循环异常细胞检测对肺小实性结节的诊断效能

叶莘，就读美国伊利诺伊大学香槟分校生物化学专业，博士。师从膜蛋白领域权威 Stephen G. Sligar教授，专注于利用纳米磷脂微球 (Nanodisc) 技术研究膜蛋白结构及功能，研究课题包括重要人体药物代谢酶P450在细胞膜微环境结构变化以及后细胞膜整合素 (Integrin) 的激活机制。博士期间的研发成果近期在美已授权企业进行肿瘤药物靶点筛选工作，实现商业化。后加入美国Cynvenio Biosystems研发部及工程部担任应用科学家，主导多个研发项目，包括微流控芯片表面分子修饰，液态活检自动化优化，液态活检下游图像及分子分析开发等，拥有生产工艺设计和研发、分析平台建立，质量标准认定丰富经验。加入圣美生物先后担任项目经理、产品开发总监、总经理助理，参与了LiquidBiopsy液态活检肿瘤诊断平台的研发和产业化，多项产品已完成开发并获得中国及欧盟医疗器械注册备案。此外，承担多项省市级科研项目，科研成果已发表多篇国内外学术论文及申请10余项国内外专利。

符羽，澳门科技大学，中药质量研究国家重点实验室，硕士研究生学历。研究方向为以LC-MS对中药或生物样品，如血清，血浆，尿液等进行小分子检测与分析，先后发表SCI高分文章4篇。

【摘要】目的 肺癌是我国高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，患者的生存时间与其临床诊断发现的早晚密切相关，Ⅰ期肺癌及时被发现并治疗，可显著提高患者10年生存率。采用低剂量螺旋CT（Low-Dose computed tomography，LDCT）进行筛查可降低20%肺癌患者的病死率。但该方法假阳性高，如何有效的辨别大量结节的良恶性成为了临床医生的难点。恶性实性肺结节分化程度低，术后复发风险高，如果能在早期将其诊断，可降低不良预后的概率。方法 本研究应用由美国MD Anderson癌症中心研发的循环异常细胞（Circulating genetically Abnormal Cell，CAC），通过荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）技术对肺癌患者中常见的染色体异常细胞进行鉴定，实现肺结节良恶性辅助诊断。结果 应用该技术对≤10 mm的实性肺结节诊断的敏感度、特异度和准确度分别为76.92%、71.43%和75.00%，优于肿瘤标志物检测结果。结论 CAC技术作为安全、无创、有效的辅助诊断工具，有助于肺结节，尤其是≤10mm实性肺结节的良恶性判定，能有效缓解患者等待随访的焦虑情绪，并可早期发现恶性肺结节，让患者及时得到诊治，提高其生存率。

【关键字】肺癌；实性肺结节；焦虑；循环异常细胞；辅助诊断技术

肺癌是全球高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一。GLOBOCAN 2020全球癌症数据显示，肺癌导致的死亡人数估计有179万人，占癌症相关死亡的18.0%，位于全球癌症死亡率的首位[1-2]。据统计，中国肺癌死亡人数占全球肺癌死亡人数的30%，是肺癌死亡率最高的国家之一[3]。2004-2015年，中国男性和女性的肺癌发病率和死亡人数均呈逐年上升趋势[3]。至2015年，肺癌发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的20%和27%，已成为癌症防控的关键问题[4]。在我国，64.6%肺癌患者诊断肺癌时往往为中晚期（Ⅲ~Ⅳ期），5年生存率仅为19.7%[5-6]。“中国肺癌筛查与早诊早治指南”中指出，肺癌患者的生存时间与其临床诊断的时间（早晚期）密切相关[7]。美国国家肺癌筛查试验（National Lung Screening Trial，NLST）结果显示，Ⅰ期肺癌患者被诊断后及时治疗，其10年生存率可高达92%[8-9]。由此可见，提高早期肺癌的筛查和诊断效率，可有效降低肺癌患者的病死率。

临床上将直径＜5mm的结节定位为微小结节，5~10mm的结节定义为小结节，而肺结节最大直径不超过30mm[10]。≤10mm的结节中，实性结节的恶性概率要低于亚实性结节，但恶性实性肺结节的发展与腺癌的侵袭性紧密相关。预后较差的腺泡状、乳头状、微乳头状和实性为主型的腺癌多见影像学表现为直径＞10mm的实性结节[11]。因此，在结节发展成更具侵袭性的亚型前将其诊断并治疗，可降低不良预后的概率。

2011年，NLST研究对比了低剂量螺旋CT（Low-Dose computed tomography，LDCT）和胸片的筛查效能，发现LDCT筛查的肺癌死亡率相对降低了20.0%[9]。2020年，荷兰-比利时随机肺癌筛查试验（NELSON）同样发现，在10年的CT随访后，男性和女性肺癌相关病死率可分别降低26%和39%[12]。LDCT可提早发现肺结节，使患者及时得到临床干预和治疗，有效降低肺癌患者的病死率，因此被推荐用于肺癌高危人群的筛查[10]。但LDCT的假阳性率较高，只有不到0.4%的肺结节最终会被诊断为肺癌[13-15]。如何有效的辨别大量结节的良恶性成为临床医生的难点。临床常用的诊断方法，如PET-CT、穿刺等，均对≤10mm的结节无明显的诊断效果[9, 16-17]。

2010年8月，MD Anderson癌症中心前细胞病理学科室主任、著名病理学教授Ruth Katz在《Clinical Cancer Research》杂志发表文章，发现非小细胞肺癌患者外周血中循环异常细胞（Circulating genetically Abnormal Cell，CAC）数明显高于对照组，CAC与肺癌的发生、发展与预后密切相关[18]。CAC诊断技术由美国MD Anderson癌症中心研发。通过荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）技术对肺癌患者中常见的非整倍体，染色体位点10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29异常的细胞进行鉴定，实现肺结节良恶性辅助诊断[19, 20]。2020年，进一步研究发现，将CAC在肺癌患者、良性结节患者及健康人外周血中的分布特征，与病理结果进行对比，其肺癌诊断敏感度为88.8%，准确率高达94.2%；同时，该长达十年的跟踪研究结果显示，CAC的数量与癌症复发或生存时间减少呈正相关[19]。CAC诊断是一种安全、无创、简便的诊断方式，只需抽取患者10ml的外周血，便能对肺结节的良恶性进行风险分层和肺癌辅助诊断[21]。本研究旨在评估CAC在≤10mm实性结节中的诊断效能。

一、材料与方法

收集了自2019年9月至2020年10月来自全国6家中心（复旦大学附属中山医院、上海胸科医院、广州医科大学第一附属医院、南京中大医院、河南省人民医院和遂宁市中心医院）的34例经CT发现≤10mm实性结节的受试者。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）近5年内无恶性肿瘤史；（3）计划接受肺结节非手术或手术活检，并进行组织病理检测。排除标注：（1）哺乳、妊娠或正准备妊娠的妇女；（2）有严重的心、肺、肝肾功能障碍及精神障碍；（3）既往已接受肺癌相关临床治疗性干预如手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会批准，所有受试者在入组时均签署知情同意书。所有受试者在进行非手术/手术活检前均抽取外周血进行CAC诊断。非手术活检手段包括经胸壁肺穿刺活检纤维支气管镜检查，手术活检主要为胸腔镜。按照美国癌症联合会（American Joint Commission on Cancer，AJCC）和国际抗癌联（International Union Against Cancer，UICC）第8版TNM分期标准对恶性肿瘤进行分期。

1. 标本采集和处理：使用K2 EDTA抗凝管采集受试者10ml外周血。标本采集后，在2小时内加入细胞保存液（珠海圣美生物诊断技术有限公司）对血液样本进行固定。在开始进行实验前，固定后的血液可在室温下保存96小时。首先，采用Ficoll（美国GE Healthcare公司）对单个核细胞（PBMC）进行梯度密度离心。将收集到的PBMC固定到载玻片上，经蛋白酶消化和乙醇梯度脱水杂交前处理。细胞核中的DNA经变性，随后与特制的荧光探针杂交结合，形成“染色体-特定序列探针”复合物。最后，用核酸染料对细胞核进行染色指示完整细胞核型。经处理的样本通过荧光显微镜（Bioview，以色列）扫描，实现对3号染色体与10号染色体数目异常的识别与检测。

2. 统计学方法：应用Medcalc 19.6.4医学统计软件进行统计学处理。临床资料的描述采用均值和百分比，组间比较采用t检验和卡方检验。分别计算诊断工具的灵敏度、特异度、准确度，绘制受试者操作特征（Receiver operating characteristic curve，ROC）曲线，并计算曲线下面积（Area Under Curve，AUC）。

二、结果

1. 患者临床资料分析：组织病理诊断结果显示，34例患者中恶性23例，良性11例。恶性和良性组的吸烟史存在显著差异（P=0.001）,而年龄（P=0.830）、性别（P=0.262）、肿瘤家族史（P=0.217）、结节数量（P=0.666）、结节位于上叶（P=0.279）以及毛刺征（P=0.328）均无统计学差异（见表1）。23例恶性患者中20例为腺癌，小细胞癌和大细胞癌占比分别为1例和2例。

2. 循环异常细胞的诊断效能：约登指数显示，CAC的最佳诊断阈值为3。在此阈值时，CAC在34例患者中良恶性判断的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为78.26%、72.73%、76.47%和0.800（P＜0.001），见图1。同时，以≥3作为阈值，CAC在良性和恶性组中的数量比较，差异有统计学意义（P=0.005），见表1。

图1. 循环异常细胞的ROC曲线图

表1. 入组34例患者的基本特征

3. CAC和肿瘤标志物的诊断效能：选择20例患者进行肺癌肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鳞状上细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、胃泌素释放肽前体（progastrin releasing peptide，ProGRP）以及细胞角蛋白19片段（Cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）5项检查，对比了CAC与单个肿瘤标志物和混合肿瘤标志物（单一标注物阳性则视为阳性）的诊断效能。结果显示，单一肿瘤标志物的敏感度最高的ProGRP为38.46%，最低的CEA和SCC仅为0%。而混合肿瘤标志物的敏感度为46.15%，特异度为85.71%, 准确度为60.00%。而20例患者CAC的敏感度、特异度和准确度分别为76.92%、71.43%和75.00%，优于单一和混合肿瘤标志物的效能（见表2）。

表2. 20例患者CAC和肿瘤标志物诊断效能的比较

注：CEA、SCC、NSE、ProGRP、CYFRA 21-1的正常上限值分别为5ng/ml、1.5ng/ml、16.3ng/ml、65.7pg/ml、3.3ng/ml，超出则定义为阳性，否则为阴性；敏感度、特异度和准确度均分别与其对应检测方法的阳性或阴性标准来计算。

三、讨论

目前，尽管现代医疗水平飞速提高，但肺癌预后仍然较差。基于全球多个国家的癌症预后数据显示，肺癌年龄标准化的5年生存率仅为10%~20%，是预后最差的恶性肿瘤之一[6]。截至2015年，中国癌症中心发布的恶性肿瘤流行病学相关报告指出，中国肺癌的高发病率（57.26/10万）和高死亡率（45.87/10万）提示肺癌仍然是危害人民健康的首要恶性肿瘤[22]。而肺结节的早期发现、良恶性的诊断与积极的健康管理是目前解决困境的有效手段。传统观点认为，亚实性肺结节，尤其是混合性磨玻璃结节，可能需要给予更多的重视[23]。但临床研究结果显示，以磨玻璃为主的肺结节，即使含有少量实性成分，病理类型也多为贴壁型和腺泡型，预后少见复发；反观实性肺结节，侵袭性高，术后复发风险高，且3年复发超过40%，提示实性肺结节若是恶性，则风险可能大于亚实性肺结节[24- 25]。但≤10mm的实性肺结节且无肺癌危险因素者，通常会被建议根据结节大小进行不同程度的CT随访，而不推荐手术治疗[10]。一项针对肺结节≤8mm的患者研究结果显示，当患者知晓自己有肺结节，哪怕是小结节及微小结节，也会出现明显地焦虑，有56.74%的患者为中度及重度焦虑[26]。这种负面情绪直到下次随访被诊断为阴性时可得到缓解，但在此期间可能会造成患者高质量生活水平下降[27-28]。另有调查发现，将近1/3随访患者非常担忧，不满足于2~3年的随访期，想要5年甚至终身随访[29]。频繁的CT随访或将患者暴露在高辐射危害的风险中[30]。穿刺活检等则可能对患者造成心理和身体负担[31]。因此，对于≤10mm的实性肺结节，基于其若是恶性则不容小觑的代价，迫切需要一种无创、有效的辅助诊断技术。

已有研究结果表明，早期肿瘤患者的血液中亦存在CAC，可作肺癌的生物标志物[18-19]。本研究结果提示CAC对早期肺癌诊断具有较高的价值，与其他应用CAC作为肺癌早诊的研究结果相似[16, 21, 32]。我们将对照组定义为病理证实是良性肺结节的患者，可以明确受试者是否存在肺癌，从而更准确的评估CAC检测结果的可靠性。并非所有早期恶性结节都有明显的CT恶性指征，本研究中病理结果明确为恶性的患者中，影像学表现为毛刺征的结节仅占39.1%。如果仅使用影像学作为小结节的诊断依据，可能会造成大量假阴性的结果；而CAC检测阳性（CAC≥3）为18例（78.3%），优于影像学结果（见表1）。CAC可以对细胞中肺癌特异性的染色体10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29异常而进行染色识别，在良性和恶性结节中的分布具有显著差异，可在影像学的基础上增加血液学的诊断依据，有效的辅助临床进行肺结节良恶性判断[32]。

作为无创、且无侵入性的肺结节评估手段，血液学诊断具备安全、无创、无辐射的优势，近年来受到越来越多的研究者的关注[33-34]。然而无论是新型的液体活检如循环肿瘤细胞，还是传统肿瘤标志物（CEA、SCC、NSE、ProGRP和CYFRA21-1），对早期肺结节的良恶性风险分层均无明显价值[32, 35-36]。而≤10mm的实性肺结节诊断对技术敏感度和准确度的要求非常高。为此，我们尝试将5个肿瘤标志物混合进行检测，即1个肿瘤标志物出现阳性则判定为阳性，这确实显著提升了敏感度（46.15%）和准确度（60.00%）。但CAC的敏感度（76.92%）和准确度（75.00%）始终优于单一和混合肿瘤标志物的结果，且ROC曲线下的面积（AUC）可达到0.800，证实了CAC作为早期肺癌血液标志物的有效性。

综上所述，CAC诊断是一种无创性肺癌早检、肺结节良恶性判定的辅助工具，对≤10mm的实性肺结节，具有灵敏度和准确率高的特性。对于肺结节随访人群，可提供一个安全、可靠的无创手段对肺结节进行良恶性分层，及时缓解患者焦虑情绪，缩短潜在恶性微小或小结节的诊断时间，改善患者的预后，同时，CAC与影像学联合使用能进一步提示影像学特征良性肺癌患者的恶性风险，提高肺癌早筛早诊的效率，提高肺结节患者的生活健康质量。

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