血管内皮祖细胞检测在恶性肿瘤诊疗中的潜在价值
哈小琴，主任医师，博士研究生导师。现任联勤保障部队第九四〇医院检验科主任。兼任中国合格评定国家认可委评审员、中国老年医学学会检验医学分会副会长。主要从事高原胃肠应激损伤基因药物研发、感染性疾病诊断试剂研究、肿瘤早期诊断标志物研究、高原创伤修复药物药效及机制研究、慢性代谢性疾病肠道微生态研究及干细胞基础与应用研究。承担国家、省部级科研项目30余项，申请专利12项，发表论文200余篇，获得军队、省级科技进步二等奖5项。
王晓辉，联勤保障部队第九四〇医院检验科副主任医师，空军军医大学细胞生物学硕士研究生毕业。甘肃省医学会遗传学分会委员，甘肃省中医药免疫交叉学科专业委员会委员，甘肃省老年医学会检验分会委员。
血管内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一种主要存在于骨髓可分化为血管内皮细胞的前体细胞。正常情况下，外周血中只存在极少数的EPCs，但肿瘤发生与生长需要大量营养物质和氧气供应。当肿瘤体积急速增大时，肿瘤中心血供不足会引起坏死并启动肿瘤血管形成途径，大量EPCs从骨髓动员进入循环系统，在各种细胞因子作用下趋向肿瘤组织，促进肿瘤血管新生，参与肿瘤的生长、侵袭和转移[1]。EPCs参与肿瘤发生且具有基因治疗导向载体的潜力，其可能为今后肿瘤的诊断、治疗及预后判断提供一种新的方法和研究思路。现将EPCs与肿瘤的关系介绍如下。
一、EPCs生理机制与生物学特性
1997年，Asahara等[2]首次利用包被有CD34+抗体的磁珠从人外周血中分离出一种可以迁移到缺血部位并分化为内皮细胞的骨髓源性造血祖细胞，故将其命名为EPCs。早期认为EPCs只在骨髓中大量聚集，但之后的研究发现EPCs不仅存在于骨髓中，还存在于脐血、成人外周血以及脂肪组织中，其中脐血中EPCs数量约为外周血的10倍[3]。EPCs是一种具有游走特性、能进一步增殖和分化的幼稚内皮细胞，一般生理状态下，EPCs对组织缺血和血管损伤产生应答并参与血管修复和重构[4]。
在胚胎发育过程中，EPCs和造血干细胞来源于共同的前体细胞，故而EPCs与造血干细胞之间有许多共同的细胞标志物，如分化抗原家族34（clusters of differentiation，CD34）、CD14、血管生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEFGR2）、c-Kit、免疫球蛋白样和EGF样结构域蛋白1的酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase With Immunoglobulin Like And EGF Like Domains Protein 1，Tie-1）和Tie-2等，同时也有学者发现了表明EPCs特异性的抗原分子，如CD133、CD146、CD45、CD31和CD144等。随着荧光激活细胞分选技术的进步，基于细胞不同表面标志物进行细胞筛选EPCs成为了主流方法。有学者报道，EPCs培养时有2类种群，一类可分化为巨噬细胞，称之为早期EPCs，且CD3+/CD31+/CXCR4+为这类细胞的核心标记；而另一类是具有高增殖能力的成熟内皮细胞，称之为晚期EPCs，其明确的表型为CD31+/CD144+/CD146+/VEGFR2+，同时CD45-/CD14-[5]。
在组织损伤、缺血和缺氧条件下，EPCs可从骨髓进入外周血，通过激活细胞内不同信号通路调控其向血管内皮细胞的分化。首先是趋化因子基质细胞衍生因子1（chemokine stromal cell derived factor 1，SDF-1），研究发现SDF-1/CXCR4可介导c-Kit的EPCs与外周血管之间的黏附[6]，这一作用通过PI3K/AKT激活下游内皮细胞一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）磷酸化和激活，eNOS可上调骨髓NO水平，NO活化基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9），MMP-9激活可降解细胞外基质，将跨模型Kit配体转变为可溶性Kit配体，并促进c-Kit+的EPCs从骨髓释放到外周血中，完成归巢和黏附。其次是血管生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促进EPCs的动员、迁移、增殖和分化，从而促进血管形成，其相关机制得益于VEGF可通过与EPCs表面的特异性受体VEGFR2结合并启动MAPK/ERK信号通路，研究认为MAPK/ERK信号通路的激活，将诱导形成动脉前体细胞向动脉特异性血管内皮分化的早期标志物[7]。最后是红细胞生成素（EPO），研究发现其具有促进成熟内皮细胞增殖和分化的作用，EPO通过与其红细胞生成素受体结合启动细胞信号级联，并为RAS/MAPK通路提供结合位点，随后MAPK进入细胞核促进靶基因的表达，发挥促进EPCs增殖和分化的作用[6]。
二、EPCs与肿瘤发生的关系
微环境中有多种活性物质对EPCs增殖及向血管内皮分化存在影响，其中以肿瘤微环境最为典型。肿瘤微环境决定血管生成开关的多种细胞成分，包括EPCs、肿瘤相关的巨噬细胞和肥大细胞等，它们相互作用促进肿瘤血管的新生[8]。除此之外，肿瘤复杂的微环境也将促进血管生成过程，如低氧、葡萄糖缺乏和活性氧物质等环境的存在将促进多种促血管因子的表达，如VEGF、SDF-1、单核细胞趋化蛋白-1和EPO等[9]，尤其是肿瘤缺氧的微环境是促进血管生成最主要的刺激因素之一。组织缺氧致使血管新生的具体途径主要有两种，第一种途径是缺氧刺激肿瘤及机体组织分泌缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表达，从而集合于VEGF mRNA和SDF-1a mRNA的启动子上，致使VEGF和SDF-1a等血管生长因子浓度提高，并通过激活PI3K/AKT/eNOS促进EPCs从骨髓中动员并促进EPCs的增殖和分化，易于血管生成过程和肿瘤转移[10]；第二种是SDF-1/CXCR4轴途径SDF-1及其受体CXC4在该种途径中发挥显著作用,有研究结果证实，肿瘤周围基质分泌的SDF-1可以促进骨髓来源的CXCR4细胞被招募到肿瘤组织中，从而促进肿瘤血管新生，通过阻断SDF-1/CXCR4轴可以减少内皮祖细胞在肿瘤组织中的富集，以此起到抑制血管新生及减缓肿瘤进展的作用[11]。近期的研究发现，阻断CXCR4将阻止EPCs的归巢，但局部注射SDF-1到靶器官将增加EPCs的归巢；同理，当SDF-1缺乏时，VEGF也不能增强骨髓源性细胞的募集[12]。
近年来的研究结果表明，Id蛋白家族1-4（Id-protein family 1-4，Id1-4）与EPCs的关系非常密切，当骨髓丢失Id1时导致外周血中的EPCs完全丢失，从而导致肿瘤新生血管生成被阻止，延缓肿瘤生长[13]。Id1诱导EPCs的动员和募集主要通过PI3K/Akt信号通路，并且与整连蛋白α4的活化相关。也有学者指出卵巢癌部位EPCs的迁移和募集是通过PI3K/Akt/Id1/整连蛋白α4信号通路实现的，此通路与卵巢癌外周血中EPCs水平升高有关，EPCs通过PI3K/Akt信号通路产生高水平Id1来诱导血管发生[14]。
Hilbe等[15]检测63例非小细胞肺癌标本，并发现其中43例患者肿瘤组织中存在CD133表达阳性细胞，肿瘤微血管密度增加，且在毛细血管中可检测到CD133细胞，因此认为在肿瘤生长过程中有EPCs趋化进入肿瘤组织并参与肿瘤血管的形成。张军霞等[16]将脐血EPCs经静脉接种到胶质瘤的重症联创性免疫缺陷鼠外周血中，移植后7～14ｄ，胶质瘤内EPCs数量明显高于其它组织器官。Ishii等[17]实验结果显示，多种肿瘤细胞分别种植在重症联创性免疫缺陷鼠皮下、腹膜、肝脏、脾脏和肺等多组织器官，随着瘤体的发展，这些瘤体血管中均可找到EPCs。Rafii等[18]研究结果显示，EPCs对肿瘤组织内血管形成的参与度高于一般的肉芽组织和生长因子的血管新生，普通组织的新生血管内EPCs占5%～25%，但肿瘤组织内可高达35%～45%。
以上的研究结果表明，EPCs在多种肿瘤组织中具有一定的归巢特异性，并能够整合到新生肿瘤血管中，参与肿瘤血管新生的过程。
三、EPCs与肿瘤的诊断
肿瘤的生物标志物一般是指特征性存在于肿瘤细胞，或由肿瘤细胞所特异性产生，亦或是宿主免疫系统对肿瘤反应后特异性产生的、可以反映肿瘤存在和生长情况的一类生物标志物，如与肿瘤发生及存在关系密切的蛋白和核酸分子等。目前，应用于临床工作的肿瘤标志物较少，且部分肿瘤缺乏有意义的肿瘤标志物，肿瘤的诊断仍依靠有创的病理检查，因此研究新的肿瘤标志物有利于帮助临床工作的开展和减轻患者检查的痛苦。目前有学者发现肾细胞癌Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血循环EPCs水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，同时显示病灶大小与外周血循环EPCs的水平呈正相关。也有学者发现，非霍奇金淋巴瘤Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血循环EPCs水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者[19]。Kuo等[20]发现，乳腺癌化疗患者外周血中循环EPCs呈现先减少后增加的趋势，这说明EPCs可作为肿瘤化疗中血管发生的替代标志物。以上学者的研究结果均表明，EPCs可能是肿瘤的潜在生物标志物，EPCs有望成为肿瘤的预测因子或是肿瘤治疗的评估指标。
肿瘤的预后与肿瘤病理类型、肿瘤是否进展和肿瘤是否转移等因素密切相关。其中血管生成是肿瘤进展的重要过程，而EPCs正是参与血管生成的关键细胞，因此EPCs可作为肿瘤预后的预测因子。也有学者发现晚期且不能手术治疗的肝癌患者体内循环EPCs水平显著高于可手术的肝癌和肝硬化患者，这一结果提示循环EPCs可能用于肝癌患者的预后判断[21]。还有学者发现卵巢癌患者外周血循环EPCs数量的多少与癌症的分化程度关系密切，Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血循环EPCs显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者[22]；在肿瘤切除后，残余瘤的大小与EPCs数量也密切相关；高水平的EPCs与患者总生存时间密切相关。在非小细胞肺癌患者中，外周血循环EPCs处于较高水平时反映患者的预后较差。文献报道，肿瘤患者外周血EPCs增多与肿瘤分期和肿瘤病灶大小呈正相关，且与患者的生存率呈负相关[23-24]。
EPCs不仅能结合流式细胞术用于血液学检查，同时也能应用于影像学检查中。既往研究结果表明，EPCs在肿瘤血管生成和血管内膜损伤修复中发挥着重要作用，特异性标记EPCs有助于发现肿瘤早期病灶和早期转移病灶，同时也有助于研究肿瘤血管发生机制及肿瘤的转移机制[8]。目前对于EPCs的标记方法主要为将氧化铁颗粒和转铁蛋白共价结合后与EPCs共同培养，其机制主要为EPCs表面转铁蛋白膜蛋白受体与氧化铁颗粒-转铁蛋白复合物结合，结合后EPCs膜内陷形成内饮泡将复合物转运至胞质中，以此完成对EPCs的标记[13]。通过该标记方法，有学者[25]在2005年成功验证了MRI可以示踪由铁-PLL标记的EPCs，并证实了EPCs存在于肿瘤新生血管中。也有学者以此方法标记EPCs，并通过MRI示踪后发现标记的EPCs在肿瘤增殖中信号强度的改变。这些研究结果表明，影像学示踪标记的EPCs可能成为检测肿瘤的生成、生长和转移动态过程的良好方法。
四、EPCs与肿瘤的治疗
Davidoff等[26]发现，用编码血管新生抑制子（可溶性的、缩短了的VEGFR2）的基因转导EPCs，使血管抑制剂在体内持续表达，它与对照组相比肿瘤生长明显受到抑制。EPCs在迁移及归巢至肿瘤组织的过程中需多种细胞因子参与，如VEGF和PDGF等。因此，针对这些细胞因子或其相应受体进行干预，也能抑制肿瘤血管的生长。在一项研究中，用硼中子俘获疗法，以肿瘤血管为靶点治疗4T1小鼠乳腺癌，将异基双功能试剂结合至VEGF的巯基上Near-IR荧光显像观察到VEGF-BD/Cy5蓄积在血管发生最活跃的肿瘤边缘部位，但在用结合VEGF的毒素融合蛋白预处理的乳腺癌小鼠中VEGF-BD/Cy5的蓄积减少了。Stoll等[27]通过建立一个数学模型，结合相关的数学原理观察EPCs对早期肿瘤生长的作用，发现接近肿瘤周边部位新血管形成活性最高、血管密度也最高，EPCs对肿瘤血管形成所起的作用主要由其在肿瘤中的位置所决定，而不是增殖能力。通过比较总体新血管形成活性后发现，血管密度依赖于新血管形成刺激因素和抑制因素之间的平衡。
在过去几年的临床试验中，基因治疗的效果不尽如人意，其中不良反应成为人们关注的主要问题。然而EPCs作为载体，不仅无病毒型载体潜在的致癌性和自身免疫原性、无排斥反应、靶向性高及系统毒性低[28]。Hamanishi等[29, 30]通过逆转录病毒将小鼠CC趋化因子配基19 ( CC chemokine ligand 19，CCL19) 基因导入胚胎EPCs，此基因表达后可产生一种淋巴细胞迁移趋化因子。在B6C3F1型小鼠皮下接种小鼠卵巢癌HM-1型细胞，配合小鼠体内注入导入CCL19基因的胚胎EPCs，表现出免疫活性和肿瘤抑制效应。与对照组相比，胚胎EPCCCL19组荷瘤小鼠体内肿瘤组织具有更多的CD8+淋巴细胞，显示出了肿瘤抑制效应。Zhang等[30]将胸苷激酶基因修饰的EPCs注入带有神经胶质瘤的裸鼠体内，配合更昔洛韦治疗后，通过细胞凋亡和微血管密度的分析来评估其抗肿瘤效应，结果显示，配合更昔洛韦治疗后，胸苷激酶基因修饰的EPCs对神经胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞显示出潜在的旁观者效应，通过多次静脉注入胸苷激酶基因修饰的EPCs，可抑制血管生成而产生抗肿瘤效应。Varma等[31]在人神经胶质瘤小鼠模型内，利用EPCs作为载体与肿瘤部位基因表达人钠碘同向转运体，并通过单光子发射计算机断层成像术检测到EPCs的迁移及人钠碘同向转运体基因的表达，这表明，EPCs能够作为基因载体对神经胶质瘤进行基因治疗。抗肿瘤治疗的细胞载体骨髓来源的EPCs能归巢到肿瘤血管的特性为抗肿瘤治疗提供了新的途径，因此有研究人员利用从体内分离得到的EPCs作为细胞载体来负载自杀基因、毒素或抗血管药物。Arafat等[32]首次提出了利用基因修饰细胞合并内皮系细胞诱导产生的旁观者效应杀伤肿瘤细胞。他们用非复制性单纯疱疹病毒载体TOZ.1转导人外周血来源的CD34+EPCs，然后，分别以不同比例与非人合胞体病毒转染的细胞（人卵巢癌细胞系细胞SKOV3.ipl和人脐带血内皮细胞HUVEC）混合注入三维96孔板中，24h后，一半标本用9-鸟嘌呤处理，另一半不作处理，分别移植到裸鼠体内。结果显示，TOZ.1转导的人CD34+EPCs引发了细胞毒素旁观效应，经GCV处理的裸鼠体内无卵巢癌的发生。Ferrari等[33]在SCID鼠胶质瘤模型中HSV-tk基因经逆转录病毒转导入EPCs经尾静脉注入动物模型中，可明显抑制肿瘤生长和增加肿瘤坏死，证明EPCs介导的靶向血管生成治疗胶质瘤的可行性。
五、展望
多种来源的EPCs参与肿瘤的发生、发展和转移作用。随着EPCs参与肿瘤作用机制的进一步阐明，相信EPCs会成为肿瘤分子诊断和基因治疗的一个有潜力的新靶点，为临床诊断和治疗肿瘤提供了一条全新的途径，所以，深入研究EPCs与肿瘤的关系意义重大。
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