质谱技术在恶性肿瘤分子标志物检测中的应用与临床诊疗前景

张超，美康生物科技股份有限公司质谱运营总监。毕业于华中科技大学同济医学院临床医学专业，学士学位，从医4年后就职强生、拜耳、诺华等医药企业，主要从事接触质谱检测方法的研究。

张腾练，宁波美康盛德医学检验所有限公司生物工程工程师，毕业至今从事临床医学质谱检验行业9年。

肿瘤是一种伴随DNA、RNA、蛋白质及代谢物等分子标志物异常表达的疾病。随着肿瘤治疗精准化时代的来临，对肿瘤分子标志物的精准检测变得至关重要。质谱作为一种功能强大的分子检测技术，随着该技术的日趋成熟，目前已实现对一些肿瘤小分子标志物的精准检测，这展现了质谱技术在肿瘤诊断、治疗过程中的广泛应用前景。本文就质谱技术目前在肿瘤DNA、RNA、蛋白质及代谢物等分子标志物应用进行论述，并对质谱技术在未来肿瘤诊疗应用前景做出展望。

现研究结果表明，肿瘤的分子水平改变早于细胞和亚细胞层次的改变，而目前分子诊断主要是应用分子生物学技术进行。因为肿瘤和个体之间在DNA、RNA以及蛋白、代谢物之间的表达存在一定差异，所以，肿瘤分子诊断期间需要对相关信号通路进行整理。质谱技术在生物医药行业中的应用十分普遍，液相色谱-串联质谱能定量分析小分子物质，气相色谱-串联质谱能进行挥发性化合物的检测等，具备明显的综合性特征，在分子诊断中具有重要作用。

一、肿瘤蛋白类分子检测

通过对患者和健康对照或不同疾病阶段水平的定量分析，筛选出具有显著差异表达的蛋白质作为潜在的生物标志物的候选物，质谱技术可对生物标本中的蛋白质多肽进行定性和定量分析，也能分析蛋白质的结合位点，如乙酰化、甲基化、泛素化和蛋白水解等，能全方位的掌握疾病的发生变化过程和治疗疗效情况。应用同位素标记蛋白质组学技术（iTRAQ）定量蛋白质表达的是较为准确的方法之一，然后进行液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。有研究使用iTRAQ结合2D LC-MS/MS两次鉴定了534种蛋白质，发现与健康对照组相比，非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者的S100A8和LRG1蛋白升高，S100A8、LRG1以及S100A8和LRG1组合的ROC曲线下面积分别为0.873、0.898和0.970，提出血清S100A8 和LRG1蛋白是小儿NHL潜在的生物标志物，有助于NHL病的诊断[1]。另有研究发现，使用一级质谱对健康人、肿瘤晚期患者的血浆中酶解后肽段进行检测，发现大约641个肽段为差异性标志物，后期再进行二级质谱分析，通过二维色谱、选择反应监测模式的评估，发现存在2个肽链。健康人血浆无表达，其结果说明2个肽链和卵巢癌诊断特异性标志物有很大关系。还有研究将质谱技术作为基础，对乳腺癌患者、健康人的血浆胞外囊泡中的磷酸化蛋白进行检测，发现有144个磷酸化蛋白在乳腺癌患者中表达显著增加，再利用质谱平行反应监测模式进行标志物的验证，发现血浆胞外囊泡中磷酸化蛋白为肿瘤监测中的主要标志物[2]。另有研究运用LC-MS/MS技术对早期胃肠道癌症痕量福尔马林固定石蜡包埋的样本（FFPE）的综合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学进行分析，探索了早期胃肠道癌症的潜在生物标志物，鉴定了约6000种蛋白质和＞10000种的磷酸盐，揭示了肿瘤组织蛋白质组学的特征不同[3]。另有研究使用二维液相色谱-质谱（2D LC-MS/MS）检测到622种表达具有统计学差异的不同蛋白质，发现RAB14和RCN3蛋白可能是宫颈癌（CC）治疗中的潜在生物标志物和治疗靶点[4]。

质谱、流式细胞技术形成的质谱流式细胞仪被广泛应用，该仪器是利用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对单细胞进行多参数检测的流式技术，质谱原理实现3个细胞各个参数的检测，其功能不仅包括传统流式细胞仪高速分析的特征，也能发挥较强的分辨能力，实现标志物表达丰度的检测，以获得更精准的细胞分型和高通量数据。目前质谱流式细胞技术在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，经不同标志物标记组合的设定，能够对免疫应答药物治疗的肿瘤患者的外周血细胞分子特征进行检测，以更好的选择和免疫治疗药物治疗效果有关的细胞亚群，促进对临床生物标志物的详细分析，为临床用药提供重要指导。相关研究发现，基线血中的高比例记忆T细胞是预测对抗CTLA-4药物治疗晚期黑色素瘤患者治疗效果的潜在标志物，还有研究显示，黑色素瘤患者治疗前期血中经典型单核比例与抗PD-1药物治疗后的进展生存期与总生存期没有关系[5]。

二、肿瘤相关代谢产物的检测

在代谢组学研究中，经常将色谱和质谱技术联合使用，可提高分离能力和灵敏度。肿瘤是一种代谢性疾病，代谢变化发生在肿瘤细胞和正常细胞之间，表现为增殖、侵袭、转移等特点。所以，使用生物质谱、代谢组学方法分析患者的代谢水平，不仅能进行肿瘤生物标志物的分析，也能为肿瘤诊断、治疗提供重要指导，如使用UPLC-QTOF MS与GC-TOF MS技术对乳头状甲状腺癌患者的肿瘤组织和瘤旁组织代谢物进行检测时，发现肿瘤的代谢物与氨基酸代谢、一碳代谢、色氨酸代谢有关，特异性差异代谢物PTC中嘌呤、嘧啶代谢增加，BTA中脂肪酸、胆汁酸增加。使用UPLC-QTOF质谱技术对肺癌患者尿中小分子代谢物进行测定时可发现非小细胞肺癌组织中肌酸核苷、N-乙酰神经氨酸逐渐增加，影响患者的预后。基于LC-MS/MS技术的氨基酸代谢组学在结直肠癌的早期预警、诊断、疗效预测和评估中具有价值[6]。有研究创新运用一种纳米封闭液相纳米萃取（NLPNE）结合纤维内衍生化（IFD）的NLPNE-IFD LC-MS/MS方法，分析血浆中70种含氨基分析物，包括胺、核苷及其代谢物，以确定肺癌血浆中的多代谢物指数，然后通过二元逻辑回归分析建立肺癌诊断模型，为临床肺癌快速筛查提供参考[7]。因此这些研究探索的肿瘤新型标志物对早期发现肺癌和判断预后可能有重要意义[8]。

三、肿瘤基因检测

基因检测的方法很多，但这些技术使用期间耗时、耗力，成本也较高，还需要研发新技术。核酸质谱技术是将MALDI-TOF-MS作为基础，涵盖了PCR技术的灵敏度、芯片技术的高通量和质谱技术的高精确特点。目前，核酸质谱主要应用在单核苷酸多态性、基因融合、DNA甲基化以及高通量检测，如使用RT-PCR和质谱技术对非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况进行检测时发现，两者检测结果一致，故临床应用质谱技术可对患者的基因突变状态进行快速检测，且该方法的成本低，具有高通量、高灵敏度和全自动化特点，未来将成为临床实验室主要研究的设备[5]。

四、液相色谱-串联质谱的应用

液相色谱-串联质谱在我国还处于起步阶段，但因其具有灵敏度和特异度高、检测时间短、可以实现多重检测、适用范围广的特点，已成为临床检验工作中重要的前沿检验技术。液相色谱-串联质谱已成为蛋白质组学中的主要分析方法，因其具有高灵敏度、高通量、高稳定性等特点，使得目前在蛋白质、激素和胆汁酸等物质定量比传统的方法更有优势，目前已广泛应用到临床的疾病诊断中[10]。如有研究采用LC-MS/MS技术对肺炎、肺癌和健康人群的进行胆汁酸谱检测，同时检测了常见的肿瘤标志物（CEA和CYFRA21-1），并建立肺癌诊断模型，发现脱氧胆酸（DCA）鉴别诊断肺炎与肺癌的价值最高，这说明胆汁酸谱的变化与肺部疾病的发生有一定关系，而胆汁酸谱有成为肺癌诊断标志物的潜能[11]。使用液相色谱-串联质谱进行儿茶酚胺及其代谢物5项测定，采用内标标准曲线法进行定量，可应用于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PPGL）的辅助诊断和预后评估[12]。液相色谱-串联质谱能实现小分子激素的准确定量。充分利用质谱技术的高通量特点，结合大数据技术的综合分析能力，必将大幅提升生物标志物在肿瘤诊治中的灵敏度和特异性。

五、展望

随着精准医学水平的提升，医学研究工作中单因素模式逐渐转化为多因素系统模式，且各个组学技术也广泛应用于临床。它与传统的抗体试剂技术相比，基于质谱的靶向蛋白质组学技术已成为发现和验证蛋白质、代谢产物、核酸等生物标志物的强大分析工具。目前，质谱技术的高通量、高灵敏度、准确定量的优势可实现同时检测不同理化性质的化合物，对生物样品的检测限制性、检测周期也会不断缩短。随着质谱技术的广泛应用，目前已发现数量庞大的肿瘤标志物，这些候选的肿瘤生物标志物的临床前筛选、验证、结果分析和临床应用，也面临着巨大的挑战。相信随着新技术的发展，基于质谱技术检测的新兴肿瘤生物标志物将越来越多的应用于临床，为我国肿瘤早期诊断和提高生存率提供理论基础。

参考文献

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