入的探讨，形成了较完整的管理理念和质量体系，参考国内外相关文献，编写了本共识，以提高血小板功能检测质量管理和临床应用水平。

一、适用范围

本共识旨在通过规范LTA检测血小板聚集的前、中、后过程，促进LTA检测血小板聚集的规范应用和良性发展。本共识不仅可作为检验工作者的从业规范，对临床医护人员同样具有参考价值。

二、术语和定义

1. 血小板聚集：通过纤维蛋白原或血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）等的介导，血小 板与血小板之间的相互联结。

2. 血小板第一相聚集：由外源性诱导剂引起的血小板聚集反应，其发生迅速，也能迅速解聚，为可逆性聚集。

3. 血小板第二相聚集：由血小板释放的内源性诱导剂引起的血小板聚集，其发生缓慢，但不能解聚，为不可逆聚集。

4. 富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）：全血经低速离心后得到的高浓度血小板血浆。

5. 乏血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）：全血经高速离心后得到的血小板含量较低的血浆。

6. 诱导剂:能够刺激血小板活化的试剂。

三、实验室与临床交流与培训

实验室质量负责人在开展试验前，应认真学习试验的检测原理和临床应用范围，分析样本的全过程，找出影响检验结果的每个环节和要素，根据过程控制的理论，建立试验质量管理体系，并培训操作人员，经考核合格后上岗。

实验室负责人要注重与临床医生交流，研讨下文中“参考区间”“检验结果报告方式”“检验结果解 读”中的相关内容，辅助医生熟悉检测结果的临床意义，合理选择项目并准确解释结果。

实验室负责人应培训护理、护工人员下文中“患者准备”“血标本采集”“标本保存和转运”相关知识，保证分析前的质量控制。

四、患者准备

1. 采血前准备：受试者应空腹，采血前一餐宜避免进食高脂食物;采血前2h内禁饮咖啡或含咖啡因饮料，采血前30min内禁止吸烟;同时，建议患者[12-13]采血前2h内避免剧烈运动 。

2. 药物或膳食成分影响：（1）应在采血前完成由护士或患者所在科室记录受试者服用的所有药物，在解释血小板聚集结果时，临床检验实验室应考虑这些药物对血小板功能的影响[14]；（2）可能影响血小板聚集率的药物：如阿托品、氢化可的松、阿司匹林、双嘧达莫、肝素、双香豆素、普萘洛尔、呋塞米、β内酰胺类抗生素等药物[15-16]，以及丹参、红花、三七、银杏叶、水蛭类等中药制剂[17]，其他可影响血小板中成药物见表1；（3）可能影响血小板聚集率的膳食成分：包括水溶性番茄浓缩物[18-19]、可可黄烷醇[20]、维生素E、鱼油等[16]。

3. 注意事项:应注意年龄和经期、妊娠等生理因素对血小板功能的影响[21]。

表1. 影响血小板功能的中成药物

五、血标本采集

血小板实验的血标本采集应采用以下预防措施，以减少或避免血小板活化。

1. 血液标本采集：（1）血标本采集应由经验丰富的医护人员操作，肘前静脉采集，不得拍打采血部位;不宜使用止血带，如需使用止血带，在针插入血管见回血后应立即释放止血带[12]；采血过程不超过1min。（2）血标本采集应使用19~21G针头[14]。（3）血标本采集应使用塑料或硅化玻璃管，可使用 真空管或注射器[14]。

2. 血标本抗凝：（1）血标本使用105~109mmol/L枸橼酸钠缓冲液抗凝[12, 14]，使得在处理和检测期间保持pH值稳定（正常范围6.8~8.5）[12, 47]。（2）血细胞比容（hematocrit，Hct）在25%~55%时，109mmol/L枸橼酸钠与血液比例为1∶9，Hct过高或过低者应对抽血量进行调整，建议参考以下公式：抗凝剂的用量（ml）=0.185×全血量×（1-Hct）[12, 14]。

3. 血小板功能检测血样宜选择收集的第2管血，如患者本次采血只行此项检测则建议弃去第1管血，不建议采用血管通路采血以免外源肝素影响[12]。

4. 使用不同抗凝管采血时，先采集枸橼酸钠 管，然后采集EDTA或肝素管[12]。

5. 在采集血标本之后，立即将抗凝管轻轻颠倒 混匀，至少6次；不应过度混合或搅拌[12, 14]。

六、标本保存和转运

1. 血标本管应保持直立、加盖置于室温（20~25 ℃）保存，不应置于冰上、冰箱或水浴箱内[12]。

2. 血标本不应通过气动管道系统运输[12, 14]。

3. 血标本在采血后4h内完成测试[14]。

4. 实验室应拒收存在凝血、严重溶血和采集超过4h的血标本[14, 48]，并记录;如有脂血等，最终报告时应备注[12]。

七、样本制备

1. 离心机：应采用水平式低速离心机，运行稳 定无震动，制动平稳。

2. PRP制备：采用低速水平离心机在200g的相对离心力下离心10min得到PRP。建议PRP中血小板浓度至少应＞150×109/L[12, 49-50]（随检测系统的不同，离心力、离心时间的要求也可不同）。

3. PPP制备：在1500g的相对离心力下继续离心15min得到PPP，建议PPP中血小板浓度低于10×109/L（随检测系统的不同，离心力、离心时间的要求也可不同）[51]。

4. PRP和PPP的转移：取样针或移液器应在血浆高度的1/2以下位置，吸取足够本次测试所需的PRP和 PPP血浆，不要触及白膜层及红细胞。

5. PRP和PPP存放：PRP应存放在塑料或硅化的玻璃材质的样本管中。

6. 100%聚集率浊度参照物：可采用PPP或其他等效物（其吸光度应尽量接近乏血小板血浆）。

7. 样本质量：确认离心后的血浆不应有溶血、 黄疸及乳糜等浑浊物质，否则将影响检测结果。

八、检测系统

1. 检测系统：血小板聚集率检测系统是由检测 仪器、检测试剂等组成，包括仪器的各项试验参数、 试剂的浓度、原料品牌、标准操作规程、参考值范围等。检测系统一旦确立，任何环节和要素都应保持 不变，如果发生改变，应该重新对检测系统进行评 估，确立新的检测系统。

2. 试剂的使用：冻干粉试剂应使用配套的复融 液，将其充分混匀并稳定10~15min。

3. 试剂的保存：开盖复融后的试剂，建议一次性使用完，也可根据厂家说明书要求进行分装保存，但需采用带盖容器分装保存。建议2~8℃存不超过1周，-20℃以下保存不超过1个月。使用低温冻存的试剂，需在室温下充分解冻后使用，但不可反复冻融；花生四烯酸应避光保存，防止光学催化。如试剂变黄，应考虑变质的可能。

4. 样品杯及比浊反应杯：应采用透光度良好的一次性塑料或经硅化的玻璃材质的样品杯及比浊反应杯，尽量避免反复使用；比浊反应杯应采用内圆无死角的结构，防止血小板剪切激活；样品杯与比浊反应杯均为商用耗材，与检测系统配套，不应混用。

5. 搅拌子：搅拌子材料应选取合适的惰性金属，防止与样本发生反应，搅拌子的形状应为两头半圆光滑无死角的圆柱体；搅拌子的形状和搅拌条件与血小板聚集结果直接相关，是检测系统的重要组成部分。搅拌子为商用耗材，与检测系统配套，不应混用。

6. 搅拌速度：血小板聚集反应需在一定的持续搅拌下进行，因此，除了对搅拌子的形状有要求之外，还需控制搅拌子的转动速度。建议搅拌子转速控制800~1000次/min，搅拌速度过慢容易导致反应不充分甚至无聚集反应，搅拌速度过快会造成聚集的栓子不稳定，发生因外力作用而解聚的现象。同时，搅拌速度的稳定性也在一定程度上决定了检测结果的稳定性，因此，要求转动速度误差在5%以内。

7. 温度控制：仪器设备的反应检测区域能够实现恒温控制，建议温度控制在36.5~37.5℃。

8. 加样精度：由于血小板聚集试验需要严格控制样本量及试剂量，以确保最终的反应浓度，一般要求加样不精密度CV≤3%。使用全自动仪器时，应注意吸样泵的精度，以及管路密闭性；使用半自动仪器时，应注意移液器的精度和质量，同时应避免人为加样造成的误差。

9. 光学检测系统质量控制：血小板聚集率检测是以100%及0%聚集率参照物作为标准，样本中加入诱导剂后，一般取5min内的最大变化量与参照体系的比例即为该样本的最大聚集率，因此光学检测系统的性能直接决定了血小板聚集率灵敏度及精密度。建议对光学检测系统可利用聚集率检测模拟试验进行质量控制，具体操作如下：采用蒸馏水作为100%聚集率参照物，以一定浊度的液体作为0%聚集率参照物，两者之间吸光度差值与贫富血小板血浆的吸光度差值接近即可。对0%聚集率参照物的浊度液体进行比例稀释，如 3/4、1/2、1/4，这样得到的吸光度变化对应的模拟聚集率应为75%、50%、25%，进一步计算测量值与理论值之间的相对偏差，以及测量值的精密度，一般建议测 量值相对偏差应＜8%，测量值的不精密度CV≤5%。

10. 不同的检测系统的检测结果可能存在较大的差别，影响因素也较多，因此，建议不同的检测系统的性能评估、仪器校准、保养和维护应遵循说明书的规定。

九、参考区间

检验结果的参考区间是有属性的。它是依赖于该项目的检测系统内设要素和标准不同而有变化的。根据临床诊疗目的不同，需应用不同种类和浓度的诱导剂。因检测系统、诱导剂的种类及浓度不同，最大血小板聚集率的参考区间有显著差别，各实验室应根据检测体系建立本实验室的参考区间；任意条件的改变都会造成现行参考区间的不适用。

在实验条件与厂家提供的条件（仪器、耗材、诱 导剂及浓度）完全一致的情况下，实验室可参照厂家提供的参考区间，以20份正常人标本验证其有效性通过后，即可用于本实验室。

如实验室改动了任一条件，如诱导剂浓度、诱导剂生产厂家、配制方式等，需自行建立本实验室在该条件下的参考区间，具体参照《WS/T 402-2012：临床实验室检验项目参考区间的验证》[52]。

十、检验结果报告方式

检验报告内容至少（可不限于）包括：检验项目、诱导剂种类、诱导剂的终浓度、参考区间、检验 结果。如特殊病例，临床医生注明需要血小板聚集波形图时，应予提供。

十一、检验结果解读

（一）血小板聚集率减低

辅助诊断先天性及获得性血小板功能障碍；监测抗血小板功能治疗的效果;评价膳食及营养补充剂对血小板聚集功能的影响;手术患者出血风险评估。这些情况往往伴随血小板功能下降。

1. 辅助诊断先天性及获得性血小板功能障碍：先天及获得性血小板功能障碍是临床常见的出血性疾病，伴有血小板聚集功能减低，主要实验室表现为对一种或多种诱导剂诱导的血小板聚集率减低。巨大血小板症对瑞斯托霉素聚集率降低，对其他诱导剂反应正常。血小板无力症对瑞斯托霉素外所有的诱导剂均不聚集。低浓度瑞斯托霉素诱导的血小板聚集增高对2B型血管性血友病（von Willebranddisease，vWD）和血小板型vWD的诊断具有特异性。储存池病或颗粒缺失（δ颗粒缺失等）表现为二相聚集缺失甚至发生解聚（附图3）。

2. 监测抗血小板治疗的效果：抗血小板药物是一组能抑制血小板活化、聚集和阻止血小板参与血栓形成的药物，多用于心脑血管疾病、微血管病变、病理产科（先兆子痫、复发性流产等）等血栓相关性疾病的预防和治疗。通常应用LTA法动态监测评估抗血小板治疗效果，应注意不同浓度诱导剂检测结果与安全范围存在差异。

阿司匹林抑制血栓素A2合成，可选择花生四烯酸作为诱导剂。P2Y12受体拮抗剂（氯吡格雷、噻氯吡啶、普拉格雷、替格瑞洛），可选择二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）作为诱导剂。血小 板膜糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂（替罗非班、拉米非班）抑制血小板聚集最终通路，导致除瑞斯托霉素 外的诱导剂聚集率降低。丹参类、红花类、银杏叶 类、三七类等中成药也可抑制血小板聚集。

3. 评价膳食及营养补充剂对血小板聚集功能的影响：水溶性番茄浓缩物可抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集，可可黄烷醇可抑制肾上腺素诱导的血小板聚集，鱼油可抑制胶原诱导的血小板聚集。

4. 抗血小板治疗患者手术风险评估：抗血小板治疗可导致出血并发症，进行抗血小板治疗的患者 在手术前，使用LTA法监测血小板功能，防范术中和术后的出血风险。对择期手术患者，血小板功能恢复正常有助于减少手术相关的出血。急诊手术根据患者用药史选择相应处理措施[53]。

（二）血小板聚集率增高

仅有临床参考价值，多见于高凝状态和血栓性疾病，如冠心病、急性心肌梗死、人工瓣膜置换后、 经皮冠状动脉介入术后、先天性心脏病、脑梗死、深静脉血栓形成、糖尿病、胰岛素抵抗、高同型半胱氨酸血症、高β脂蛋白血症、复发性流产、先兆子痫、 抗磷脂综合征、特鲁索综合征、口服避孕药、吸烟、 缺乏运动等情况，显示对ADP、花生四烯酸、胶原、 凝血酶等诱导剂作用下的血小板聚集率增高。

血小板功能结果易受检验前、中后等多种因素 影响，建议对异常结果进行复查，不能根据1次检测结果，即行诊断。

为便于大家分析LTA法血小板聚集试验结果，附件中分别介绍了常用诱导剂的选择、LTA法血小板聚集功能检测图形及常见遗传性血小板功能障碍血小板聚集试验波形图（附件1~3）。

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执笔人：邓新立（解放军总医院第二医学中心检验科），李传保（北京医院 国家老年医学中心检验科），游云（中国中医科学院中药研究所），李祖兰（解放军战略支援部队特色医学中心研究部二室），蔡力力（解放军总医院第二医学中心检验科），关杰(北京大学第一医院检验科），王科宇（解放军总医院第二医学中心检验科），龚美亮（解放军总医院第二医 学中心检验科），丛玉隆（解放军总医院第二中心检验科）

专家组成员（以姓氏笔画为序）：阿祥仁（青海省人民医院医学检验科），曹友德（湖南省人民医院检验科），常志遂（中国中医科学院广安门医院，北京中医医学检验与输血质 控中心），陈葳（西安交通大学第一附属医院检验科），丛伟红【中国中医科学院西苑医院心血管病实验室，国家（中医）心血管病临床医学研究中心】，冯笑梅（内蒙古国际蒙医医院检验科），符生苗（海南省人民医院医学检验中心），顾国浩（苏州大学附属第一医院检验科），郭希超（浙江大学附属第一医院检验科），哈斯朝鲁（山西医科大学第一医院检验科），哈小琴（联勤保障部队第九四〇医院检验科），韩艳秋（内蒙古医科大学附属医院），侯敏（天津市胸科医院检验 科），胡晓波（上海中医药大学附属龙华医院检验科），黄之虎（广西壮族自治区民族医院检验科），江虹（四川大学华西医院实验医学科），金玲（吉林大学中日联谊医院检验科），李立新（石家庄市人民医院 ），廖璞（中国科学院大学重庆医院检验科），刘亚波（哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科)，刘鱼（中国医学科学院输血研究所输血医学实验中心），刘渊（上海复旦大学华东医院检验科），欧启水（福建医科大学附属第一医院检验科），渠巍（贵阳市妇幼保健院检验科），任伟宏（河南中医药大学第一附属医院检验科），宋鉴清（中国医科大学附属第一医院检验科），王国礼（威海市立医院检验科），王利新（宁夏医科大学总医院医学实验中心），王小中（南昌大学第二附属医院检验科），王玉明（昆明医科大学第二医院检验科），吴俊（北京积水潭医院检验科），谢风（吉林大学中日联谊医院检验科），辛晓敏（三亚哈尔滨医科大学鸿森医院检验中心），许俊堂（北京大学人民医院心内科），杨军（武汉亚洲心脏病医院检验科），袁家颖（北京大学第一医院检验科），张新（新疆生产建设兵团医院医学检验科），张洋（中国医学科学院阜外医院实验诊断中心），张真路（武汉亚洲心脏病医院检验科），赵虎（上海复旦大学华东医院检验科），郑磊（南方医科大学南方医院检验科），周洲（中国医学科学院阜外医院实验诊断中心）

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突

志谢：贺瑞坤（汤臣倍健股份有限公司），焦红涛（泰利康信科技有 限公司），谢凡（泰利康信科技有限公司），杨世平（泰利康信科技有 限公司）在共识的检测系统部分提供的技术支持。

基金项目：军委后勤保障部卫生局保健专项课题（17BJZ45）

DOI：10.3760/cma.j.cn114452-20210208-00098

附件1：诱导剂的选择

不同的诱导剂检测不同种类的血小板异常，初始检测时不必使用全部的诱导剂，可应用常规诱导剂在标准剂量下检测血小板聚集情况，有异常时再进一步检测（附表1）。一般情况下，如果低浓度的诱导剂不聚集，再进行高浓度的诱导剂检测;而对于怀疑2B型或血小板型血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）的患者在常规1.2mg/ml瑞斯托霉素聚集正常时，需进行低浓度（0.5~0.7mg/ml）瑞斯托霉素检测；如果花生四烯酸聚集降低，需采用血栓素A2类似物U46619来区分阿司匹林样缺陷还是血栓烷受体缺陷。

附表. LTA法检测血小板聚集时诱导剂及其浓度

注：TXA2为血栓烷A2，TRAP为凝血酶受体激活肽，CRP为胶原相关肽，PAR-1为蛋白酶激活受体-1

附件2：LTA法血小板聚集功能检测图形

LTA法血小板聚集功能检测图形可提供报告参数和图形参数，报告参数直接由仪器通过聚集过程中浊度信号的变化规律获得并描记，图形参数需要操作人员结合聚集波形图进行确认（附图1），具体参数意义如下：（1）最大聚集率（%）：用于判断有无聚集。测量最大聚集时距PRP基线的高度（h1）及PRP基线与PPP基线间的高度（h0），按下列公式求得血小板最大聚集率（MAR）：MAR=（h1/h0）×100。（2）二相聚集：显示不可逆性聚集（胶原、花生四烯酸、瑞斯托霉素不产生二相聚集）；如果用高浓度的诱导剂也不产生二相聚集，一般考虑血小板释放功能异常或者服用了抗血小板药物（如阿司匹林、P2Y12受体抑制剂）。（3）解聚：达到一相聚集后，未发生血小板释放反映，聚集的血小板散开。（4）形态变化：添加诱导剂后，因ADP、胶原蛋白等的产生，血小板立即产生形态变化。

注：①为最大聚集率（%），存在一相和二相聚集；②为二相聚集；③为解聚，仅存在一相聚集；④为形态变化

附图1. 血小板聚集波形图

附件3：一系列罕见血小板缺陷的血小板聚集试验示例图

注：诱导剂分别为10μmol/L ADP、2μg/ml胶原蛋白、5μmol/L肾上腺素、1.0mmol/L花生四烯酸、低剂量（0.5~0.7mg/ml）瑞斯托霉素和高剂量（1.2~1.5mg/ml）瑞斯托霉素，聚集反应监测时间为10min。相同试验条件下，不同仪器的图形差别不大，此图形适用于大部分检测仪器。