循环肿瘤细胞检测技术临床应用与恶性肿瘤精准诊疗价值

作者:吴玥 崔巍 2022-07-22
作者单位:中国医学科学院肿瘤医院检验科

崔巍,博士、研究员,博士研究生导师。现任中国医学科学院肿瘤医院检验科主任,主要专业领域为临床基础检验、血液检验和临床分子生物学检验;主要研究方向为恶性肿瘤实验室诊断。主要学术兼职:现任中华医学会检验医学分会副主任委员,中华检验医学杂志副总编辑,北京医师协会检验医师(技师)专业委员会会长,国际实验血液学学会细胞分析和流式委员会(ISLH Cellular Analysis & Flow Cytometry Committee)委员IFCC EMD临床实验室管理委员会通讯委员等职。荣获中华医学科技奖、北京市科技进步奖、中华预防医学科技奖等7项,获得专利3项、编著学术著作10余本,在GUT、Journal of Hematology & Oncology、Clinical Infection Disease等国内外期刊发表文章200余篇。


吴玥,中国医学科学院肿瘤医院检验科助理研究员,主要从事肿瘤标志物相关研究。


肿瘤的异质性是肿瘤治疗面临的重大难题,了解肿瘤的分子机制使肿瘤的诊断和治疗、靶向治疗、免疫治疗以及新治疗靶点的识别等个体化治疗变得可能,精准医疗的时代正在到来。循环肿瘤细胞分析方便、无创、可动态监测,能够在DNA、RNA、蛋白质以及单细胞水平上全面的揭示肿瘤的基因组,是反映个体和肿瘤异质性的理想活检样本。近年来循环肿瘤细胞检测发展迅速,可更好地助力精准医疗的实施。本文将针对循环肿瘤细胞检测的发展以及未来面临的机遇和挑战简要介绍如下。


一、循环肿瘤细胞基本概述


循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤或转移瘤中脱落的癌细胞,是肿瘤进展和转移的关键介质,循环肿瘤细胞有向远处扩散并形成新肿瘤的能力。相较于主要来源于死亡细胞的循环肿瘤DNA,CTC是一种活的细胞或细胞团,代表着最具攻击性、侵袭性或耐药性的细胞,包含肿瘤的基因组、转录组和蛋白组的信息,还能进一步扩大培养,提供药敏信息。CTC基因组和表型图谱的系列分析、存活CTC群体的培养可以提供与肿瘤进展与治疗相关的动态分子特征,推动检测复发、选择治疗方案以及作为药效监测标志物的探索,为肿瘤的个性化治疗和精准诊疗铺平道路。


二、循环肿瘤细胞富集技术方法


灵敏可靠的富集技术是循环肿瘤细胞检测的基础,因为在外周血中的CTC数量稀少,几乎每百万白细胞中发现一个CTC[1],因此,理想的富集技术需满足高检测率、高回收率及准确的高通量样本处理和计数能力。传统的CTC富集方法可分为两大类:基于物理性质,如大小、密度和电场的技术及基于蛋白质表达的技术。过滤法由于CTC直径与血细胞有相当大的重叠,使得回收的CTC纯度低,同时可能会漏掉部分小体积CTC,如干细胞样CTC。基于密度的梯度离心方便、省时且成本低,但会损失巨大的CTC和CTC簇,密度培养基还可能影响CTC的细胞活性,从而干扰下游分析。基于流体力学的方法有利于无标记隔离活细胞,但控制流速和电场力是关键,电场力可能影响细胞的活性和生理特性,这不利于进一步的培养和分析[2-3]。


基于蛋白质表达的技术可以根据细胞表面标志物的不同分为表达于CTC表面而不表达于白细胞的阳性富集和表达于白细胞而不表达于CTC的阴性富集。基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)的阳性富集法(CellSearch)是目前美国食品药品监督管理局批准的唯一商用试剂盒,可用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌等[4]。但由于肿瘤细胞及肿瘤患者间的异质性容易出现假阴性,尤其是在肿瘤转移过程中出现上皮间质转化的细胞无法检出,因此使用单一细胞表面标志物可降低检测的灵敏度,需要细胞表面上皮和间充质标志物的混合物用于广谱富集,如N-钙黏蛋白、波形蛋白等。同时将几种富集方法结合也可显著提高富集的阳性率。Chu等[5]用3D打印技术将基于免疫亲和的微流控细胞捕获和商用膜过滤器结合,用于直接从全血中富集CTC,这有助于在膜过滤器上直接提取芯片外的活性CTC,用于下游分析。富集细胞的免疫荧光成像结果显示前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞的回收率为90%。因此,多种标志物联合富集以及多种富集方法联合使用,取长补短是未来发展的趋势。


三、高度特异性的CTC鉴定技术方法


CTC富集后,由于肿瘤细胞与白细胞部分特征重合,需要一种可靠的鉴定方法来确认富集后的细胞确实是肿瘤细胞。为了提高CTC检测的特异性,在随后的鉴定步骤中需选择癌细胞的一些特殊特征。端粒酶活性的高表达已用作CTC识别过程中的一个重要生物标志物,但仍受到CTC表达hTERT活性的差异和部分白细胞表达hTERT的影响,后者可通过检测CD45抗体去除[2, 6]。肿瘤细胞生长与线粒体代谢密切相关,Situ等[7]通过设计AIE生物探针标记线粒体检测细胞荧光,可有效区分肿瘤细胞,对细胞活力和完整性影响很小,但该方法对预富集平台要求高,需尽可能保持细胞的完整性,以避免探针非特异性扩散到膜受损的白细胞中。活性氧(ROS)通常在癌细胞的各种细胞器中过度表达,基于2种癌症标记物(ROS和NQO1酶)的组合,可有效将肿瘤组织与正常组织、炎症组织区分开来,但该方法对细胞活力和完整性的影响尚无足够证据[8- 9]。另外,细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的提高和pH值的降低(酸性细胞外宏观环境)也可作为CTC的生物标志物[10]。


除识别肿瘤细胞外,还需要进一步对来源于不同肿瘤类型的细胞进行分型。在一种特定的癌细胞上使用2种及以上针对抗原的特异性配体,以提高鉴定方法的特异性,如前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)、乳腺癌的HER2蛋白和癌症睾丸抗原等肿瘤特异性标志物。Xu等[11]报道了表达干细胞因子SALL4的CTC对诊断妊娠滋养细胞疾病的辅助作用,Liu等[12]通过靶向去甲肾上腺素转运体(NET)和生长抑素受体SSTR2,制造了一种新的双靶向纳米探针,用于特异性识别嗜铬细胞瘤(PCCs)。此外,还有研究利用癌细胞的同源靶向性,用于体内给药,未来有望利用荧光探针识别目标肿瘤细胞的细胞膜,用于识别肿瘤细胞的亚型[13]。


免疫荧光染色是区分肿瘤细胞和血细胞的“金标准”,但由于固定和渗透步骤会影响细胞活力和完整性,从而影响下游分析[14]。实时荧光定量逆转录PCR法、DNA测序(DNA-seq)、RNA测序(RNA-seq)等可通过检测肿瘤特异的分子表达来鉴定CTC,但仍面临着无法分析CTC的形态、步骤繁琐、难以标准化及价格昂贵等问题。串联逻辑纳米平台是识别各种类型癌细胞的典型平台,这种纳米平台可评估多种生物标志物的存在,并用一个独特的标签标记靶细胞,以便一步识别细胞[15]。机器学习算法在语音识别和分类以及图像处理任务应用中取得了显著的成果。机器学习提供了一个自动分类系统,根据细胞的固有特征自动完成荧光图像中CTC的分类和计数,并将其与临床结果联系起来,随着算法的优化可进一步缩短处理时间,提升通量[16]。


四、异质性检测面临的挑战与机遇


异质性是恶性肿瘤的一个特征,肿瘤异质性可使肿瘤细胞适应肿瘤微环境的变化,促进肿瘤的抵抗和进展。肿瘤之间的异质性是指不同患者中相同来源的肿瘤之间的差异。这些肿瘤亚群具有特殊的分子标志物和不同的生物学行为,从而对临床预后产生不同的影响[20]。肿瘤内异质性是指肿瘤内不同细胞间的基因组、体细胞突变和表观遗传修饰等表型差异,随着细胞生长、传代,疾病从局部进展到转移,从不同组织的原发肿瘤到转移灶,细胞亚群分子特征均可发生变化。基于此,传统的组织活检无法满足多点采样的需求,对CTC亚群进行多次动态取样,分析亚群分子特征,可最大程度揭示肿瘤异质性全貌和动态变化,在肿瘤的早期检测、预后预测、治疗及耐药反应等方面意义重大[17]。


由于CTC在肿瘤早期检出率相对较低,在早期检测中的应用需要采集更多的血液量和更灵敏的富集方法。也有研究对早期乳腺癌患者富集的CTC进行分子分型,评估上皮细胞、间充质细胞和癌症干细胞标志物的表达,结果表明具有上皮、上皮和间充质或间充质标志物的CTC检测率相似,但只有间充质CTC与更高的死亡风险显著相关[18]。因此,对CTC亚群进行分型有助于风险分层及预后分析。另外,免疫检查点抑制剂(ICIs)在晚期癌症治疗中的出现和普及使得程序性死亡配体1(PD-L1)成为一种常用的标志物。研究结果表明,PD-L1表达会随着时间的推移而变化,并且在个体之间以及个体内部均具有高度的异质性[19],PD-L1阳性CTC和PD-L1免疫治疗患者较长的无进展生存期相关,实时监测PD-L1阳性CTC可作为患者对免疫治疗耐药的早期指标[20]。因此,识别PD-L1表达的CTC可指导治疗决策、选择患者以及更好地理解和克服耐药机制。癌基因中产生耐药性的突变已被确定为耐药性的主要来源,可以从富集的CTC中进行研究,以监测治疗压力下的肿瘤演变。在转移性去势抵抗性前列腺癌中,检测CTC上核定位雄激素受体剪接变体7(AR-7)的表达可用于评估雄激素阻断疗法的耐药性[21-22],以便筛选出更适合的疗法。黑色素瘤靶向治疗后复发的患者CTC显示出分化程度更低的表型[23]。晚期雌激素受体(ER)阳性和HER2阴性乳腺癌患者,在多个疗程化疗后CTC可以转化为HER2阳性表型,对HER2+和HER2-的CTC进行培养时分析,这两者表型可互相转换[24]。因此,单细胞分辨率下的CTC分子水平上的动态探索可提示耐药相关信息,为个体化治疗方案的选择带来契机。


CTCs的功能性研究可能为耐药机制提供进一步线索。目前,CTC培养已从2D培养模型、3D肿瘤球体培养到CTC衍生外植体(CDx),即小鼠体内异种移植发展,可更好地模拟体内肿瘤细胞缺氧、肿瘤微环境以及细胞间相互作用。Hodgkinson等[25]首次证明,从小细胞肺癌(SCLC)患者的血液中富集的CTC在免疫功能低下的小鼠中具有致瘤性,CDx的分子图谱与原发肿瘤非常相似。自此许多研究成功地在黑色素瘤[26]和乳腺癌肝转移[27]、肺癌[28]、前列腺癌[29]等中建立起了CDx模型。CDx模型也用于检测耐药性变化、识别新的标志物以及测试新的治疗方案[30]。Drapkin等[31]提出,可在患者疾病进展的不同时间点建立一系列CDx模型,以研究耐药性演变的机制,从而丰富我们对肿瘤异质性以及对患者特异性转移的理解。但CTC衍生细胞系或CDx需要较多数量的CTC,在肿瘤早期可能难以富集到,同时耗时长,这使得其尚不适合临床使用。随着体内CTC捕获设备的发展,可能会为这一限制提供未来的解决方案,同时体内免疫细胞间相互作用的缺乏也可能限制其进一步应用,包含多种细胞类型和结构的类器官模型是未来发展的方向。


随着新型分子靶点的出现和对耐药机制的进一步了解,精准肿瘤学领域取得了巨大进展,精准治疗是根据肿瘤的个体特征对医疗方案进行调整,CTC检测技术极大地推动了监测癌症进展并进行个体化治疗的临床可行性。为了使CTC检测适应临床需求,可靠、敏感和特异的分离鉴定方法必须得到大规模临床试验的支持,以验证其潜力。目前,CTC的传播规律尚不清楚,也无法确定合适的检测时间。不同的时间和不同的治疗方法将导致CTC的不同表型、基因组和功能特征,从而影响其临床应用,这也对不同肿瘤的标准化检测、血液采样时间点的规范化、标准化的数据处理与其他临床检测项目的组合等提出了较高的要求。总之,随着单细胞测序技术、体外培养、机器学习等技术的发展,CTC将能更好地助力精准医学。


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